Name: analysis of mitochondrial respiratory chain complexes in cultured human cells using blue native polyacrylamide gel electrophoresis and immunoblotting
Uploaded: 2019-02-12T15:00:00
Duration: 7 min 55 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Mitochondrial Respiratory Chain Complexes in Cultured Human Cells using Blue Native Polyacrylamide Gel Electrophoresis and Immunoblotting at JoVE.

ヘルシンキ大学図書館は出版の支援に感謝しました。

spaNOTE: このプロトコルは Hilander ら13によって関連付けられている文書に基づいています。
1 バッファーおよび解決の準備
注: すべてのバッファーとプロトコルで使用されるソリューションを表 1にまとめます。バッファーの指定されたボリュームは、準備し、10 個のサンプルを実行するための十分です。すべてのバッファーは、+4 ° C で 1 年間保存できます。
<ol><li>1.5 M アミノカプロン酸、150 mM 蒸留水 (dH2O) で Bis トリスを含むゲル バッファー x 3 の 20 の mL を準備します。7.0 に pH を調整します。</li>
	<li>DH2o ・ 2 M アミノカプロン酸 10 mL を準備します。</li>
	<li>次を組み合わせることによりミトコンドリアのバッファーの 1 つの mL を準備: ゲルのバッファー、2 M アミノカプロン酸 0.5 mL、500 ミリメートルの EDTA の 4 μ L x 3 の 0.5 mL。</li>
	<li>1,000 mL の 15 mM ビス トリス、dH2O. 調整 pH 7.0 のトリシンの 50 mM を含む陰極バッファーを準備します。<ol>
<li>青い Coomassie G-250 の 0.04 g を 200 mL の陰極バッファーに追加することで 200 mL の青い陰極バッファーを準備します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>1,000 mL の 50 mM ビス トリス dH2O. 調整 pH 7.0 を含む陽極バッファーを準備します。</li>
	<li>2.5 ml 5% ブルー 750 mM アミノカプロン酸を含むサンプル バッファーの dH2O. G-250</li>
</ol>2. ミトコンドリア lysates の準備
<ol><li>セルをコレクション前日プレートします。143B または HEK293 細胞使用ダルベッコは 10% 牛胎児血清 1 %l-グルタミン 100 mg/mL ペニシリンとストレプトマイシン 100 mg/mL イーグル培地 (DMEM) を変更しました。37 ° c 5% CO2加湿雰囲気で細胞文化のインキュベーターで細胞を成長します。コレクションの日に各サンプルのために少なくとも 500,000 のセルがあることを確認します。</li>
	<li>一度氷冷 PBS のセルは水洗い。プレートから細胞をデタッチしないでください。細胞をこすりし、+4 ° c. で 10 分の 800 x gでそれらをペレット</li>
	<li>氷冷 PBS で 2 回細胞ペレットを洗浄し、ステップ 2.2 のように遠心分離機します。市販キットを用いたブラッドフォード法によるタンパク質の濃度を測定します。+4 ° c. で 10 分の 800 x gで細胞をペレットします。 注: セルのコレクションの後 +4 ° C ですべての手順を実行し、ボルテックスにかけないでください。</li>
	<li>20 mL の PBS に 100 x プロテアーゼ ・ インヒビターの 200 μ L を追加することでプロテアーゼ阻害剤を 20 mL の PBS を準備します。氷の上を保ちます。最終的なタンパク質濃度 5 mg/mL のプロテアーゼ阻害剤と PBS で細胞を再懸濁します。<ol>
<li>5 mg/mL で細胞を再懸濁しますに必要なプロテアーゼ阻害剤と PBS のボリュームを計算するためには、各サンプルの蛋白質の量を計算します。この計算手順 2.3、2.3 の手順で洗浄後、細胞を再懸濁すため PBS のボリュームでタンパク質濃度を使用します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>プロテアーゼ阻害剤と PBS の 3.3 mM ジギトニンの 1 mL を準備します。1.65 mM の最終的な集中に 3.3 mM ジギトニンを追加します。よく混ぜ、氷上で 5 分間インキュベートします。<ol>
<li>プロテアーゼ阻害剤と PBS の 3.3 mM ジギトニンの 1 mL を準備するには、沈殿物、されるまでは表示とクールな氷の上すぐに 100 ° C で 1 mL の PBS のジギトニン 4 mg を溶解します。ジギトニン溶液 1 mL に 100 x プロテアーゼ ・ インヒビターの 10 μ L を追加します。 注: は、ジギトニンの新鮮なソリューションのみを使用します。 注意: ジギトニンは有害です!フェイス マスク、手袋、白衣を使用します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>プロティナーゼの抑制剤 (2.4 の手順で準備) を持つ PBS を 1.5 mL の最終巻に追加します。10 分間、10,000 × g で遠心分離 + 4 ° C上澄みを除去します。この手順では、ミトコンドリアをペレットします。</li>
	<li>ミトコンドリアのバッファーでミトコンドリアのペレットを再懸濁します。ミトコンドリアのバッファーのボリュームは、2.4 の手順で PBS のボリュームの半分です。</li>
