Name: analysis of mitochondrial respiratory chain complexes in cultured human cells using blue native polyacrylamide gel electrophoresis and immunoblotting
Uploaded: 2019-02-12T15:00:00
Duration: 7 min 55 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Mitochondrial Respiratory Chain Complexes in Cultured Human Cells using Blue Native Polyacrylamide Gel Electrophoresis and Immunoblotting at JoVE.

感谢赫尔辛基大学图书馆在出版方面提供的财政支持。

本协议基于 hilander 等人的相关出版物。
1. 缓冲液和解决方案的准备
注:表 1汇总了协议中使用的所有缓冲区和解决方案。缓冲区的给定体积足以准备和运行10个示例。所有缓冲器可在 + 4°c 下存储长达一年。
<ol><li>在蒸馏水 (dh2o) 中制备含有 1.5 m 氨基己酸、150 mm 双曲的3x 凝胶缓冲液20毫升。将 ph 值调整为7.0。</li>
	<li>在dh2o 中制备 mm 氨基己酸10毫升。</li>
	<li>结合以下方法制备线粒体缓冲液的1毫升: 3x 凝胶缓冲液 0.5 ml、2m 氨基己酸 0.5 ml 和 500 mm edta 4μl。</li>
	<li>在dh2o.中制备含有 15 mm 双三和 50 mm 的阴极缓冲液, 调整 ph 值至7.0。<ol>
<li>加入0.04 克的 coomassie 蓝色 g-250 至 200 ml 阴极缓冲器, 制备200毫升的蓝色阴极缓冲器。</li>
	</ol>
</li>
	<li>在 dh2o 中制备含有 50 mm bis-tris 的 1, 000 毫升阳极缓冲液, 将 ph 值调整为7.0。</li>
	<li>在 dh2o 中制备含有 750 mm 氨基己酸和5% 库马西蓝 g-250 的样品缓冲液 2.5 ml.</li>
</ol>2. 线粒体裂解物的制备
<ol><li>在收集前一天对单元格进行平板。对于 hek293 或143b 细胞, 使用 dulbecco 的改性鹰培养基 (dmem) 与10% 的胎儿牛血清, 1% l-谷氨酰胺, 100 mgmml 青霉素和 100 mgml 链霉素。在 5% co2 加湿的气氛中, 在 + 37°c 的细胞培养孵化器中生长细胞。确保在收集当天每个样本至少有 500, 000个单元格。</li>
	<li>用冰凉的 pbs 轻轻清洗细胞一次。避免将细胞与板材分离。在 + 4°c 下, 以 800 x g的速度将细胞和颗粒刮伤10分钟。</li>
	<li>用冰凉 pbs 和离心机清洗细胞颗粒两次, 如步骤2.2 所示。用商业试剂盒用布拉德福德方法测量蛋白质浓度。在 + 4°c 下, 以 800 x g的速度将细胞颗粒10分钟。 注: 收集单元格后, 在 + 4°c 下执行所有步骤, 不要产生涡旋。</li>
	<li>在 pbs 20 毫升中加入200μl 的100x 蛋白酶抑制剂, 制备20毫升的 pbs。继续冰上。用蛋白酶抑制剂将 pbs 中的细胞重新移植到最终的蛋白质浓度为 5 mgml。<ol>
<li>要计算 pbs 的体积与蛋白酶抑制剂所需的蛋白酶抑制剂重新悬浮细胞在 5 mgml, 计算每个样本中的蛋白质量。在此计算中, 使用步骤2.3 中测量的蛋白质浓度和步骤2.3 中用于在清洗后重新悬浮细胞的 pbs 体积。</li>
	</ol>
</li>
	<li>用蛋白酶抑制剂在 pbs 中制备 3.3 mm 的数字蛋白1毫升。在 1.65 mm 的最终浓度中加入 3.3 mm 的数字素。混合均匀, 在冰上孵育5分钟。<ol>
<li>在蛋白酶抑制剂中制备 pbs 中 3.3 mm 的1毫升, 在100°c 下将4毫克的数宁溶解在1毫升的 pbs 中, 直到没有沉淀物可见并立即在冰上冷却。在1毫升的数宁溶液中加入10μl 的100x 蛋白酶抑制剂。 注: 只使用一个新的解决方案的数字。 注意: 数字蛋白是有毒的!使用面罩、手套和实验室外套。</li>
	</ol>
</li>
	<li>将 pbs 与蛋白酶抑制剂 (在步骤2.4 中制备) 添加到 1.5 ml 的最终体积中。在 + 4°c 条件下, 以 10, 000 x g 离心10分钟。取出上清液。在这一步中, 线粒体被颗粒状。</li>
	<li>在线粒体缓冲液中重新弹性线粒体颗粒。线粒体缓冲液的体积是步骤2.4 中 pbs 体积的一半。</li>
