Name: analysis of mitochondrial respiratory chain complexes in cultured human cells using blue native polyacrylamide gel electrophoresis and immunoblotting
Uploaded: 2019-02-12T15:00:00
Duration: 7 min 55 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Mitochondrial Respiratory Chain Complexes in Cultured Human Cells using Blue Native Polyacrylamide Gel Electrophoresis and Immunoblotting at JoVE.

Biblioteca da Universidade de Helsínquia é agradeceu o apoio financeiro em uma editora.

spaNOTE: Este protocolo é baseado em uma publicação associada pelo Hilander et al.13 .
1. preparação de buffers e soluções
Nota: Todos os buffers e soluções usadas no protocolo estão resumidas na tabela 1. Os volumes determinados dos buffers são suficientes para preparar e executar 10 amostras. Todos os buffers podem ser armazenados a + 4 ° C por até um ano.
<ol><li>Prepare 20 mL de 3x do amortecedor de gel contendo ácido aminocaproico de 1,5 M, 150 mM tris-Bis em água destilada (dH2O). Ajuste o pH a 7,0.</li>
	<li>Prepare-se 10 mL de Ácido aminocaproico de 2m em dH2O.</li>
	<li>Prepare-se 1 mL de tampão de mitocondrial combinando-se o seguinte: 0,5 mL de 3x do amortecedor gel, 0,5 mL de Ácido aminocaproico de 2 M e 4 µ l de 500 mM de EDTA.</li>
	<li>Prepare 1.000 mL de solução tampão de cátodo com 15 mM de tris-Bis e 50 mM de tricine em dH2O. Adjust pH a 7,0.<ol>
<li>Prepare 200 mL de tampão de catodo azul adicionando 0,04 g de azul de Coomassie G-250 para 200 mL de tampão de cátodo.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Prepare 1.000 mL de tampão de ânodo contendo 50 mM tris-Bis em dH2O. Adjust pH a 7,0.</li>
	<li>Prepare-se 2,5 mL de tampão de amostra contendo ácido aminocaproico de 750 mM e 5% de azul de Coomassie G-250 em dH2O.</li>
</ol>2. preparação de lysates mitocondrial
<ol><li>As células da placa no dia antes da coleta. Para as células HEK293 ou 143, uso Dulbecco modificado médio da águia (DMEM) com 10% de soro fetal bovino, 1% L-glutamina, 100 mg/mL penicilina e estreptomicina 100 mg/mL. Crescem as células em uma incubadora de cultura celular + 37 ° c numa atmosfera 5% CO2 umidificada. Certifique-se de que há pelo menos 500.000 células para cada amostra no dia da coleta.</li>
	<li>Lave delicadamente as células uma vez com PBS gelado. Evite destacando as células da placa. Raspar as células e os de Pelotas a 800 x g por 10 min a + 4 ° C.</li>
	<li>Lave o centrifugado duas vezes com PBS gelado e centrifugar como no passo 2.2. Medir a concentração de proteína com o método de Bradford, usando um kit comercial. Pelotas as células a 800 x g por 10 min a + 4 ° C. Nota: Após a coleta da célula, executar todas as etapas, a + 4 ° C e fazer não o vórtice.</li>
	<li>Prepare-se 20 mL de PBS com inibidor de protease adicionando 200 µ l de inibidor de protease 100 x 20 mL de PBS. Manter-se no gelo. Ressuspender as células em PBS com inibidor de protease para uma concentração de proteína final de 5 mg/mL.<ol>
<li>Para calcular o volume de PBS com inibidor de protease necessário para Ressuspender as células em 5 mg/mL, calcule a quantidade de proteína em cada amostra. Para este cálculo, use a concentração de proteína, medida em passo 2.3 e o volume de PBS usado para Ressuspender as células após a lavagem na etapa 2.3.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Prepare-se 1 mL de digitonin de 3,3 mM em PBS com inibidor de protease. Adicione digitonin 3,3 mM para uma concentração final de 1,65 mM. Misture bem e incubar no gelo por 5 min.<ol>
<li>Para preparar 1 mL de digitonin de 3,3 mM em PBS com inibidor de protease, dissolver 4 mg de digitonin em 1 mL de PBS a 100 ° C até o precipitado não é visível e fresco no gelo imediatamente. Adicione 10 µ l de inibidor de protease x 100 a 1 mL de solução de digitonin. Nota: Utilize apenas uma solução fresca de digitonin. Atenção: O Digitonin é tóxico! Use uma máscara facial, luvas e avental.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Adicione PBS com inibidor de proteinase (preparado na etapa 2.4) para o volume final de 1,5 mL. Centrifugação a 10.000 x g durante 10 minutos a + 4 ° C. Remova o sobrenadante. Nesta etapa, as mitocôndrias são peletizadas.</li>
	<li>Resuspenda o pellet mitocondrial em buffer mitocondrial. O volume de tampão mitocondrial é metade do volume de PBS na etapa 2.4.</li>
	<li>Prepare-se fresco maltoside de lauril de 10% em PBS contendo inibidor da protease (preparado na etapa 2.4). 1 mL é suficiente para 10 amostras. Adicione 10% Lauril maltoside para a concentração final de 1%. Incube no gelo por 15 min (este passo pode demorar até algumas horas).</li>
	<li>Centrifugar a 20.000 x g por 20 min a + 4 ° C. Recolha o sobrenadante para um tubo novo. Medir a concentração de proteína pelo método de Bradford, usando um kit. Adicione o amortecedor da amostra, um volume que é metade do volume de lauril maltoside usado na etapa 2.8. As amostras podem ser armazenadas a-80 ° C por até 6 meses.</li>
</ol>3. preparação do gel de gradiente para BN-página