	<li>(2.4 の手順で準備) プロテアーゼ阻害剤を含む PBS で新鮮な 10% ラウリル maltoside を準備します。1 mL は、10 個のサンプルに対して十分です。最終濃度 1% に 10% ラウリル maltoside を追加します。(このステップは幾つかの時間まで長くすることができます) 15 分間氷の上を孵化させなさい。</li>
	<li>20,000 x gで 20 分間遠心 + 4 ° C上清を新しいチューブに収集します。キットを使用してブラッドフォード法によるタンパク質の濃度を測定します。サンプル バッファー、ラウリル maltoside ステップ 2.8 で使用量の半分のボリュームを追加します。サンプルは、最大 6 ヶ月間-80 ° C で保存できます。</li>
</ol>3. BN ページの勾配ゲルの調製
<ol><li>室温で BN ページのグラデーションのゲルを注ぎなさい。撹拌プレート上グラデーション メーカーを置き、蠕動ポンプにフレキシブル チューブを接続します。注入チューブ針セットを接続します。グラデーションのメーカーの近位チャンバー内に磁性攪拌器を配置します。10 分間最大ポンプ速度で dH2O とチューブを洗浄します。</li>
	<li>空のチューブとグラデーションのメーカー。ピペットを使いを使用すると、グラデーションのメーカーのチャンバー間のチャネルに、残った dH2O を削除します。チャネルとバルブとチューブを閉じます。</li>
	<li>鋳枠とクランプを使用して底面の穴には、ホルダーに 2 枚のガラス板を組み立てるし、スタンドの上に置きます。もっとまたはより少なく水収支とストレート表面にあることを確認します。針の場所は、ガラス板との間のチューブに接続されています。</li>
	<li>6% と 15% のゲル ソリューション (表 2) を準備します。氷の上を保ちます。過硫酸アンモニウム (AP) と tetramethylenediamine (TEMED) (重合開始) 追加最後。優しく空気を避けるためにミックスを泡します。</li>
	<li>6% ゲルでグラデーション ジェル ミキサー チューブ室の近位端と遠位端 15% ゲルでをロードします。ゲルの総量は、ガラス板との間の分離ゲルの体積に等しいはずです。したがって、1 つ 8.3 × 7.3 cm サイズのゲルの 6% ゲルの勾配ゲル ミキサーに 15% ゲルの 2.1 mL 2.6 mL を使用します。</li>
	<li>磁性攪拌器、スイッチ、チューブとグラデーションのメーカーのチャンバー間のチャネルを開きます。蠕動性ポンプ スイッチ 5 mL/分をすぐにガラス板を記入し、泡ゲルを入力するを許可しません。チューブにゲルがないときは、針を抜きます。</li>
	<li>優しく dH2O を保つ重合のために少なくとも 1 時間室温でゲル ゲルをオーバーレイします。</li>
	<li>ゲルを注入後すぐにチューブを洗浄によって dH2O でグラデーションの部屋を充填し、最大速度で蠕動ポンプを使用して。2、多くのゲルを準備しているときの間システム常に清潔します。</li>
	<li>ゲルのバッファー x 3 の 3 mL を混合することによって 1 x ゲルのバッファーを準備し、優しくろ紙をゲルの表面から dH2O を削除 dH2O の 6 mL を追加します。ゲルのバッファー x 1 とゲルの表面を洗います。優しくろ紙をゲル バッファー × 1 を削除します。<ol>
<li>ゲルのフィルター ペーパーからの繊維は避けてください。そのためには、一個に、はさみで紙を切って、紙の涙をしません。</li>
	</ol>
</li>
	<li>ガラス プレートの間櫛が櫛の下でスタッキングのゲルを注ぐことができる完全に入れないでください。スタッキングのゲル (表 2) 4% を準備します。TEMED と AP を追加最後に彼らは簡単に重合を開始します。軽く回避の空気の泡を混ぜます。</li>
	<li>櫛の下で泡を避け、スタッキングのゲルをオーバーレイし、櫛を完全に浸します。Let スタッキングのゲル重合櫛を取除き、ピペットを使用してゲル バッファー x 1 と井戸を洗浄する少なくとも 30 分のため。<ol>
<li>重合後ゲルは +4 ° C で数日間保存できます。DH2O およびプラスチックを浸した紙で包んでゲルにゲルを保存フィルム、ゲルの乾燥を防ぐ。</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. ブルー ネイティブ電気泳
注: OXPHOS の劣化を防ぐために複合体を実行電気泳動 +4 ° C で中古冷蔵バッファーを使用します。
<ol><li>井戸の底まで青い陰極バッファーのゲル カセットをロードします。サンプルの読み込みは、カセットがない上にいっぱいになる簡単です。青い陰極バッファーと井戸を洗い、ピペットを使用して青い陰極バッファーで井戸を埋めます。</li>
	<li>井戸にサンプル (蛋白質の 5-30 μ g) をロードします。優しく青い陰極バッファーと陽極バッファーとタンク上部にゲル カセットを入力します。</li>
	<li>40 V の定電圧で 15 分のためのゲルを実行します。80 V に電圧を増やして (6 の定電流を使用してまたは mA)、10 を超えないように mA。染料 2/3 ゲルの長さに達するまでは、ゲルを実行します。</li>
	<li>陰極バッファーと青い陰極バッファーを交換し、色素フロントがなくなるまで電気泳動を続けます。合計では、電気泳動は約 3 時間かかります。</li>
	<li>ガラス板を取得し、半乾燥しみが付くことにより、ポリフッ化ビニリデン (PVDF) 膜に蛋白質を転送します。定電圧 25 V ・電流 1.0 A で 30 分間に制限を使用します。<ol>
<li>また、濡れたしみが付くことを使用して OXPHOS 錯体を PVDF 膜に転送。</li>
	</ol>
</li>
	<li>標準的な免疫ブロット プロトコルに従って膜と抗体の孵化のブロックに進みます。OXPHOS 複合体のサブユニットに対して一次抗体を順番に使用します。 注: たとえば、複雑な抗 NDUFA9 抗体 (配分) を使用して私は、抗 UQCRC2 抗体 (1: 1000) 複合体 III、複合体 IV および抗 ATP5A 抗体 (配分) 複雑な V のための反 COX1 抗体 (配分) の複合体 II のアンチ SDHA 抗体 (配分)。抗体のリストは、テーブルの材料にされます。</li>
</ol>