	<li>在含有蛋白酶抑制剂的 pbs 中制备新鲜的10% 月桂基麦芽苷 (在步骤2.4 中制备)。1毫升足够10个样品。加入10% 的月桂基麦芽苷, 最终浓度为1%。在冰上孵化 15分钟 (此步骤可能长达几个小时)。</li>
	<li>在 + 4°c 条件下 , 以 20, 000 x g 离心20分钟。将上清液收集到一个新的管子中。用试剂盒用布拉德福德方法测量蛋白质浓度。添加样品缓冲器, 该体积是步骤2.8 中使用的月桂基麦芽苷体积的一半。样品可在-80°c 下存储长达6个月。</li>
</ol>3. bn-page 梯度凝胶的制备
<ol><li>在室温下将梯度凝胶倒在 bn-page 中。将梯度制造商放在搅拌板上, 用软管将其连接到蠕动泵上。将带有针头的输液装置连接到导管上。将磁力搅拌器放入梯度搅拌器的近端腔。用dh2o 在最大泵转速下清洗油管10分钟。</li>
	<li>清空管道和梯度制造商。使用一个移液器来删除任何剩余的dh2o 在通道之间的梯度制造商的腔。用阀门关闭通道和管道。</li>
	<li>使用铸造框架和夹具组装两个玻璃板在支架, 有一个孔的底部, 并把它放在支架上。确保它或多或少是在一个有水平衡的直表面上。将针头连接到玻璃板之间的导管上。</li>
	<li>准备6% 和15% 的凝胶溶液 (表 2)。继续冰上。最后加入硫酸铵 (aps) 和四甲基二胺 (temed) (它们开始聚合)。轻轻混合, 以避免产生气泡。</li>
	<li>用6% 的凝胶加载梯度凝胶混合管室的近端, 用15% 的凝胶加载远端。凝胶的总体积应等于玻璃板之间分离凝胶的体积。因此, 使用 2.6 ml 的6% 凝胶和 2.1 ml 的15% 凝胶到梯度凝胶混合器一个8.3 厘米 x 7.3 厘米大小的凝胶。</li>
	<li>打开磁力搅拌器, 打开梯度搅拌器腔之间的油管和通道。立即打开蠕动泵至 5 mlmin, 填充玻璃板, 不允许气泡进入凝胶。当导管中没有凝胶时, 请取出针头。</li>
	<li>用dh2o 轻轻覆盖凝胶, 将凝胶保持在室温下至少1小时进行聚合。</li>
	<li>浇注凝胶后, 立即用dh2o 填充梯度腔, 并以最大速度使用蠕动泵, 冲洗油管。在准备两个或更多的凝胶时, 一定要在两者之间清洗系统。</li>
	<li>将3x 凝胶缓冲液的3毫升混合制备1x 凝胶缓冲液, 用滤纸轻轻从凝胶表面加入6毫升 dh2o.用1x 凝胶缓冲液清洗凝胶表面。用滤纸轻轻取出1x 凝胶缓冲液。<ol>
<li>避免从凝胶上的滤纸纤维。为了确保这一点, 用剪刀把纸剪成小块, 但不要撕破纸。</li>
	</ol>
</li>
	<li>将梳子放在玻璃板之间, 但不要将其完全浸入, 以便能够将堆叠凝胶倒在梳子下。准备4% 的堆叠凝胶 (表 2)。添加 aps 和 temed 最后一次, 因为它们很容易开始聚合。轻轻混合, 避免气泡。</li>
	<li>覆盖堆叠凝胶, 避免梳子下的气泡, 并将梳子完全浸入。让堆叠凝胶聚合至少 30分钟. 取下梳子, 用1x 凝胶缓冲液用管道清洗井。<ol>
<li>聚合后, 凝胶可在 + 4°c 下保存几天。要储存凝胶, 请将凝胶用 dh2o 和塑料薄膜浸泡在纸中, 以防止凝胶干燥。</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. 蓝色原凝胶电泳
注: 为防止 oxphos 复合物的降解, 可在 + 4°c 下进行电泳。使用预冷缓冲液。
<ol><li>用蓝色阴极缓冲器装上凝胶盒, 直到井底。当盒式磁带没有填充到顶部时, 样品的加载会更容易。用蓝色阴极缓冲器清洗井, 然后用管道用蓝色阴极缓冲器灌满井。</li>
	<li>将样品 (5-30 微克的蛋白质) 装入井中。用蓝色阴极缓冲器轻轻地将凝胶盒装满顶部, 用阳极缓冲器轻轻填充罐。</li>
	<li>在 40 v 的恒定电压下运行凝胶15分钟。然后将电压增加到 80 v (或使用 6 ma 的恒流), 不要超过 10 ma。运行凝胶, 直到染料达到凝胶长度的2。</li>
	<li>将蓝色阴极缓冲器更换为阴极缓冲器, 并继续电泳, 直到染料前部耗尽。电泳总共需要3个小时左右。</li>
	<li>采用半干印迹的方法, 回收玻璃板并将蛋白质转移到聚偏氟乙烯 (pvdf) 膜。使用 25 v 的恒压和限制为 1.0 a 的电流30分钟。<ol>
<li>或者, 使用湿印迹将 oxphos 复合物转移到 pvdf 膜。</li>
	</ol>
</li>
	<li>根据标准免疫印迹方案, 继续阻断膜和抗体培养。依次使用主要抗体对抗 oxphos 复合物的亚基。 注: 例如, 使用抗 ndufa9 抗体 (1: 2000) 的复杂 i, 抗 sdha 抗体 (2000年) 的复杂 ii, 抗 uqcr2 抗体 (1:2000) 的复合物 iii, 抗 cox1 抗体 (1: 2000) 的复合体 iv 和抗 at5a 抗体 (1: 2000) 为复杂的 v。抗体的列表在材料表中列出。</li>
</ol>

