Name: analysis of mitochondrial respiratory chain complexes in cultured human cells using blue native polyacrylamide gel electrophoresis and immunoblotting
Uploaded: 2019-02-12T15:00:00
Duration: 7 min 55 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Mitochondrial Respiratory Chain Complexes in Cultured Human Cells using Blue Native Polyacrylamide Gel Electrophoresis and Immunoblotting at JoVE.

Библиотека университета Хельсинки поблагодарил за финансовую поддержку в публикации.

spaNOTE: этот протокол основан на связанной публикации Hilander et al.13 .
1. Подготовка буферов и решения
Примечание: Все буферы и решения, используемые в протоколе кратко излагаются в таблице 1. Данного тома буферов достаточно для подготовки и запуска 10 образцов. Все буферы могут храниться при температуре + 4 ° C на срок до одного года.
<ol><li>Подготовка 20 мл 3 x гель буфер, содержащий 1,5 М Аминокапроновая кислота, 150 мм бис трис в дистиллированной воде (dH2O). Отрегулируйте пэ-аш до 7.0.</li>
	<li>Подготовка 10 мл 2 М Аминокапроновая кислота в dH2O.</li>
	<li>Подготовка 1 мл митохондриальной буфера, объединяя следующие: 0,5 мл 3 x гель буфера, 0,5 мл 2 М Аминокапроновая кислота и 4 мкл 500 мм ЭДТА.</li>
	<li>Подготовка 1000 мл катод буфер, содержащий 15 мм бис-трис и 50 мм Трицин dH2O. Отрегулируйте пэ-аш до 7.0.<ol>
<li>Подготовка 200 мл синий катод буфера путем добавления 0,04 г G-250 Кумасси синий 200мл катод буфера.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Подготовка 1000 мл Анодный буфер, содержащий 50 мм бис трис dH2O. Отрегулируйте пэ-аш до 7.0.</li>
	<li>Подготовить 2,5 мл буфера выборки, содержащий 750 мм Аминокапроновая кислота и 5% Кумасси синим G-250 в dH2O.</li>
</ol>2. Подготовка митохондриальной лизатов
<ol><li>Пластина клетки за день до коллекции. Для HEK293 или 143B клеток использование Дульбекко изменение средних орла (DMEM) с плода бычьим сывороточным 10%, 1% L-глютамин, 100 мг/мл пенициллина и стрептомицина 100 мг/мл. Рост клеток в инкубатор культуры клеток при 37 ° C в 5% CO2 увлажненные атмосфере. Убедитесь, что есть по крайней мере 500 000 клетки для каждого образца в день сбора.</li>
	<li>Осторожно промойте клетки один раз с ледяной PBS. Избегайте отключения клетки от плиты. Скрип клетки и Пелле их на 800 x g 10 мин при температуре + 4 ° C.</li>
	<li>Помыть лепешка клетки дважды с ледяной PBS и центрифуги как в шаге 2.2. Измерьте концентрацию белка с методом Брэдфорд, с использованием коммерческих комплект. Пелле клетки на 800 x g 10 мин при температуре + 4 ° C. Примечание: После сбора клеток, выполните все шаги при + 4 ° C и делать не вихря.</li>
	<li>Подготовка 20 мл PBS с ингибитором протеазы, добавив 200 мкл ингибитора протеазы 100 x 20 мл ФСБ. Держите на льду. Ресуспензируйте клетки в PBS с ингибитором протеазы окончательный белка концентрацию 5 мг/мл.<ol>
<li>Чтобы вычислить объем PBS с ингибитором протеазы, необходимых для Ресуспензируйте клетки на 5 мг/мл, Рассчитайте количество белка в каждом образце. Для этого расчета используйте концентрацию протеина измеряется в шаге 2.3 и объем PBS для Ресуспензируйте клетки после стирки на шаге 2.3.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Готовим 1 мл digitonin 3,3 мм в PBS с ингибитором протеазы. Добавьте digitonin 3,3 мм в конечной концентрации 1,65 мм. Хорошо перемешайте и инкубировать на льду на 5 мин.<ol>