<ol>
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利害の対立が宣言されていません。

サンプル準備、記憶の中にそのまま OXPHOS 錯体を保持し、ゲルの電気泳動プロトコルの最も重要な部分の 1 つです。したがって、ミトコンドリアは +4 ° C で分離する必要があります、サンプルの凍結融解を受けるしないでください。OXPHOS 錯体は、全体の手順中に 1 つの凍結融解サイクルを容認することのみ。複数の凍結融解サイクル OXPHOS 錯体 (図 1 b) を破壊します。制御と比較されるべき実験のサンプルは、誤解を招く結果を与える可能性がありますストレージの条件の違いを避けるために並行して準備されるべき。-80 ° c (このプロトコルの手順 1.4) 洗浄細胞ペレットを凍結し、後ですべてのサンプル用のプロトコルの残りの部分を一緒に運ぶ少なくともゲル電気までをお勧めしますすべてのサンプルとの並行プロトコルのすべての手順を実行できない場合は、trophoresis。電気泳動装置 (タンク、カセット) の清潔さに特別な留意が必要です。SDS ページの同じ装置を使用する場合、BN ページの前に非常によく洗います。任意の残留 SDS 電気泳動中に OXPHOS 錯体の解離があります。
高品質勾配ゲルは、プロトコルの別の重要な部分です。青ネイティブ ページのプレキャスト ゲルが市販です。しかし、それしない商業ゲル使用されるバッファー可能性がありますサンプル バッファーとは異なる組成を持っているので、それらを使用するをお勧めします。ここで使用されるゲル (6-15%) のグラデーションは、個々 の OXPHOS 錯体の分離に最適です。高次 OXPHOS、別名呼吸鎖 supercomplexes14の超分子構造を検出するには、いくつかの最適化は必要な11です。
OXPHOS の可視化については、複合体は、そのプロパティに基づいた順番に、特定の抗体を使用します。たとえば、最初最後弱い信号と最も強い信号を持つ抗体を与える抗体を使用します。ストリッピング検出 (図 1) を弱めるので、これは重要です。SDS ページ15の 2 番目の次元後 BN-PAGE - ゲルを受ける場合は、呼吸鎖複合体の組成を調べることができます。
ここで説明したプロトコルでは、順番に個々 の OXPHOS 複合体に対する抗体を使用して示唆しています。ただし、市販の OXPHOS 抗体カクテルはすべて 5 OXPHOS 錯体を同時に検出する使用できます。それにもかかわらず、不完全に組み立てられた OXPHOS 複合体を検出し、自分のアイデンティティを定義することができるには、個々 の OXPHOS 複合体に対する抗体は順番に使用ください。この手順は手間がかかります。ただし、新しい実験条件とモデルをテストに不可欠なことです。
特定のセルタイプのジギトニン ミトコンドリアの分離に使用濃度を最適化してください。洗剤として、ジギトニン permeabilizes 細胞膜です。ジギトニンの最適濃度は、ミトコンドリアの膜がそのまま細胞膜を効率的に permeabilizes します。ジギトニンのあまりにも低濃度高濃度ミトコンドリア膜を損傷ミトコンドリア収量が減少し、ミトコンドリアの抽出物の高濃度の汚染が発生します。最適なジギトニン ・ タンパク質比 (g) は 0.3 から 1 によって異なります。ペレットや培養上清から抽出した蛋白質の西部のしみの分析は、ジギトニン16の最適濃度をテストする使用できます。
このプロトコルは蛋白質イムノブロット; 上コントロールを読み込むを含みませんしたがって、抽出錯体の蛋白質の集中する必要があります慎重に測定する少なくともトリプリケート等しい荷重を確保するために。さらに、複製の BN のページでサンプルを実行できます。選択的な OXPHOS の複合体のアセンブリが障害者の場合影響を受けない錯体がコントロールを読み込むとして使用できます。
BN-PAGE - 蛋白質の複合体の分子固まりの推定は18に挑戦します。現在のプロトコルは、分子量マーカーを含まないしたがって、OXPHOS の複合体のアセンブリを推定する影響を受けない錯体を含むコントロールのサンプルが常に含まれる分析で。BN ページのコントロールのサンプルは、通常、未処理または野生型細胞です。
ミトコンドリア呼吸鎖複合体の検出のためここで紹介した方法を最適化します。ただし、ミトコンドリア蛋白質19のオリゴメリゼーションに関する評価も適用することができます。さらに、第一の破壊サブユニットのミトコンドリア エンコード含む錯体クロラムフェニ コールとクロラムフェニ コール10の除去後の回復が次で OXPHOS の複合体のアセンブリ率を研究できます。したがって、定常状態レベルと人間のミトコンドリア疾患9,11の分子診断を含むさまざまなアプリケーション OXPHOS のアセンブリを評価する BN ページを使用できます。