<ol>
	<li>Osellame, L. D., Blacker, T. S., Duchen, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+and+molecular+mechanisms+of+mitochondrial+function.">Cellular and molecular mechanisms of mitochondrial function.</a> Best Practice, Research. Clinical Endocrinology &amp; Metabolism. 26 (6), 711-723 (2012).</li><li>Jang, J. 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C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aging-induced+alterations+in+gene+transcripts+and+functional+activity+of+mitochondrial+oxidative+phosphorylation+complexes+in+the+heart.">Aging-induced alterations in gene transcripts and functional activity of mitochondrial oxidative phosphorylation complexes in the heart.</a> Mechanisms of Ageing and Development. 129 (6), 304-312 (2008).</li><li>Hilander, T., Konovalova, S., Terzioglu, M., Tyynismaa, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+Mitochondrial+Protein+Synthesis:+De+Novo+Translation,+Steady-State+Levels,+and+Assembled+OXPHOS+Complexes.">Analysis of Mitochondrial Protein Synthesis: De Novo Translation, Steady-State Levels, and Assembled OXPHOS Complexes.</a> Current Protocols In Toxicology. , e56 (2018).</li><li>Lobo-Jarne, T., Ugalde, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Respiratory+chain+supercomplexes:+Structures,+function+and+biogenesis.">Respiratory chain supercomplexes: Structures, function and biogenesis.</a> Seminars in Cell &amp; Developmental Biology. 76, 179-190 (2018).</li><li>Fiala, G., Schamel, W. 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T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+a+quantitative+quadruple+immunofluorescent+assay+to+diagnose+isolated+mitochondrial+Complex+I+deficiency.">Using a quantitative quadruple immunofluorescent assay to diagnose isolated mitochondrial Complex I deficiency.</a> Scientific Reports. 7 (1), (2017).</li></ol>