<ol><li>Despeje o gel gradiente para BN-página à temperatura ambiente. Coloque a máquina de gradiente em uma placa de agitação e conectá-lo com tubo flexível para a bomba peristáltica. Anexe uma infusão em conjunto com a agulha para a tubulação. Coloque um agitador magnético na câmara proximal do fabricante gradiente. Lave o tubo com O dH2a velocidade máxima de bombeamento por 10 min.</li>
	<li>Esvazie o tubo e o fazedor de gradiente. Use uma pipeta para retirar qualquer sobra de dH2O no canal entre as câmaras do fabricante gradiente. Feche o canal e o tubo com a válvula.</li>
	<li>Usando grampos e carcaça frame montar duas placas de vidro no suporte, que tem um furo no fundo, e colocá-lo para depor. Certifique-se que é mais ou menos sobre uma superfície reta, com um equilíbrio de água. Lugar a agulha conectada a tubulação entre as placas de vidro.</li>
	<li>Prepare soluções de gel de 6% e 15% (tabela 2). Manter-se no gelo. Adicionar o persulfato de amónio (APS) e tetramethylenediamine (TEMED) (começam a polimerização) ontem. Misture delicadamente para evitar fazer ar bolhas.</li>
	<li>Carrega a extremidade proximal da câmara gradiente-gel-misturador tubos com gel de 6% e a extremidade distal com gel de 15%. O volume total do gel deve ser igual ao volume do gel de separação entre as placas de vidro. Portanto, use 2,6 mL de gel de 6% e 2,1 mL de gel de 15% para o misturador de gel de gradiente para o gel um 8,3 cm x 7,3 cm de tamanho.</li>
	<li>Ligue o agitador magnético e abra o tubo e o canal entre as câmaras do fabricante gradiente. Ligue imediatamente a bomba peristáltica para 5 mL/min. preencher as placas de vidro e não permita que as bolhas introduzir o gel. Retire a agulha quando não há nenhum gel em tubo.</li>
	<li>Sobreposição de suavemente o gel com dH2O. manter o gel à temperatura ambiente pelo menos 1 h para polimerização.</li>
	<li>Imediatamente depois de derramar o gel, lavar o tubo de encher as câmaras de gradientes com dH2O e usando a bomba peristáltica na velocidade máxima. Ao preparar dois e mais géis, Limpe sempre o sistema no meio.</li>
	<li>Preparar 1 amortecedor de gel x misturando-se 3 mL de 3x do amortecedor gel e adicione 6 mL de dH2Remove O. dH2O da superfície do gel com papel de filtro suavemente. Lave a superfície do gel com amortecedor de gel de 1x. 1 x amortecedor de gel com papel de filtro retire suavemente.<ol>
<li>Evite as fibras do papel do filtro no gel. Para garantir isso, corte o papel em pequenos pedaços com uma tesoura, mas não vai rasgar o papel.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Coloque o pente entre as placas de vidro, mas não imergi-lo totalmente para ser capaz de derramar o gel de empilhamento sob o pente. Prepare a 4% (tabela 2) de gel de empilhamento. Adicionar APS e TEMED última como eles começam a polimerização facilmente. Misture delicadamente evitando bolhas de ar.</li>
	<li>Sobrepor o gel de empilhamento, evitando bolhas sob o pente e mergulhe o pente totalmente. Deixe o gel de empilhamento polimerizar pelo menos 30 min. retirar o pente e lavar os poços com amortecedor de gel usando uma pipeta de 1x.<ol>
<li>Após a polimerização, o gel pode ser armazenado em + 4 ° C por uns dias. Para armazenar o gel, embrulhe o gel em papel embebido em dH2O e plástico filme para impedir a secagem do gel.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. eletroforese em gel de nativo azul
Nota: Para prevenir a degradação de OXPHOS complexos executar eletroforese a + 4 ° C. Use buffers de pre-refrigerados.
<ol><li>Carrega a fita de gel com o buffer de catodo azul até o fundo dos poços. Carregamento das amostras é mais fácil quando a fita não está cheio até o topo. Lavar os poços com o buffer de catodo azul e em seguida, preencher os poços com buffer de catodo azul usando a pipeta.</li>
	<li>Carrega as amostras (5-30 µ g de proteína) em poços. Preencha suavemente a fita de gel para o topo com o buffer de catodo azul e o tanque com buffer de ânodo.</li>
	<li>Funcione o gel durante 15 min em uma constante tensão de 40 V. Depois, aumente a tensão de 80 V (ou use uma corrente constante de 6 mA), não ultrapasse 10 mA. Funcione o gel até o corante atinge 2/3 do comprimento do gel.</li>
	<li>Substitua o tampão de catodo azul com buffer de cátodo e continuar a electroforese até a frente da tintura se esgotou. No total, electroforese leva cerca de 3 horas.</li>
	<li>Recuperar as placas de vidro e transferência das proteínas à membrana polivinilideno fluoreto (PVDF) semi-seca borrando. Use uma tensão constante de 25 V e uma corrente limitada a 1.0 um por 30 min.<ol>
<li>Como alternativa, use o mancha molhada para transferir os complexos OXPHOS para uma membrana PVDF.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Continue com o bloqueio de incubação da membrana e os anticorpos de acordo com o protocolo padrão immunoblotting. Use os anticorpos primários contra subunidades de complexos OXPHOS sequencialmente. Nota: por exemplo, usar o anticorpo anti-NDUFA9 (1: 2000) para o complexo eu, anticorpo anti-SDHA (1: 2000) para o complexo II, anticorpo anti-UQCRC2 (1: 1000) para o complexo III, anticorpo anti-COX1 (1: 2000) para o complexo IV e anti-ATP5A anticorpo (1: 2000) para o complexo V. A lista dos anticorpos é apresentada na Tabela de materiais.</li>
</ol>