ミトコンドリアは、多機能の細胞内小器官のエネルギー産生、細胞代謝、シグナル伝達、アポトーシス、老化など1,2,3の調節に重要な役割を果たしています。ミトコンドリアのエネルギー生産は、ATP 合成と呼吸をカップル酸化的リン酸化関数に依存します。ひと細胞におけるミトコンドリアの酸化的リン酸化システム (OXPHOS) は、5 つの複合体の構成されます。複合体 IV は、ATP を生成する複雑な V で使用されるミトコンドリア膜間腔にプロトンの電気化学的勾配を作成します。各 OXPHOS 複雑なポリコームタンパク、核およびミトコンドリアの遺伝子によって符号化されるサブユニットから成る複雑な第二を除く。突然変異や環境ストレスによる OXPHOS 錯体のコア コンポーネントの任意の欠陥ことができますアセンブリおよび酸化的リン酸化システムの機能を混乱させます。さらに、機能的な OXPHOS 錯体の適切なアセンブリには、アセンブリの要因4,5,6の数が多いが必要です。
ブルー ネイティブ ポリアクリルアミドゲル電気泳動 (BN-PAGE) 無傷タンパク質複合体の解析を有効にする基本的な技術であり OXPHOS の複合体のアセンブリを調査する使用することができます。まず、ミトコンドリア細胞から分離されて、ジギトニン、によって、細胞膜を permeabilizes 中性洗剤であります。その後、ラウリル maltoside を用いた OXPHOS 錯体はミトコンドリア膜から解放されます。勾配ゲル電気泳動法を用いた OXPHOS 複合体は固まりに従って分かれています。Coomassie ブルー G-250 (ない R-250) サンプル バッファーと青い陰極バッファーに追加は洗剤不安定な関連付けが切り離されますが、個々 の呼吸鎖複合体そのまま8を維持されます。、電気泳動中に染料を含む青い陰極バッファーは、染料、PVDF 膜8OXPHOS 錯体の効率的な転送を保証することがなく陰極バッファーに置き換えられます。OXPHOS 複合体を可視化、PVDF 膜順番に選択した 5 OXPHOS 複合体サブユニットに対応する抗体と培養です。
いくつかの変更ここで説明する方法は、培養細胞に適用できます。さらに、このメソッドは、OXPHOS 組織サンプル9から分離されたミトコンドリア複合体の解析に使用できます。BN-PAGE - 各サンプルごとに実行のミトコンドリアの少なくとも 5-10 μ g が必要です。ここで説明した方法を使用して、500,000 培養細胞 HEK293、SH SY5Y などまたは 143B 細胞はミトコンドリアの約 10 μ g をもたらすことができます。ただし、BN 分析のため細胞の十分な量は、特定のセルの種類によって異なります。
ミトコンドリア OXPHOS 蛋白質を研究する最も一般的な方法は SDS のページおよび西部にしみが付くことです。ただし、SDS-PAGE 個々 OXPHOS サブユニットのみを研究して、BN-PAGE-と対照をなして全体 OXPHOS の複合体のアセンブリを評価する使用できません。明確なネイティブ ページは負荷電色素の存在しなくてもネイティブ条件における蛋白質複合体を分離しは、BN ページと比較して著しく低い解像度。ただし、明確なネイティブ ページは BN ページ条件10の下で解離 OXPHOS supercomplexes などのタンパク質複合体の分子集合体不安定なまま保存できるので、BN ページより穏和です。このプロトコルでは勾配ゲルを使用して複合体;しかし、また、非勾配分離使用できます比較的高価なグラデーション メーカーが利用可能な11ではない場合。
重要なは、ここで説明したメソッドを使用する複合体の機能が評価されていませんしながら OXPHOS の複合体のアセンブリを分析します。ミトコンドリア複合体12吸光光度酵素活性アッセイと同様、ゲルの活動分析11続く高解像度 BN-PAGE は、効率的な OXPHOS 複合体の機能解析手法です。ただし、これらのメソッドの両方を行うない OXPHOS の複合体のアセンブリの試金します。
したがって、BN ページ、個々 の OXPHOS の複合体のアセンブリを調査する最適な方法です。たとえば、レーバー遺伝性視神経症 (ルホン) 乳酸アシドーシスと脳卒中様発作 (MELAS) ミトコンドリア脳症など、いくつかのミトコンドリア障害、OXPHOS の 1 つまたは複数のコンポーネントの変更されたアセンブリに関連付けられています。システム5。ここで説明 BN ページのメソッドを使用して、ミトコンドリア病の分子メカニズムを学ぶことができます。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:693px;" width="693">
	<tbody>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:316px;">100 mm cell plates</td>
			<td style="width:97px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:111px;">130182</td>
			<td style="width:169px;"></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">40% Acrylamide/Bis 37.5:1</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>161-0148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Aminocaproic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A2504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Ammonium persulfate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A3678</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Anti-ATP5A</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>14748</td>
			<td>Complex V subunit</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Anti-MTCOI</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>14705</td>
			<td>Complex VI subunit</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Anti-NDUFA9</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>14713</td>
			<td>Complex I subunit</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Anti-SDHA</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>14715</td>
			<td>Complex II subunit</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Anti-UQCRC2</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>14745</td>
			<td>Complex III subunit</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Bis-tris</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B7535</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Bradford protein assay kit</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>5000006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Cell scrapers</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>11597692</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Coomassie blue G250 (Serva Blue G)</td>
			<td>Serva</td>
			<td>35050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Digitonin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">DMEM</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>12-614F/12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">EDTA</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15575-038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">FBS</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10270106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Fetal bovine serum</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10270106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Glycerol</td>
			<td>(Sigma</td>
			<td>G5516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Gradient maker</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1654120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Lauryl maltoside (n-Dodecyl &#946;-D-maltoside)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D4641</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">L-glutamine</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>25030024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">L-glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">N,N,N&#8242;,N&#8242;-Tetramethylethylenediamine (TEMED)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T9281</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">PBS</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>BE17-516F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>17-602E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Penicillin/streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Power supply</td>
			<td>GE Healthcare&#160;</td>
			<td>EPS 301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Protease inhibitors</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>10137963</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Trans-blot turbo mini PVDF</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1704156</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Tricine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T9784</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Trypsin-EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15400054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Vertical electrophoresis apparatus</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1658004</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of mitochondrial respiratory chain complexes in cultured human cells using blue native polyacrylamide gel electrophoresis and immunoblotting