未申报利益冲突。

该协议最关键的部分之一是在样品制备、储存和凝胶电泳过程中保持完整的 oxphos 复合物。因此, 线粒体应在 + 4°c 时分离, 样品不应经历冻融循环。oxphos 配合物在整个过程中只能承受一个冻融循环。多个冻融循环破坏 oxphos 复合物 (图 1 b)。要比较的控制和实验样本应同时准备, 以避免储存条件的任何差异, 这可能会产生误导的结果。如果不可能与所有样品并行执行协议的所有步骤, 我们建议将清洗过的细胞颗粒冻结在-80°c (本协议中的步骤 1.4), 然后至少对所有样品进行协议的其余部分, 直到凝胶营养病。应特别注意电泳装置 (储罐、盒式磁带) 的清洁度。如果 sds-page 使用相同的设备, 请在 bn-page 之前非常好地清洗它。任何残留的 sds 都会在电泳过程中导致 oxphos 配合物的离解。
高质量的梯度凝胶是协议的另一个关键部分。用于蓝色原生 page 的预制凝胶可在市场上买到;但是, 不建议使用它们, 因为用于商业凝胶的缓冲区可能具有与示例缓冲区不同的组合。这里使用的凝胶梯度 (6-15) 是分离单个 oxphos 复合物的最佳选择。为了检测 oxphos (也称为呼吸链超复合物14) 的高阶超分子结构, 需要进行一些优化。
对于 oxphos 复合物的可视化, 根据其特性, 按顺序使用特定抗体。例如, 首先使用给出最弱信号的抗体, 最后使用信号最强的抗体。这一点很重要, 因为剥离会削弱检测 (图 1d)。如果 bn-page 之后凝胶受到二维 sds-page 15 的影响, 则可以研究呼吸链复合物的组成.
这里描述的协议建议对单个 oxphos 复合物依次使用抗体。然而, 市售的 oxphos 抗体鸡尾酒可用于同时检测所有五种 oxphos 复合物。然而, 为了能够检测到不完全组装的 oxphos 复合物并确定其同一性, 应按顺序使用针对单个 oxphos 复合物的抗体。此步骤非常耗时;然而, 它可能是测试新的实验条件和模型的必要条件。
用于线粒体分离的数字素浓度应针对特定细胞类型进行优化。作为洗涤剂, 数字素对细胞膜具有渗透性。数字蛋白的最佳浓度有效地渗透细胞的质膜, 使线粒体膜保持完整。过高的超位素浓度会导致线粒体提取物的高污染, 而过高的浓度会损害线粒体膜, 并降低线粒体的总产量。最佳的数蛋白比 (g/g) 从0.3 到1不等。西方对从颗粒和上清液中提取的蛋白质进行印迹分析, 可用于检测数字蛋白16的最佳浓度。
该方案不包括免疫印迹的蛋白质负载控制;因此, 提取的复合物的蛋白质浓度应仔细测量至少在三元组, 以确保相等的负荷。此外, 还可以在复制的 bn-page 中运行示例。如果选择性 oxphos 配合物的组装受到损害, 未受影响的配合物可以作为加载控制。
对 bn-page 中蛋白质复合物分子质量的估计具有挑战性18。目前的协议不包括分子量标记;因此, 为了估计 oxphos 复合物的组装, 应始终将含有未受影响的复合物的控制样本纳入分析。bn-page 的对照样本通常是未经处理或野生类型的细胞。
本文提出的检测线粒体呼吸链复合物的方法进行了优化;然而, 它也可用于线粒体蛋白的低聚评价 19.此外, 通过先用氯霉素消耗含有复合物的线粒体编码亚基, 然后在去除氯霉素10后进行回收, 可以研究 oxphos 配合物的组装率。因此, bn-page 可用于评估 oxphos 的稳态水平和组装, 用于不同的应用, 包括人类线粒体疾病的分子诊断9,11。