<li>Подготовить 1 мл digitonin 3,3 мм в PBS с ингибитором протеазы, Растворите 4 мг, digitonin в 1 мл PBS на 100 ° C до тех пор, пока не осадок видимым и прохладный на льду немедленно. Добавьте 10 мкл ингибитора протеазы 100 x 1 мл digitonin раствора. Примечание: Используйте только свежий раствор digitonin. Предупреждение: Digitonin токсичных! Используйте маски, перчатки и халате.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Добавьте PBS с ингибитора протеиназы (подготовленных на шаге 2.4) окончательный объем 1,5 мл. Центрифуга на 10000 x g 10 мин на + 4 ° C. Удалите супернатант. В этом шаге гранулированных митохондрий.</li>
	<li>Ресуспензируйте митохондриальной Пелле в митохондриальной буфера. Объем митохондриальной буфера составляет половину объема PBS на шаге 2.4.</li>
	<li>Подготовьте свежие maltoside лаурил 10% в PBS, содержащий ингибитор протеазы (подготовленных на шаге 2.4). 1 мл достаточно для 10 образцов. Добавьте 10% лаурил maltoside в конечной концентрации 1%. Инкубируйте на льду 15 мин (этот шаг может быть дольше, вплоть до нескольких часов).</li>
	<li>Центрифуга на 20000 x g 20 мин на + 4 ° C. Соберите супернатант в новую трубу. Измерьте концентрацию протеина Брадфорд методом с использованием комплекта. Добавьте буфер образца, половина объема лаурил maltoside, используемые на шаге 2.8 тома. Образцы можно хранить при температуре-80 ° C на срок до 6 месяцев.</li>
</ol>3. Подготовка градиентного гель BN-страницы
<ol><li>Залейте градиент гель для БН-страница при комнатной температуре. Место градиента чайник на плите перемешать и подключить его с гибкие шланги перистальтического насоса. Прикрепите инфузионный набор с иглой для труб. Место магнитной мешалкой в проксимальном палаты создатель градиента. Вымойте трубки с dH2O на скорость максимальная насоса за 10 мин.</li>
	<li>Очистите трубку и создатель градиента. Использование пипетки для удаления любых оставшихся dH2O в канале между палатами создатель градиента. Закройте канал и труб с клапаном.</li>
	<li>С помощью литья кадра и зажимы собрать две стеклянные пластины в держатель, который имеет отверстие на дне, и поместите его на стенде. Убедитесь, что это более или менее на прямой поверхности с водного баланса. Место иглы подключен к трубе между пластинами стекла.</li>
	<li>Подготовка решения гелем 6% и 15% (Таблица 2). Держите на льду. Добавить Аммония персульфат (APS) и tetramethylenediamine (TEMED) (они начинают полимеризации) последний. Смесь осторожно, чтобы избежать воздушных пузырей.</li>
	<li>Загрузите проксимальный конец градиента гель смеситель трубки камеры с 6% гель и дистального конца 15% гелем. Общий объем геля должен быть равен объем отделяя гель между пластинами стекла. Таким образом используйте 2,6 мл 6% геля и 2.1 мл 15% гель для градиента гель смеситель для одной 8.3 x 7,3 см размеру геля.</li>
	<li>Перейдите на магнитную мешалку и откройте труб и каналов между палатами создатель градиента. Сразу же включите насос перистальтический до 5 мл/мин заполнить стеклянные пластины и не позволяют пузыри, чтобы ввести гель. Удалите иглу, когда есть не гель в трубке.</li>
	<li>Аккуратно наложение гель с dH2O. держать при комнатной температуре по крайней мере 1 час для полимеризации геля.</li>
	<li>Сразу же после заливки геля, промойте трубы, заполнив градиента камер с dH2O и с использованием перистальтического насоса на максимальной скорости. При подготовке двух и более гели, всегда чистые системы между ними.</li>
	<li>Подготовка 1 x гель буфера путем смешивания 3 мл 3 x гель буфера и добавить 6 мл dH2O. Remove dH2O от поверхности геля с фильтровальную бумагу осторожно. Промойте поверхность геля с 1 x гель буфера. Осторожно извлеките 1 x гель буфер с фильтровальной бумаги.<ol>
<li>Избегайте волокон из фильтровальной бумаги на геле. Для обеспечения этого, разрежьте бумагу на мелкие кусочки с ножницами, но не Оторвите бумагу.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Поместите гребенку между пластинами стекла, но не погружайте его полностью, чтобы иметь возможность залить штабелируя гель под гребенку. Подготовка 4%, укладка гель (Таблица 2). Добавить APS и TEMED последний как они начинают полимеризации легко. Смесь осторожно избегая пузырьков воздуха.</li>