ミトコンドリアの呼吸は、ミトコンドリア内での酸化的リン酸化 (OXPHOS) 錯体によって実行されます。内部および環境要因ことができるアセンブリと OXPHOS 錯体の安定性を混乱させます。このプロトコルでは、ひと培養細胞への応用でブルー ネイティブ ポリアクリルアミドゲル電気泳動 (BN ページ) によるミトコンドリア呼吸鎖複合体の解析をについて説明します。ジギトニンを使用して細胞からミトコンドリアを抽出するまず、ラウリル maltoside を使用して、そのまま OXPHOS 錯体は、ミトコンドリア膜から分離されます。OXPHOS 錯体は、勾配ゲル電気泳動負荷電色素、Coomassie 青い、カソードに向かって膜タンパク質の電気泳動度を保証し蛋白質の集合を防ぐことで解決されます。最後に、OXPHOS 錯体は標準のイムノブロットによる検出されます。したがって、BN ページは便利で安価な手法のみ個別 OXPHOS 複雑な亜単位の検討できるように基本的な SDS-PAGE と対照をなしての全体 OXPHOS の複合体のアセンブリを評価に使用することができますです。

BN] ページを使用すると、ミトコンドリアの OXPHOS の複合体のアセンブリの欠陥を調べることができます。図1 aは、ひと神経芽腫細胞 (SH SY5Y) クロラムフェニ コールは、具体的には mtDNA エンコード OXPHOS サブユニットの翻訳を阻害する呼吸鎖複合体のアセンブリを示します。クロラムフェニ コール劣化 mitochondrially でエンコードされたサブユニットを含む OXPHOS 錯体 (複雑な I, III, IV;図1 a) が専ら核遺伝子によってエンコードされている複雑な II 亢進していた compensatorily 中。複合体 V は、エスディーエスここではなかった。
複数の凍結融解サイクル OXPHOS の複合体を破壊します。図1 bは、凍結融解による OXPHOS 複合体の分解を示しています。複数の凍結融解を受けたサンプル 3 ではミトコンドリアの呼吸鎖複合体はより低いバンドの強度がある、一度だけ凍結された同一のサンプルと比較してシフトされます。図 1 bの西部のしみを耕作してないイメージは、補助図 1に表示されます。
ゲルの品質は、シャープされ、オフのバンドにとって重要です。図1 Cは、よくした重合していないのでゲルからイムノブロットを示しています。膜の除去も OXPHOS 複合体の検出に影響することができます。図 1 D、複雑な私が検出されましたの前に、または除去した後。除去した後は、信号対雑音比はずっと低いです。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59269/59269fig1.jpg"> 図1 です成功と準最適実験から BN ページ immunoblots。 。(A)ミトコンドリア翻訳の阻害剤による錯体の OXPHOS 枯渇。ひと神経芽腫細胞 (SH SY5Y) は 48 時間のクロラムフェニ コール (CAP) と扱われました。CTRL、クロラムフェニ コール治療せず制御の細胞。下のパネルは、イムノブロットの定量化を示しています。コントロールの値は、1 (破線として示されている) と見なされます。データを提示する平均 ± SD、n = 3、* P < コントロール使用する場合に比べて 0.0001 対学生の t テストになっていません。(B)複数の凍結融解による OXPHOS 錯体の中断のサイクルします。サンプル 1-3 は、同じ条件でひと骨肉腫細胞 (143B) から作製した.サンプル数 1 と 2 は凍結され、サンプル数 3 4 凍結融解を受けた中、一度だけ溶けています。(C) BN ページ immunoblots OXPHOS 錯体 HEK293 細胞から分離されました。バンドのスミアはゲルの低品質が原因です。(D) OXPHOS 複合体の検出でストリップの効果。複合体の検出ひと神経芽腫細胞 (SH SY5Y) 前に、と同じ膜の除去後の私。OXPHOS 錯体の抗 NDUFA9 抗体を使用して検出された (複雑な私)、反 SDHA 抗体 (複合体 II)、抗 UQCRC2 抗体 (複合体 III)、反 COX1 抗体 (複雑な IV)。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59269/59269fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>バッファーまたはソリューション</td>
			<td>組成</td>
			<td>レシピ</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="4">ゲルのバッファー x 3</td>
			<td>1.5 M アミノカプロン酸</td>
			<td>アミノカプロン酸の 3.94 g</td>
		</tr>
<tr>
<td>150 mM ビス トリス</td>
			<td>Bis トリスの 0.63 g</td>
		</tr>
<tr>
<td>dH2O</td>
			<td>DH2O 20 mL を追加します。</td>
		</tr>
<tr>
<td>pH 7.0</td>
			<td>7.0 に pH を合わせなさい</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="4">陰極バッファー</td>
			<td>15 mM ビス トリス</td>
			<td>Bis トリスの 3.14 g</td>
		</tr>
<tr>
<td>50 mM トリシン</td>
			<td>トリシン 8.96 g</td>
		</tr>
<tr>
<td>dH2O</td>
			<td>DH2O 1000 mL を追加します。</td>
		</tr>
<tr>
<td>pH 7.0</td>