线粒体是一种多功能细胞器, 在能量产生、调节细胞代谢、信号转导、凋亡、衰老等方面发挥着重要作用。线粒体的能量产生依赖于将呼吸与 atp 合成结合的氧化磷酸化功能。在人体细胞中, 线粒体氧化磷酸化系统 (oxphos) 由五个复合物组成。复合物 i-iv 在线粒体膜间空间中创建一个电化学质子梯度, 由复合体 v 用于产生 atp。每个 oxphos 复合体都是多色的, 除了复合体 ii 外, 由核基因和线粒体基因编码的亚基组成。oxphos 复合物的核心成分中的任何缺陷都会引起突变或环境压力, 从而干扰氧化磷酸化系统的组装和功能。此外, 功能 oxphos 复合物的正确组装需要大量的装配因子4、5、6。
蓝色原生聚丙烯酰胺凝胶电泳 (bn-page) 是一项基本技术, 能够分析完整的蛋白质复合物, 并可用于研究 oxphos 复合物的组装。首先, 线粒体是通过数字素从细胞中分离出来的, 一种温和的洗涤剂, 能渗透细胞的质膜。然后, 通过使用月桂基麦芽苷, oxphos 配合物从线粒体膜中释放出来。利用梯度凝胶电泳, 根据 oxphos 配合物的质量对其进行分离。coomassie 蓝色的 g-250 (而不是 r-250) 添加到样品缓冲液和蓝色阴极缓冲液中, 使洗涤剂不稳定的关联, 但保持单个呼吸链复合物完整8。在电泳过程中, 含染料的蓝色阴极缓冲液被无染料的阴极缓冲液所取代, 从而确保了 oxphos 配合物有效地转移到 pvdf 膜8。为了可视化 oxphos 复合物, pvdf 膜按顺序与五个 oxphos 配合物的选定亚基相对应的抗体孵育。
这里描述的方法, 经过一些修改, 可以应用于任何培养的细胞。此外, 该方法还可用于分析从组织样本9中分离出的线粒体中的 oxphos 复合物.bn-page 每次运行至少需要5-10 微克的线粒体。使用这里描述的方法, 500, 000个培养细胞, 如 hek293、sh-sy5y 或143b 细胞, 可以产生约10微克的线粒体。但是, 用于 bn 分析的足够数量的单元格取决于特定的细胞类型。
研究线粒体 oxphos 蛋白最常用的方法是 sds-page 和西方印迹。但是, sds-page 只允许研究单个 oxphos 子单元, 与 bn-page 不同的是, 不能用于评估整个 oxphos 复合体的组装。在没有负电荷染料存在的情况下, 清除本机页分离蛋白质复合物, 其分辨率明显低于 bn-page。然而, 清晰的本机页比 bn-page 温和, 因此它可以保留蛋白质复合物的不稳定的超分子组合, 如在 bn-page 条件下离解的 oxphos 超复合物。在该协议中, 梯度凝胶用于分离复合物;但是, 或者, 如果相对昂贵的梯度制造商不可用, 则可以使用非梯度分离 11。
重要的是, 此处描述的方法允许分析 oxphos 复合物的组装, 而不评估复合物的功能。采用高分辨率 bn-page, 然后通过凝胶活性测定11以及线粒体复合物12的分光光度酶活性测定, 是对 oxphos 复合物进行功能分析的有效技术.然而, 这两种方法都不能测定 oxphos 复合物的组装。
因此, bn-page 是研究单个 oxphos 复合物组装的最佳方法。例如, 一些线粒体疾病, 如 leber 遗传性视神经病变 (lhon)、线粒体脑病和乳酸酸中毒和中风样发作 (melas), 与 oxphos 的一个或多个成分组装改变有关系统5。利用本文介绍的 bn-page 方法, 可以研究线粒体疾病的分子机制。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:693px;" width="693">
	<tbody>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:316px;">100 mm cell plates</td>
			<td style="width:97px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:111px;">130182</td>
			<td style="width:169px;"></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">40% Acrylamide/Bis 37.5:1</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>161-0148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Aminocaproic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A2504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Ammonium persulfate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A3678</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Anti-ATP5A</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>14748</td>
			<td>Complex V subunit</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Anti-MTCOI</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>14705</td>
			<td>Complex VI subunit</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Anti-NDUFA9</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>14713</td>
			<td>Complex I subunit</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Anti-SDHA</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>14715</td>
			<td>Complex II subunit</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Anti-UQCRC2</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>14745</td>
			<td>Complex III subunit</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Bis-tris</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B7535</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Bradford protein assay kit</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>5000006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Cell scrapers</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>11597692</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Coomassie blue G250 (Serva Blue G)</td>
			<td>Serva</td>
			<td>35050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Digitonin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">DMEM</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>12-614F/12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">EDTA</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15575-038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">FBS</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10270106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Fetal bovine serum</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10270106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Glycerol</td>
			<td>(Sigma</td>
			<td>G5516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Gradient maker</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1654120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Lauryl maltoside (n-Dodecyl &#946;-D-maltoside)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D4641</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">L-glutamine</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>25030024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">L-glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">N,N,N&#8242;,N&#8242;-Tetramethylethylenediamine (TEMED)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T9281</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">PBS</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>BE17-516F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>17-602E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Penicillin/streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Power supply</td>
			<td>GE Healthcare&#160;</td>
			<td>EPS 301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Protease inhibitors</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>10137963</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Trans-blot turbo mini PVDF</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1704156</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Tricine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T9784</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Trypsin-EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15400054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Vertical electrophoresis apparatus</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1658004</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of mitochondrial respiratory chain complexes in cultured human cells using blue native polyacrylamide gel electrophoresis and immunoblotting

线粒体呼吸是由线粒体内的氧化磷酸化 (oxphos) 复合物进行的。内部和环境因素会干扰 oxphos 配合物的组装和稳定性。该协议描述了用蓝色原代聚丙烯酰胺凝胶电泳 (bn-page) 分析线粒体呼吸链复合物在培养的人体细胞中的应用。首先, 线粒体是用数字素从细胞中提取的, 然后使用月桂基麦芽苷, 完整的 oxphos 复合物从线粒体膜中分离出来。然后在负电荷染料 Coomassie 存在的情况下, 通过梯度凝胶电泳来解析 oxphos 复合物, 该染料可防止蛋白质聚集, 并确保蛋白质配合物向阴极的电泳迁移。最后, 用标准免疫印迹法检测 oxphos 复合物。因此, bn-page 是一种方便且廉价的技术, 可用于评估整个 oxphos 复合物的组装, 而基本的 sds-page 只允许对单个 oxphos 复合体进行研究。