	<li>Наложение штабелируя гель, избегая пузыри под расческу и полностью погрузите насадку. Пусть штабелируя гель полимеризоваться, по крайней мере 30 минут снимите гребень и Промыть лунки с 1 x гель буфер с помощью пипетки.<ol>
<li>После полимеризации гель может храниться при температуре + 4 ° C на пару дней. Чтобы хранить гель, оберните геля в бумаги, пропитанной с dH2O и пластиковые пленки для предотвращения высыхания геля.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. синий родной гель-электрофорез
Примечание: Для предотвращения деградации OXPHOS комплексов запустить электрофореза при + 4 ° C. Используйте предварительно охлажденные буферов.
<ol><li>Загрузите гель кассету с буфером синий катода до нижней части скважины. Загрузка образцов легче, когда кассета заполнена не в верхней. Промыть скважин с голубой катод буфера, а затем заполнить скважин с голубой катод буфер с помощью пипетки.</li>
	<li>Загрузите образцы (5-30 мкг белка) в скважинах. Аккуратно заполните гель кассету в верхней голубой катод буфер и бак с анодном буфере.</li>
	<li>Побегите гель 15 мин при постоянном напряжении 40 V. Затем увеличить напряжение до 80 V (или использовать постоянный ток 6 мА), не превышает 10 мА. Побегите гель до тех пор, пока краска достигает 2/3 длины геля.</li>
	<li>Замените синий катод буфер буфера катода и продолжить электрофореза, до тех пор, пока краска фронт истекло. В общей сложности электрофорез занимает около 3 часов.</li>
	<li>Извлечение стеклянные пластины и передать белки винилидена фторида (PVDF) мембраны полусухим промокательной. Используйте постоянное напряжение 25 вольт и ток ограничивается 1,0 A за 30 мин.<ol>
<li>Кроме того используйте мокрый промокательной передать PVDF мембрану OXPHOS комплексов.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Продолжите блокирование мембраны и Антитело инкубации согласно стандартным immunoblotting протокол. Использование основного антитела против подразделений OXPHOS комплексов последовательно. Примечание: К примеру, используйте антитела анти NDUFA9 (1: 2000) для комплекса I, антитела анти SDHA (1: 2000) для сложных II, антитела анти UQCRC2 (1: 1000) для сложных III, антитела (1: 2000) анти-COX1, так для сложных IV и анти ATP5A антитела (1: 2000) для комплекса V. Список антител представлена в Таблице материалов.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Osellame, L. D., Blacker, T. S., Duchen, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+and+molecular+mechanisms+of+mitochondrial+function.">Cellular and molecular mechanisms of mitochondrial function.</a> Best Practice, Research. Clinical Endocrinology &amp; Metabolism. 26 (6), 711-723 (2012).</li><li>Jang, J. Y., Blum, A., Liu, J., Finkel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+mitochondria+in+aging.">The role of mitochondria in aging.</a> The Journal of Clinical Investigation. 128 (9), 3662-3670 (2018).</li><li>Nunnari, J., Suomalainen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria:+in+sickness+and+in+health.">Mitochondria: in sickness and in health.</a> Cell. 148 (6), 1145-1159 (2012).</li><li>Cogliati, S., Lorenzi, I., Rigoni, G., Caicci, F., Soriano, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+Mitochondrial+Electron+Transport+Chain+Assembly.">Regulation of Mitochondrial Electron Transport Chain Assembly.</a> Journal of Molecular Biology. , (2018).