			<td>7.0 に pH を合わせなさい</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="5">青い陰極バッファー</td>
			<td>0.02 %coomassie 青い G</td>
			<td>Serva ブルー G の 0.04 g</td>
		</tr>
<tr>
<td>15 mM ビス トリス</td>
			<td rowspan="4">200 mL の陰極バッファー</td>
		</tr>
<tr>
<td>50 mM トリシン</td>
		</tr>
<tr>
<td>dH2O</td>
		</tr>
<tr>
<td>pH 7.0</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="3">陽極バッファー</td>
			<td>50 mM ビス トリス</td>
			<td>20.93 g</td>
		</tr>
<tr>
<td>dH2O</td>
			<td>DH2O 2000 mL を追加します。</td>
		</tr>
<tr>
<td>pH 7.0</td>
			<td>7.0 に pH を合わせなさい</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="5">ミトコンドリアのバッファー</td>
			<td>1.75 M アミノカプロン酸</td>
			<td>ゲルのバッファー x 3 の 0.5 mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>75 mM ビス トリス</td>
			<td>2 M アミノカプロン酸 0.5 mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>2 ミリメートルの EDTA</td>
			<td>500 ミリメートルの EDTA の 4 μ L</td>
		</tr>
<tr>
<td>dH2O</td>
			<td>-</td>
		</tr>
<tr>
<td>pH 7.0</td>
			<td>-</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="3">サンプル バッファー</td>
			<td>750 mM アミノカプロン酸</td>
			<td>2 M アミノカプロン酸の 0.94 mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>5 %comassie ブルー G</td>
			<td>Serva ブルー G の 0.125 g</td>
		</tr>
<tr>
<td>dH2O</td>
			<td>DH2O 2.5 mL を追加します。</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">2 M アミノカプロン酸</td>
			<td>2 M アミノカプロン酸</td>
			<td>アミノカプロン酸の 2.62 g</td>
		</tr>
<tr>
<td>dH2O</td>
			<td>DH2O 10 mL を追加します。</td>
		</tr>
</tbody></table>表 1。バッファーおよび解決 BN ページに使用します。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>ブルー ネイティブ ゲル</td>
			<td>6% ゲルの分離</td>
			<td>15% ゲルの分離</td>
			<td>4% ゲルのスタック</td>
		</tr>
<tr>
<td>ゲルのバッファー x 3</td>
			<td>3.3 mL</td>
			<td>3.3 mL</td>
			<td>1.64 mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>40% アクリルアミド/ビス 37.5:1</td>
			<td>1.5 mL</td>
			<td>3.75 mL</td>
			<td>0.5 mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>dH2O</td>
			<td>5.14 mL</td>
			<td>0.93 mL</td>
			<td>2.77 mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>グリセロール</td>
			<td>0</td>
			<td>2 mL</td>
			<td>0</td>
		</tr>
<tr>
<td>アンモニウムの過硫酸塩 10% *</td>
			<td>60 Μ L</td>
			<td>10 Μ L</td>
			<td>60 Μ L</td>
		</tr>
<tr>
<td>TEMED</td>
			<td>4 Μ L</td>
			<td>2 Μ L</td>
			<td>6 Μ L</td>
		</tr>
<tr>
<td>総容積</td>
			<td>10 mL</td>
			<td>10 mL</td>
			<td>5 mL</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="4">* DH2O で常に新鮮な 10% のアンモニウムの過硫酸塩を作る</td>
		</tr>
</tbody></table>表 2。BN-PAGE - ゲルのレシピ。
附則図1 ですの耕作してない西部のしみ画像図 1B。 。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59269/Supplementary_figure_1.eps" target="_blank">この図をダウンロードするここをクリックしてください</a>。