利用 bn-page 可以研究线粒体 oxphos 复合物组装过程中的缺陷。图 11a显示了用氯霉素处理的人神经母细胞瘤细胞 (sh-sy5y) 中呼吸链复合物的组装, 这专门抑制了 mtdna 编码的 oxphos 亚基的翻译。氯霉素耗尽了含有线粒体编码亚基 (复合体 i、iii、iv;图 11a), 而复合 ii, 完全由核基因编码, 被补偿地 u报销。复杂 v 没有在这里被免疫印迹。
多个冻融循环破坏 oxphos 复合物。图 11b显示了 oxphos 配合物在冻融循环中的降解。在经历过多次冻融循环的样本3中, 线粒体呼吸复合物具有较低的带强度, 与相同的样本相比, 它们只被冷冻一次。图 1 中的未裁剪的西方印迹图像如补充图 1所示。
凝胶的质量对于锐利和清晰的带非常重要。图 11c显示了一种没有很好聚合的凝胶的免疫印迹。膜剥离也会影响 oxphos 复合物的检测。在图 1d 中, 在剥离之前或之后检测到复杂 i。剥离后的信噪比要低得多。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59269/59269fig1.jpg"> 图 11. bn-page 免疫细胞来自成功和次优实验.(a)线粒体翻译抑制剂使 oxphos 复合物枯竭。用氯霉素 (cap) 治疗人神经母细胞瘤 (sh-sy5y) 48小时。ctrl, 控制细胞, 不含氯霉素处理。下面的面板显示免疫印迹的定量。控件的值被视为 1 (显示为虚线)。数据以平均值±sdd、n = 3、* p < 0.0001 表示, 而使用未配对学生的 t 测试进行控制。(b)多个冻融循环破坏 oxphos 配合物。在相同条件下, 从人类骨肉瘤细胞 (143b) 中制备了样本1-3。第1和2号样品只被冷冻和融化一次, 而3号样本则经过了四次冻融循环。(c)从 hek293 细胞中分离出的 oxphos 复合物的 bn-page 免疫细胞。带的涂抹是由于凝胶质量低造成的。(d)剥离对 oxphos 复合物检测的影响。在剥离同一膜之前和之后检测人神经母细胞瘤细胞 (sh-sy5y) 中的复合 i。采用抗 ndufa9 抗体 (复合体 i)、抗 sdha 抗体 (复合物 ii)、抗 uqcrc2 抗体 (复合体 iii) 和抗 cox1 抗体 (复合体 iv) 检测 oxphos 复合物。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59269/59269fig1large.jpg" target="_blank">请点击这里查看此图的较大版本.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>缓冲器或解决方案</td>
			<td>组成</td>
			<td>食谱</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="4">3 x 凝胶缓冲液</td>
			<td>1.5 m 氨基己酸</td>
			<td>3.94 克氨基己酸</td>
		</tr>
<tr>
<td>150毫米比斯特里斯</td>
			<td>0.63 克的比斯特里斯</td>
		</tr>
<tr>
<td>dh2o</td>
			<td>将 dh2o添加到20毫升</td>
		</tr>
<tr>
<td>ph 7。0</td>
			<td>调整 ph 值为7。0</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="4">阴极缓冲器</td>
			<td>15 mm bistris</td>
			<td>3.14 克 bistris</td>
		</tr>
<tr>
<td>50 mm 旋毛</td>
			<td>8.96 克滴虫</td>
		</tr>
<tr>
<td>dh2o</td>
			<td>添加 dh2o 至 1000 ml</td>
		</tr>
<tr>
<td>ph 7。0</td>
			<td>调整 ph 值为7。0</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="5">蓝色阴极缓冲器</td>
			<td>0.02% coomassie blue g</td>
			<td>0.04 克伺服蓝 g</td>
		</tr>
<tr>
<td>15 mm bistris</td>
			<td rowspan="4">阴极缓冲器200毫升</td>
		</tr>
<tr>
<td>50 mm 旋毛</td>