<ol>
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T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+a+quantitative+quadruple+immunofluorescent+assay+to+diagnose+isolated+mitochondrial+Complex+I+deficiency.">Using a quantitative quadruple immunofluorescent assay to diagnose isolated mitochondrial Complex I deficiency.</a> Scientific Reports. 7 (1), (2017).</li></ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Uma das partes mais importantes do protocolo é preservar intactos complexos OXPHOS durante a preparação das amostras, armazenamento e electroforese do gel. Assim, as mitocôndrias devem ser isoladas a + 4 ° C e as amostras não devem ser submetidos a ciclos de gelo-degelo. Complexos de OXPHOS só podem tolerar um ciclo de congelamento-descongelamento durante todo o processo. Vários ciclos de congelamento e descongelamento destruam complexos OXPHOS (figura 1B). Controle e amostras experimentais que estão a ser comparado devem ser preparadas em paralelo para evitar eventuais diferenças de condições de armazenamento, que poderiam dar resultados enganosos. Se não for possível executar todas as etapas do protocolo em paralelo com todas as amostras, recomendamos congelar pelotas lavados célula a-80 ° C (etapa 1.4 neste protocolo) e depois realizar o resto do protocolo para todas as amostras juntos pelo menos até gel elec trophoresis. Atenção especial deve ser pago para a limpeza do aparelho de eletroforese (tanque, gaveta). Se o mesmo aparelho é usado para SDS-PAGE, lave-o muito bem antes de BN-página. Qualquer SDS residual pode causar dissociação dos complexos OXPHOS durante a electroforese.
Géis de gradientes de alta qualidade são outra parte crítica do protocolo. Geles de pré-moldado para azul página nativa são comercialmente disponíveis; no entanto, não é recomendável usá-los, desde que os buffers usados para géis comerciais podem ter uma composição, que é diferente de buffers de amostra. O gradiente do gel usado aqui (6-15%) é ideal para a separação dos complexos OXPHOS individuais. Para detectar estruturas supramoleculares de ordem superior de OXPHOS, cadeia respiratória também conhecido como supercomplexos14, alguma otimização é necessário11.
Para a visualização de OXPHOS complexos de usam os anticorpos específicos sequencialmente, com base em suas propriedades. Por exemplo, use primeiro o anticorpo que dá o sinal mais fraco e o anticorpo com o sinal mais forte última. Isto é importante, desde que o stripping enfraquece a deteção (Figura 1). A composição dos complexos da cadeia respiratória pode ser investigada se após BN-página o gel é submetido a segunda dimensão de SDS-PAGE15.
O protocolo descrito aqui sugere usando anticorpos contra complexos OXPHOS individuais sequencialmente. No entanto, o anticorpo OXPHOS comercialmente disponível cocktail pode ser usado para detectar todos os complexos OXPHOS cinco simultaneamente. No entanto, para ser capaz de detectar incompleta montado OXPHOS complexos e definir sua identidade, anticorpos contra complexos OXPHOS individuais devem ser utilizados sequencialmente. Esta etapa é demorada; no entanto, pode ser essencial para testar modelos e novas condições experimentais.
A concentração de digitonin usado para isolamento mitocondrial deve ser otimizada para o tipo específico de célula. Como um detergente, digitonin permeabilizes as membranas celulares. A concentração óptima de digitonin permeabilizes eficientemente a membrana plasmática das células deixando as membranas mitocondriais intacta. Concentração muito baixa de digitonin causa alta contaminação dos extratos mitocondriais enquanto concentração demasiado alta danifica as membranas mitocondriais e reduz o rendimento total mitocondrial. A relação ideal digitonin/proteína (g/g) varia de 0,3 a 1. Análise ocidental do borrão de proteínas extraídas de pelotas e sobrenadantes pode ser usado para testar a concentração óptima de digitonin16.
Este protocolo não inclui proteína carregando controle sobre o immunoblot; Portanto, a concentração de proteína de complexos extraídos deve ser cuidadosamente medida pelo menos em triplica para assegurar o carregamento igual. Além disso, as amostras podem ser executadas em BN-página em repetições. Se o assembly de complexos OXPHOS seletivos é prejudicado, complexos não afetados podem servir como controles de carga.
A estimativa da massa molecular dos complexos proteína na BN-página18é um desafio. O protocolo atual não inclui o marcador de peso molecular; Portanto, para estimar o conjunto dos complexos OXPHOS, as amostras de controle contendo complexos afetados sempre devem ser incluídas na análise. As amostras de controle para BN-página são geralmente células do tipo selvagem ou não tratada.
O método apresentado aqui é otimizado para a detecção dos complexos da cadeia respiratória mitocondrial; no entanto, também pode ser aplicado para a avaliação da oligomerização de proteínas mitocondriais19. Além disso, a taxa de montagem de complexos OXPHOS pode ser estudada por esgotamento complexos subunidade mitocondrial codificadas de contendo de primeira cloranfenicol e então seguindo sua recuperação após a remoção do cloranfenicol10. Assim, o BN-página pode ser usada para avaliar os níveis de estado estacionário e montagem de OXPHOS para diferentes aplicações, incluindo o diagnóstico molecular de Doenças mitocondriais humanas9,11.