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Analysis of Mitochondrial Respiratory Chain Complexes in Cultured Human Cells using Blue Native Polyacrylamide Gel Electrophoresis and Immunoblotting

ブルー ネイティブ ポリアクリルアミドゲル電気泳動法と免疫ブロットを使用して培養されたひと細胞のミトコンドリア呼吸鎖複合体の解析

このプロトコルは、青いネイティブ ポリアクリルアミドゲル電気泳動によるミトコンドリア呼吸鎖複合体の分析を示します。ここでひと培養細胞に適用する方法を説明します。

Mitochondrial respiration is performed by oxidative phosphorylation (OXPHOS) complexes within mitochondria. Internal and environmental factors can perturb ...

青色の天然ポリアクリルアミドゲル電気泳動により、ミトコンドリア酸化リン酸化系のインタクト複合体の解析が可能です。ミトコンドリア酸化リン酸化系の複合体全体の集合体を重ね合わせることができる便利で安価な技術です。ミトコンドリア溶解物を調製するには、まず氷冷PBS溶液を使用して細胞を1回穏やかに洗浄します。細胞を削り、摂氏4度で800Gで10分間ペレットします。その後、800Gで氷冷PBSと遠心分離機で細胞ペレットを2回800Gで10分間洗浄します。次に、200xプロテアーゼ阻害剤の200マイクロリットルをPBSの20ミリリットルに加える。PBSプロテアーゼ阻害剤混合物中の細胞を、1ミリリットル当たり5ミリグラムの最終的なタンパク質濃度に再懸濁する。プロテアーゼ阻害剤を用いてPBSで3.3ミリモルジジトニンを調製するには、沈殿が見えないまで100°CでPBSの1ミリリットルにジジトニンの4ミリグラムを溶解する。すぐに氷の上で冷却し、100xプロテアーゼ阻害剤の10マイクロリットルをジジトニン溶液の1ミリリットルに加えます。次に、1.65ミリモルの最終濃度でジギトニンプロテアーゼ阻害剤混合物を細胞に加えます。よく混ぜ、氷の上で5分間インキュベートします。次に、PBSプロテアーゼ阻害剤混合物を細胞に加え、最終体積1.5ミリリットルにします。摂氏4度で10,000Gで10分間遠心分離機。上清を取り除き、ミトコンドリアバッファー内のミトコンドリアペレットを再中断します。PBS阻害剤溶液に取り付けた新鮮な10%ロレアルの1ミリリットルを調製する。氷上で1%インキュベートの最終濃度でミトコンドリアに10%ロレアルマウントを加え、少なくとも15分間追加します。摂氏4度で20,000Gで20分間遠心分離機。上清を新しいチューブに集め、サンプルバッファーを追加します。青色のネイティブページ用の勾配ゲルを調製するには、まず、傾斜式メーカーを攪拌プレートに配置し、柔軟なチューブを蠕動ポンプに接続します。針を入れた輸液セットをチューブに取り付けます。勾配メーカーの近位チャンバーに磁気撹拌機を入れ、最大ポンプ速度で蒸留水でチューブを10分間洗浄します。次に、チューブと勾配メーカーを空にします。ピペットを使用して、勾配メーカーのチャンバー間のチャネル内の残った蒸留水を除去します。チャネルとチューブをバルブで閉じます。ホルダーに2枚のガラス板を組み立て、スタンドに置きます。