		</tr>
<tr>
<td>dh2o</td>
		</tr>
<tr>
<td>ph 7。0</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="3">阳极缓冲液</td>
			<td>50毫米比斯特里斯</td>
			<td>20.93 克</td>
		</tr>
<tr>
<td>dh2o</td>
			<td>添加 dh2 o 到2000 ml</td>
		</tr>
<tr>
<td>ph 7。0</td>
			<td>调整 ph 值为7。0</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="5">线粒体缓冲液</td>
			<td>1.75 m 氨基己酸</td>
			<td>0.5 ml 的 3 x 凝胶缓冲液</td>
		</tr>
<tr>
<td>75毫米比斯特里斯</td>
			<td>2 m 氨基己酸0.5 毫升</td>
		</tr>
<tr>
<td>2 mm edta</td>
			<td>4μl 500 mm edta</td>
		</tr>
<tr>
<td>dh2o</td>
			<td>-</td>
		</tr>
<tr>
<td>ph 7。0</td>
			<td>-</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="3">样品缓冲器</td>
			<td>750 mm 氨基己酸</td>
			<td>0.2 氨基己酸0.94 毫升</td>
		</tr>
<tr>
<td>5% 昏迷蓝色 g</td>
			<td>0.125 克伺服蓝 g</td>
		</tr>
<tr>
<td>dh2o</td>
			<td>添加 dh2o至 2.5 ml</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">2m 氨基己酸</td>
			<td>2m 氨基己酸</td>
			<td>2.62 克氨基己酸</td>
		</tr>
<tr>
<td>dh2o</td>
			<td>将 dh2o 添加到 10 ml</td>
		</tr>
</tbody></table>表1。用于 bn-page 的缓冲器和解决方案。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>蓝色原生凝胶</td>
			<td>分离6% 凝胶</td>
			<td>分离15% 凝胶</td>
			<td>堆叠4% 凝胶</td>
		</tr>
<tr>
<td>3 x 凝胶缓冲液</td>
			<td>3.3 毫升</td>
			<td>3.3 毫升</td>
			<td>1.64 毫升</td>
		</tr>
<tr>
<td>40% 丙烯酰胺</td>
			<td>1.5 毫升</td>
			<td>3.75 毫升</td>
			<td>0.5 毫升</td>
		</tr>
<tr>
<td>dh2o</td>
			<td>5.14 毫升</td>
			<td>0.93 毫升</td>
			<td>2.77 毫升</td>
		</tr>
<tr>
<td>甘油</td>
			<td>0</td>
			<td>2毫升</td>
			<td>0</td>
		</tr>
<tr>
<td>10% 过硫酸铵 *</td>
			<td>60μl</td>
			<td>10μl</td>
			<td>60μl</td>
		</tr>
<tr>
<td>temed</td>
			<td>4μl</td>
			<td>2μl</td>
			<td>6μl</td>
		</tr>
<tr>
<td>总成交量</td>
			<td>10毫升</td>
			<td>10毫升</td>
			<td>5毫升</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="4">* 在 dh2o 中始终使新鲜10% 过硫酸铵</td>
		</tr>
</tbody></table>表2。bn-page 凝胶配方。
补充说明图 11. 图 1 b 中未裁剪的西方印迹 图像.<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59269/Supplementary_figure_1.eps" target="_blank">请点击此处下载此图.</a>