As mitocôndrias são organelas multifuncionais, desempenhando um papel importante na produção de energia, regulação do metabolismo celular, sinalização, apoptose, envelhecimento, etc.1,2,3. A produção de energia nas mitocôndrias baseia-se na função de fosforilação oxidativa que casais respiração com a síntese de ATP. Em células humanas, o sistema a fosforilação oxidativa mitocondrial (OXPHOS) é composto de cinco complexos. Complexos-IV criar um gradiente eletroquímico de protões no espaço intermembranar mitocondrial que é usado pelo complexo V para produzir ATP. Cada OXPHOS complexo é multiméricas e, exceto o complexo II, composto das subunidades codificadas por genes nucleares e mitocondriais. Todos os defeitos de componentes principais dos complexos OXPHOS causados por mutações ou estresse ambiental podem perturbar a montagem e funcionalidade do sistema de fosforilação oxidativa. Além disso, a montagem adequada de complexos OXPHOS funcionais requer um grande número de fatores de montagem a4,5,6.
Eletroforese em gel de poliacrilamida nativo azul (BN-PAGE) é uma técnica fundamental, permitindo a análise de complexos de proteína intacta e pode ser usado para estudar a montagem de complexos de OXPHOS. Primeiro, as mitocôndrias são isoladas das células por digitonin, que é um detergente suave que permeabilizes a membrana plasmática das células. Em seguida, usando maltoside de lauril, complexos OXPHOS são liberados de membranas mitocondriais. Por meio de eletroforese em gel de gradiente, os complexos OXPHOS são separados de acordo com sua massa. G-250 azul (não R-250) adicionado ao buffer de amostra e o buffer de catodo azul de Coomassie dissocia-se associações detergente-labile mas preserva a cadeia respiratória individual complexos intacta8. Durante a eletroforese, o buffer de catodo azul contendo o corante é substituído pelo buffer de cátodo sem tintura, que garante a transferência eficiente de complexos OXPHOS para a membrana PVDF8. Para visualizar os complexos de OXPHOS, a membrana PVDF sequencialmente é incubada com anticorpos correspondentes para as subunidades selecionadas dos cinco complexos OXPHOS.
O método descrito aqui com algumas modificações pode ser aplicado a qualquer células cultivadas. Além disso, este método pode ser usado para análise de complexos OXPHOS em mitocôndrias isoladas de amostras de tecido9. BN-página requer pelo menos 5-10 µ g de mitocôndrias para cada amostra por execução. Usando o método descrito aqui, 500.000 células como HEK293, SH-SY5Y de culto ou 143 células podem produzir aproximadamente 10 µ g de mitocôndrias. No entanto, uma quantidade suficiente de células para a análise BN depende do tipo de célula específica.
O método mais comum para estudar proteínas OXPHOS mitocondriais é SDS-PAGE e mancha ocidental. No entanto, SDS-PAGE permite estudar apenas subunidades OXPHOS individuais e, em contraste com a BN-página, não pode ser usado para avaliar o conjunto de complexos OXPHOS inteiras. Nativo-página clara separa complexos de proteínas em condições nativos sem a presença de corante carregado negativamente e tem uma resolução significativamente mais baixa comparado a BN-página. No entanto, clara nativo-página é mais suave do que a BN-página, então ele pode reter lábil supramoleculares assemblies de complexos de proteínas tais como razões OXPHOS que são dissociados sob as condições de BN-página10. Neste protocolo, o gradient gel é usado para separar complexos; no entanto, como alternativa, não-gradiente separação pode ser usada se o fabricante gradiente relativamente caro não é disponível11.
Importante, o método descrito aqui permite analisar o conjunto de complexos OXPHOS, enquanto a funcionalidade dos complexos não é avaliada. Uma alta resolução BN-página seguida de ensaio de atividade em-gel11 , bem como do ensaio de atividade enzimática espectrofotométrico dos complexos mitocondrial12 são técnicas eficientes para a análise funcional dos complexos OXPHOS. No entanto, esses dois métodos não ensaio a montagem de complexos de OXPHOS.
Assim, BN-PAGE é o método ideal para investigar o conjunto de complexos OXPHOS individuais. Por exemplo, algumas doenças mitocondriais, como Leber neuropatia óptica hereditária (LHON), encefalopatia mitocondrial, acidose láctica e episódios de curso-como (MELAS), estão associadas com montagem alterada de um ou mais componentes da OXPHOS sistema5. Usando o método de BN-página descrito aqui, os mecanismos moleculares das Doenças mitocondriais podem ser estudados.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:693px;" width="693">
	<tbody>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:316px;">100 mm cell plates</td>
			<td style="width:97px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:111px;">130182</td>
			<td style="width:169px;"></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">40% Acrylamide/Bis 37.5:1</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>161-0148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Aminocaproic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A2504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Ammonium persulfate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A3678</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Anti-ATP5A</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>14748</td>
			<td>Complex V subunit</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Anti-MTCOI</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>14705</td>
			<td>Complex VI subunit</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Anti-NDUFA9</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>14713</td>
			<td>Complex I subunit</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Anti-SDHA</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>14715</td>
			<td>Complex II subunit</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Anti-UQCRC2</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>14745</td>
			<td>Complex III subunit</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Bis-tris</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B7535</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Bradford protein assay kit</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>5000006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Cell scrapers</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>11597692</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Coomassie blue G250 (Serva Blue G)</td>
			<td>Serva</td>
			<td>35050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Digitonin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">DMEM</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>12-614F/12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">EDTA</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15575-038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">FBS</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10270106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Fetal bovine serum</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10270106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Glycerol</td>
			<td>(Sigma</td>
			<td>G5516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Gradient maker</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1654120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Lauryl maltoside (n-Dodecyl &#946;-D-maltoside)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D4641</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">L-glutamine</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>25030024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">L-glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">N,N,N&#8242;,N&#8242;-Tetramethylethylenediamine (TEMED)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T9281</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">PBS</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>BE17-516F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>17-602E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Penicillin/streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Power supply</td>
			<td>GE Healthcare&#160;</td>
			<td>EPS 301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Protease inhibitors</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>10137963</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Trans-blot turbo mini PVDF</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1704156</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Tricine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T9784</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Trypsin-EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15400054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Vertical electrophoresis apparatus</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1658004</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of mitochondrial respiratory chain complexes in cultured human cells using blue native polyacrylamide gel electrophoresis and immunoblotting