ゲルホルダーの底部の穴を使用して、ガラス板の間のチューブに針を接続します。8.3 x 7.3センチメートルのゲルを作るために、最初に6%と15%のゲル溶液を調製し、氷の上に保管してください。気泡を作らないように、それらを穏やかに混ぜます。次に、勾配ゲルミキサーチューブチャンバーの近位端に6%ゲルの2.6ミリリットル、遠位端を15%ゲルの2.1ミリリットルでロードします。次に、磁気スターラーをオンにして、勾配メーカーのチャンバー間のチューブとチャネルを開きます。直ちに蠕動ポンプを毎分5ミリリットルに切り替えます。ガラス板を満たし、チューブにゲルがない場合は針を取り除きます。ゲルを蒸留水でそっと重ね、ゲルを室温で少なくとも1時間保ちます。勾配チャンバーを蒸留水で満たし、蠕動ポンプを最高速度で使用して、チューブを直ちに洗浄します。蒸留水6ミリリットルを3ミリリットルの3ミリリットルの3ミリリットルの3つのゲルバッファーに加え、1xゲルバッファーを作ります。ろ紙で、ゲルの表面から蒸留水を静かに取り除きます。ゲルの表面を1xゲルバッファーで洗い、濾紙で緩衝液をそっと取り除きます。原稿に従って4%積み重ねゲルを準備する。気泡にならないように、やさしく混ぜます。次に、ガラス板の間に櫛を置き、櫛の下に積み重ねゲルを注ぎます。櫛を完全に浸します。積層ゲルを少なくとも30分間重合させます。その後、櫛を取り出し、ピペットを使用して1xゲルバッファーでウェルを洗浄します。青色の天然ゲル電気泳動を行うために、まず、青カソードバッファーをゲルカセットに加える。ピペットを使用して、青いカソードバッファーで井戸を洗浄し、充填します。その後、5〜30マイクログラムのタンパク質サンプルを井戸にロードします。青いカソードバッファーを上部に、タンクにアノードバッファーをそっと充填します。まず、15分間40ボルトの定電圧でゲルを実行します。その後、電圧を80ボルトまで上げます。染料がゲル長の2/3に達するまでゲルを実行します。青いカソードバッファーをカソードバッファーに交換し、色素前面がゲルから外れるまで電気泳動を続けます。ガラスプレートを取り出し、半乾式ブロッティングでPVDF膜にタンパク質を移します。25ボルトの定電圧と電流を1アンペアに30分間使用してください。ヒト神経芽細胞腫細胞における呼吸鎖複合体の集合は、治療を受けずにコントロール細胞と比較してクロラムフェニコール処理時に阻害された。対照的に、核遺伝子によってコードされる複合体は、アップレギュレートされた。酸化リン酸化錯体の分解は、複数の凍結融解サイクルで観察された。ゲルの品質は酸化リン酸化複合体の検出に影響を与える可能性があります。また、膜の剥離は、信号対雑音比を低下させた。手順を実行する際には、OXPHOS複合体を保持するために、冷たい条件下で簡単な調製とゲル電気泳動を行うことを忘れないでください。青色のネイティブページに続いて、第2の次元SDSページを適用して、呼吸鎖複合体のタンパク質サブユニットを研究することができる。青いネイティブページは、研究者が複合体の組立、さらには酸化リン酸化システムの超複合体を研究することができます。

Research

JoVE Journal

Biology

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Probing for Mitochondrial Complex Activity in Human Embryonic Stem Cells

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