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Analysis of Mitochondrial Respiratory Chain Complexes in Cultured Human Cells using Blue Native Polyacrylamide Gel Electrophoresis and Immunoblotting

蓝色原代聚丙烯酰胺凝胶电泳免疫印迹法诱导人细胞线粒体呼吸链配合物的分析

该方案通过蓝色原生聚丙烯酰胺凝胶电泳对线粒体呼吸链配合物进行了分析。这里介绍了应用于培养的人体细胞的方法。

Mitochondrial respiration is performed by oxidative phosphorylation (OXPHOS) complexes within mitochondria. Internal and environmental factors can perturb ...

蓝色原生聚丙烯酰胺凝胶电泳允许分析线粒体氧化磷酸化系统的触觉复合物。它是一种方便、廉价的技术，可用于覆盖线粒体氧化磷酸化系统整个复合物的组装。要准备线粒体解酸，首先使用冰冷的PBS溶液轻轻清洗细胞一次。刮取细胞，在800摄氏度下在4摄氏度下进行颗粒，10分钟。然后，用冰冷的PBS清洗细胞颗粒两次，在800G的4摄氏度下离心10分钟。接下来，在20毫升PBS中加入200微升100倍蛋白酶抑制剂。将PBS蛋白酶抑制剂混合物中的细胞重新悬浮到每毫升5毫克的最终蛋白质浓度。要用蛋白酶抑制剂在PBS中准备3.3毫摩尔比诺宁，在100摄氏度的PBS中溶解4毫克的位杨素，直到看不到沉淀物。立即在冰上冷却，在1毫升的位丁宁溶液中加入10微升100倍蛋白酶抑制剂。接下来，在最终浓度为1.65毫摩尔时，将数字素蛋白酶抑制剂混合物加入细胞中。混合好，在冰上孵育五分钟。然后，将PBS蛋白酶抑制剂混合物加入到1.5毫升的最终体积中。在10，000G的4摄氏度下离心10分钟。去除上流剂，在线粒体缓冲液中重新悬浮线粒。在PBS抑制剂溶液中准备一毫升新鲜10%的露体安装。在冰上1%的孵育最后浓度为1%的线粒体中加入10%的洛雷亚尔，至少15分钟。在20，000G的4摄氏度下离心20分钟。将上流液收集到新管中，然后添加样品缓冲液。要为蓝色原生页面准备梯度凝胶，请先将梯度制造者放在搅拌板上，然后用柔性油管将其连接到近位泵。将带针的输液装置连接到管子上。将磁搅拌器放入梯度制造商的近端室，以最大泵速用蒸馏水清洗油管 10 分钟。接下来，清空油管和梯度制造商。使用移液器去除梯度制造者腔室之间的通道中残留的蒸馏水。用阀门关闭通道和油管。将两个玻璃板组装在支架上，并放在支架上。使用凝胶支架底部的孔，将针头连接到玻璃板之间的管子上。要制作 8.3 7.3 厘米凝胶，请先准备 6% 和 15% 凝胶溶液，并把它们放在冰上。轻轻混合，避免产生气泡。然后，用 6% 凝胶的 2.6 毫升和 15% 凝胶的 2.1 毫升重装 2.6 毫升的梯度凝胶搅拌管室的近端。接下来，打开磁力搅拌器，打开管道和梯度制造者腔室之间的通道。立即将近光泵打开至每分钟五毫升。当管子中没有凝胶时，填充玻璃板并取出针头。用蒸馏水轻轻覆盖凝胶，将凝胶保持室温至少一小时。立即用蒸馏水填充梯度室，并使用近光泵以最大速度清洗管子。将六毫升蒸馏水加入三毫升的3倍凝胶缓冲液中，制作1x凝胶缓冲液。用滤纸轻轻去除凝胶表面的蒸馏水。用 1x 凝胶缓冲液清洗凝胶表面，然后用滤纸轻轻取出缓冲液。根据手稿准备 4% 堆叠凝胶。轻轻混合以避免产生气泡。然后，将梳子放在玻璃板之间，将堆叠凝胶倒入梳子下。将梳子完全浸。让堆叠凝胶聚合至少 30 分钟。然后，拆下梳子并使用移液器用 1x 凝胶缓冲液清洗孔。要执行蓝色原生凝胶电泳，首先将蓝色阴极缓冲液添加到凝胶盒中。使用移液器用蓝色阴极缓冲液清洗和填充孔。然后，将5至30微克蛋白质样品加载到井中。用蓝色阴极缓冲液轻轻填充凝胶盒到顶部，用阳极缓冲器将罐体填充。首先，以 40 伏的恒定电压运行凝胶 15 分钟。然后，将电压增加至 80 伏。运行凝胶，直到染料达到凝胶长度的2/3。用阴极缓冲液更换蓝色阴极缓冲液，并继续电泳，直到染料前部从凝胶上脱落。取回玻璃板，通过半干印迹将蛋白质转移到PVDF膜上。使用 25 伏的恒定电压和限制为 1 安培的电流 30 分钟。与无需治疗的对照细胞相比，在氯霉素治疗后抑制了人类神经母细胞细胞中呼吸链复合物的组装。相比之下，由核基因编码的复合物受到向上调节。在多个冷冻-解冻周期中观察到氧化磷酸化复合物的降解。凝胶的质量会影响氧化磷酸化复合物的检测。此外，剥离膜降低了信噪比。执行该过程时，重要的是要记住在寒冷条件下进行简单的制备和凝胶电泳，以保留在触觉中的 OXPHOS 复合物。继蓝色原生页面之后，第二维SDS页面可以应用于研究呼吸链复合物的蛋白质亚单位。蓝色原生页面允许研究人员研究氧化磷酸化系统的复合物甚至超复合物的组装。

Research

JoVE Journal

Biology

Denaturing Gradient Gel Electrophoresis (DGGE)

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科研

生物学

Probing for Mitochondrial Complex Activity in Human Embryonic Stem Cells

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Silencing of BRCA2 to Identify Novel BRCA2-regulated Biological Functions in Cultured Human Cells

沉默<em&gt; BRCA2</em&gt;以确定新的BRCA2调控的生物学功能在人体细胞培养

Silencing of the tumor suppressor protein BRCA2 and its detection by conventional biochemical analyses represent a great technical challenge owing to the ...

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