Respiração mitocondrial é executada por fosforilação oxidativa (OXPHOS) complexos dentro da mitocôndria. Fatores internos e ambientais podem perturbar o conjunto e estabilidade de complexos OXPHOS. Este protocolo descreve a análise dos complexos da cadeia respiratória mitocondrial por eletroforese em gel de poliacrilamida nativo azul (BN-página) no aplicativo para culturas de células humanas. Primeiro, as mitocôndrias são extraídas as células usando o digitonin e, em seguida, usando maltoside de lauril, os complexos OXPHOS intactos são isolados das membranas mitocondriais. Então, os complexos OXPHOS são resolvidos por eletroforese em gel de gradiente na presença de corante carregado negativamente, Coomassie azul, que impede a agregação da proteína e garante mobilidade electrophoretic de complexos de proteínas para o cátodo. Finalmente, os complexos OXPHOS são detectados pelo padrão immunoblotting. Assim, o BN-PAGE é uma técnica barata e conveniente que pode ser usada para avaliar o conjunto de complexos OXPHOS inteiras, em contraste com o SDS-PAGE básico que permite o estudo de apenas subunidades de complexos individuais OXPHOS.

Usando a página de BN, defeitos na montagem de complexos OXPHOS mitocondriais podem ser investigados. Figura 1a mostra o conjunto dos complexos da cadeia respiratória em células de neuroblastoma humano (SH-SY5Y) tratadas com cloranfenicol, que inibe especificamente a tradução de subunidades OXPHOS de DNA mitocondrial-codificado. Cloranfenicol esgotados os complexos OXPHOS que continha subunidades mitochondrially codificado (complexos I, III, IV; Figura 1A), enquanto o complexo II, que é exclusivamente codificado por genes nucleares, foi compensatorily upregulated. Complexo V não foi immunoblotted aqui.
Vários ciclos de congelamento e descongelamento destruam complexos OXPHOS. Figura 1B demonstra a degradação dos complexos OXPHOS pelos ciclos de congelamento e descongelamento. Mitocondriais complexos respiratórios na amostra 3 que foram submetidos a múltiplos ciclos de congelamento e descongelamento têm uma menor intensidade de banda e são deslocados em comparação com as mesmas amostras, que foram congeladas apenas uma vez. Uma imagem sem recortes borrão ocidental da Figura 1B é mostrada na Figura de suplementar 1.
A qualidade do gel é importante para bandas nítidas e claras. Figura 1 C mostra um immunoblot de um gel que não polimerizar-se bem. Descascamento da membrana também pode afetar a detecção de complexos de OXPHOS. Na Figura 1D, complexo eu foi detectado antes ou após o descascamento. Relação sinal / ruído é muito menor após o descascamento.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59269/59269fig1.jpg"> Figura 1. immunoblots BN-página de experiências bem sucedidas e sub-óptima. Complexos de depleção de OXPHOS (A) pelo inibidor da tradução mitocondrial. Células do neuroblastoma humano (SH-SY5Y) foram tratadas com cloranfenicol (CAP) por 48 horas. CTRL, células de controle sem tratamento de cloranfenicol. O painel inferior mostra a quantificação do immunoblot. O valor do controle é considerado como 1 (mostrado como uma linha tracejada). Os dados são apresentados como média ± DP, n = 3, * P desirmanada < 0,0001 em comparação com controle usando testes t de Student. (B) complexos de interrupção de OXPHOS por vários ciclos de congelamento e descongelamento. Amostras de 1-3 foram preparadas a partir de células humanas de osteossarcoma (143) nas mesmas condições. Número de amostras 1 e 2 e congelado derretido somente uma vez, enquanto o número de amostra 3 passou por quatro ciclos de congelamento e descongelamento. (C) BN-página immunoblots de complexos OXPHOS isolados de células HEK293. A calúnia das bandas é causada pela baixa qualidade do gel. (D) efeito de descascamento na detecção dos complexos OXPHOS. Deteção do complexo I em células de neuroblastoma humano (SH-SY5Y) antes e após a remoção da membrana mesma. Complexos de OXPHOS foram detectados usando anticorpo anti-NDUFA9 (complexo eu), anticorpo anti-SDHA (complexo II), anticorpo anti-UQCRC2 (complexo III) e anticorpo anti-COX1 (complexo IV). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59269/59269fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Tampão ou solução</td>
			<td>Composição</td>
			<td>Receita</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="4">3 x amortecedor gel</td>
			<td>1.5 o Ácido aminocaproico M</td>
			<td>3,94 g de Ácido aminocaproico</td>
		</tr>
<tr>
<td>150 mM tris-Bis</td>
			<td>0,63 g de Bis-tris</td>
		</tr>
<tr>
<td>O dH2</td>
			<td>Adicionar O dH2a 20 mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>pH 7.0</td>
			<td>Ajustar o pH a 7,0</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="4">Buffer de cátodo</td>
			<td>15 mM tris-Bis</td>
			<td>3,14 g de Bis-tris</td>
		</tr>
<tr>
<td>tricine 50mm</td>
			<td>8,96 g de tricine</td>
		</tr>
<tr>
<td>O dH2</td>
			<td>Adicionar O dH2a 1000 mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>pH 7.0</td>
			<td>Ajustar o pH a 7,0</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="5">Buffer de catodo azul</td>
			<td>azul de coomassie 0.02% G</td>
			<td>0,04 g de Serva azul G</td>
		</tr>
<tr>
<td>15 mM tris-Bis</td>
			<td rowspan="4">200 mL de tampão de cátodo</td>
		</tr>
<tr>
<td>tricine 50mm</td>
		</tr>
<tr>
<td>O dH2</td>
		</tr>
<tr>
<td>pH 7.0</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="3">Buffer de ânodo</td>
			<td>50 mM tris-Bis</td>
			<td>20,93 g</td>
		</tr>
<tr>
<td>O dH2</td>
			<td>Adicionar O dH2a 2000ml</td>
		</tr>
<tr>
<td>pH 7.0</td>
			<td>Ajustar o pH a 7,0</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="5">Buffer de mitocondrial</td>
			<td>1,75 o Ácido aminocaproico M</td>
			<td>0,5 mL de 3x do amortecedor gel</td>
		</tr>
<tr>
<td>75 mM tris-Bis</td>
			<td>0,5 mL de Ácido aminocaproico de 2m</td>
		</tr>
<tr>
<td>2 mM EDTA</td>
			<td>4 µ l de 500 mM de EDTA</td>
		</tr>
<tr>
<td>O dH2</td>
			<td>-</td>
		</tr>
<tr>
<td>pH 7.0</td>
			<td>-</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="3">Tampão de amostra</td>
			<td>Ácido aminocaproico 750mm</td>
			<td>0,94 mL de Ácido aminocaproico de 2m</td>
		</tr>
<tr>
<td>5% de comassie blue G</td>
			<td>0,125 g de Serva azul G</td>
		</tr>
<tr>
<td>O dH2</td>
			<td>Adicionar O dH2a 2,5 mL</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">Ácido aminocaproico 2m</td>
			<td>Ácido aminocaproico 2m</td>
			<td>2,62 g de Ácido aminocaproico</td>
		</tr>
<tr>
<td>O dH2</td>
			<td>Adicionar O dH2a 10ml</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabela 1. Buffers e soluções utilizados para BN-PAGE.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Géis nativos azuis</td>
			<td>Gel de separação 6%</td>
			<td>Gel de separação 15%</td>
			<td>Gel de empilhamento 4%</td>
		</tr>
<tr>
<td>3 x amortecedor gel</td>
			<td>3,3 mL</td>
			<td>3,3 mL</td>
			<td>1,64 mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>40% do acrilamido/Bis 37.5:1</td>
			<td>1,5 mL</td>
			<td>3,75 mL</td>
			<td>0,5 mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>O dH2</td>
			<td>5,14 mL</td>
			<td>0,93 mL</td>
			<td>2,77 mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Glicerol</td>
			<td>0</td>
			<td>2 mL</td>
			<td>0</td>
		</tr>
<tr>
<td>Persulfato de amónio de 10% *</td>
			<td>60 Μ l</td>
			<td>10 Μ l</td>
			<td>60 Μ l</td>
		</tr>
<tr>
<td>TEMED</td>
			<td>4 Μ l</td>
			<td>2 Μ l</td>
			<td>6 Μ l</td>
		</tr>
<tr>
<td>Volume total</td>
			<td>10 mL</td>
			<td>10 mL</td>
			<td>5 mL</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="4">* Faça sempre fresco persulfato de amónio de 10% em dH2O</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabela 2. Receitas de gel para BN-PAGE.
Complementar Figura 1. borrão ocidental uncropped imagem de Figura 1B. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59269/Supplementary_figure_1.eps" target="_blank">Clique aqui para baixar esta figura.</a>

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Analysis of Mitochondrial Respiratory Chain Complexes in Cultured Human Cells using Blue Native Polyacrylamide Gel Electrophoresis and Immunoblotting

Análise dos complexos de cadeia respiratória mitocondrial em células humanas cultivadas usando electroforese em Gel de poliacrilamida nativo azul e Immunoblotting

Este protocolo demonstra a análise dos complexos da cadeia respiratória mitocondrial por eletroforese em gel de poliacrilamida nativo azul. Aqui, é descrito o método aplicado para culturas de células humanas.

Mitochondrial respiration is performed by oxidative phosphorylation (OXPHOS) complexes within mitochondria. Internal and environmental factors can perturb ...

A eletroforese de gel de poliacrilamida nativa azul permite a análise de complexos em tato do sistema de fosforilação oxidativa mitocondrial. É uma técnica conveniente e barata que pode ser usada para sobrepor a montagem de complexos inteiros do sistema de fosforilação oxidativa mitocondrial. Para preparar os lises mitocondriais, primeiro use a solução PBS gelada para lavar suavemente as células uma vez.Raspe as células e pelota-as a 4 graus Celsius a 800 G por 10 minutos. Em seguida, lave a pelota celular duas vezes com o PBS gelado e a centrífuga a quatro graus Celsius a 800 G por 10 minutos. Em seguida, adicione 200 microliters de 100x inibidor de protease a 20 mililitros de PBS.Suspenda-as as células da mistura inibidora de protease PBS a uma concentração proteica final de cinco miligramas por mililitro. Para preparar 3,3 milimônios em PBS com inibidor de protease, dissolva quatro miligramas de digitonina em um mililitro de PBS a 100 graus Celsius até que nenhum precipitado seja visível. Esfrie no gelo imediatamente e adicione 10 microlitrais de 100x inibidor de protease a um mililitro da solução digitonin.Em seguida, adicione a mistura inibidora de protease de digitonina às células na concentração final de 1,65 mililitro. Misture bem e incuba no gelo por cinco minutos. Em seguida, adicione a mistura inibidora de protease PBS às células ao volume final de 1,5 mililitros.Centrífuga a 4 graus Celsius a 10.000 G por 10 minutos. Remova o supernatante e suspenda novamente a pelota mitocondrial no tampão mitocondrial. Prepare um mililitro de montá-loreal fresco de 10% em solução inibidora de PBS.Adicione 10% de montagem loreal às mitocôndrias na concentração final de 1%Incubar no gelo por pelo menos 15 minutos. Centrífuga a 4 graus Celsius a 20.000 G por 20 minutos. Colete o supernatante em um novo tubo e adicione o tampão de amostra.Para preparar o gel de gradiente para a página nativa azul, primeiro coloque o fabricante de gradiente em uma placa de mexida e conecte-o com uma tubulação flexível à bomba peristáltica. Coloque um conjunto de infusão com uma agulha na tubulação. Coloque um agitador magnético na câmara proximal do fabricante de gradientes e lave a tubulação com água destilada na velocidade máxima da bomba por 10 minutos.Em seguida, esvazie a tubulação e o fabricante de gradientes. Use uma pipeta para remover qualquer sobra de água destilada no canal entre as câmaras do fabricante de gradientes. Feche o canal e a tubulação com a válvula.Monte duas placas de vidro no suporte e coloque-a no suporte. Usando o orifício na parte inferior do suporte de gel, coloque a agulha conectada ao tubo entre as placas de vidro. Para fazer um gel de 8,3 por 7,3 centímetros, primeiro prepare soluções de 6% e 15% de gel e mantenha-as no gelo.Misture-os suavemente para evitar fazer bolhas de ar. Em seguida, carregue a extremidade proximal da câmara de tubos de misturador de gel gradiente com 2,6 mililitros do gel de 6% e a extremidade distal com 2,1 mililitros do gel de 15%. Em seguida, ligue o agitador magnético e abra a tubulação e o canal entre as câmaras do criador de gradientes.Ligue imediatamente a bomba peristáltica para cinco mililitros por minuto. Encha as placas de vidro e remova a agulha quando não houver gel na tubulação. Sobreponha suavemente o gel com água destilada e mantenha o gel à temperatura ambiente por pelo menos uma hora.Lave a tubulação imediatamente preenchendo as câmaras de gradiente com água destilada e usando a bomba peristáltica na velocidade máxima. Adicione seis mililitros da água destilada a três mililitros do tampão de gel 3x para fazer 1x tampão de gel. Com um papel filtro, remova suavemente a água destilada da superfície do gel.Lave a superfície do gel com o tampão de gel 1x e remova suavemente o tampão com o papel do filtro. Prepare gel de 4% de empilhamento de acordo com o manuscrito. Misture suavemente para evitar fazer bolhas de ar.Em seguida, coloque o pente entre as placas de vidro e despeje o gel de empilhamento sob o pente. Mergulhe o pente completamente. Deixe o gel de empilhamento polimerizar por pelo menos 30 minutos.Em seguida, retire o pente e use uma pipeta para lavar os poços com tampão de gel 1x. Para realizar a eletroforese de gel nativo azul, primeiro, adicione o tampão de cátodo azul ao de gel. Use uma pipeta para lavar e encher os poços com o tampão de cátodo azul.Em seguida, carregue de 5 a 30 microgramas de amostras de proteínas nos poços. Encha suavemente a fita de gel até a parte superior com o tampão de cátodo azul e o tanque com o tampão de ânodo. Primeiro, execute o gel a uma tensão constante de 40 volts por 15 minutos.Em seguida, aumente a tensão para 80 volts. Execute o gel até que o corante atinja 2/3 do comprimento do gel. Substitua o tampão do cátodo azul pelo tampão do cátodo e continue a eletroforese até que a frente de corante escora o gel.Recupere as placas de vidro e transfira as proteínas para a membrana PVDF por manchas semi-secas. Use uma tensão constante de 25 volts e uma corrente limitada a um ampere por 30 minutos. A montagem dos complexos da cadeia respiratória nas células neuroblastoma humanas foi inibida no tratamento de clororamfenícol em comparação com as células de controle sem tratamento.Em contraste, os complexos codificados pelos genes nucleares foram regulados. A degradação dos complexos de fosforilação oxidativa foi observada em múltiplos ciclos de congelamento. A qualidade do gel pode afetar a detecção dos complexos de fosforilação oxidativa.Além disso, a desmontagem da membrana reduziu a relação sinal-ruído. Ao realizar o procedimento, é importante lembrar de realizar uma preparação simples e eletroforese de gel em condições frias para preservar os complexos OXPHOS em tato. Seguindo a página nativa azul, uma página de SDS de segunda dimensão pode ser aplicada para estudar as subumidas proteicas dos complexos da cadeia respiratória.A página nativa azul permite que os pesquisadores estudem a montagem de complexos e até mesmo super-complexos do sistema de fosforilação oxidativa.

Research

JoVE Journal

Biology

Denaturing Gradient Gel Electrophoresis (DGGE)

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Eletroforese em Gel de gradiente desnaturante (DGGE)

Biologia

Probing for Mitochondrial Complex Activity in Human Embryonic Stem Cells

Sondagem para a Atividade Complexo mitocondrial em células estaminais embrionárias humanas

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De alta resolução de imagem Time-lapse e análise automatizada de microtúbulos Dynamics em Viver umbilical humano Células Endoteliais da Veia

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes ...

Purification of Native Complexes for Structural Study Using a Tandem Affinity Tag Method

Purificação de Native Complexos de estudo estrutural usando um método Tag Tandem Affinity

Affinity purification approaches have been successful in isolating native complexes for proteomic characterization. Structural heterogeneity and a degree ...