</li><li>Fernandez-Vizarra, E., Tiranti, V., Zeviani, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembly+of+the+oxidative+phosphorylation+system+in+humans:+what+we+have+learned+by+studying+its+defects.">Assembly of the oxidative phosphorylation system in humans: what we have learned by studying its defects.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1793 (1), 200-211 (2009).</li><li>Signes, A., Fernandez-Vizarra, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembly+of+mammalian+oxidative+phosphorylation+complexes+I-V+and+supercomplexes.">Assembly of mammalian oxidative phosphorylation complexes I-V and supercomplexes.</a> Essays in Biochemistry. 62 (3), 255-270 (2018).</li><li>Schagger, H., von Jagow, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blue+native+electrophoresis+for+isolation+of+membrane+protein+complexes+in+enzymatically+active+form.">Blue native electrophoresis for isolation of membrane protein complexes in enzymatically active form.</a> Analytical Biochemistry. 199 (2), 223-231 (1991).</li><li>Wittig, I., Braun, H. P., Schagger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blue+native+PAGE.">Blue native PAGE.</a> Nature Protocols. 1 (1), 418-428 (2006).</li><li>Gotz, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exome+sequencing+identifies+mitochondrial+alanyl-tRNA+synthetase+mutations+in+infantile+mitochondrial+cardiomyopathy.">Exome sequencing identifies mitochondrial alanyl-tRNA synthetase mutations in infantile mitochondrial cardiomyopathy.</a> American Journal of Human Genetics. 88 (5), 635-642 (2011).</li><li>Wittig, I., Schagger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advantages+and+limitations+of+clear-native+PAGE.">Advantages and limitations of clear-native PAGE.</a> Proteomics. 5 (17), 4338-4346 (2005).</li><li>Luo, X., Wu, J., Jin, Z., Yan, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-Gradient+Blue+Native+Polyacrylamide+Gel+Electrophoresis.">Non-Gradient Blue Native Polyacrylamide Gel Electrophoresis.</a> Current Protocols in Protein Science. 87, 19.29.1-19.29.12 (2017).</li><li>Jha, P., Wang, X., Auwerx, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+Mitochondrial+Respiratory+Chain+Supercomplexes+Using+Blue+Native+Polyacrylamide+Gel+Electrophoresis+(BN-PAGE).">Analysis of Mitochondrial Respiratory Chain Supercomplexes Using Blue Native Polyacrylamide Gel Electrophoresis (BN-PAGE).</a> Current Protocols in Mouse Biology. 6 (1), 1-14 (2016).</li><li>Preston, C. .. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aging-induced+alterations+in+gene+transcripts+and+functional+activity+of+mitochondrial+oxidative+phosphorylation+complexes+in+the+heart.">Aging-induced alterations in gene transcripts and functional activity of mitochondrial oxidative phosphorylation complexes in the heart.</a> Mechanisms of Ageing and Development. 129 (6), 304-312 (2008).</li><li>Hilander, T., Konovalova, S., Terzioglu, M., Tyynismaa, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+Mitochondrial+Protein+Synthesis:+De+Novo+Translation,+Steady-State+Levels,+and+Assembled+OXPHOS+Complexes.">Analysis of Mitochondrial Protein Synthesis: De Novo Translation, Steady-State Levels, and Assembled OXPHOS Complexes.</a> Current Protocols In Toxicology. , e56 (2018).</li><li>Lobo-Jarne, T., Ugalde, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Respiratory+chain+supercomplexes:+Structures,+function+and+biogenesis.">Respiratory chain supercomplexes: Structures, function and biogenesis.</a> Seminars in Cell &amp; Developmental Biology. 76, 179-190 (2018).</li><li>Fiala, G., Schamel, W. W., Blumenthal, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blue+native+polyacrylamide+gel+electrophoresis+(BN-PAGE)+for+analysis+of+multiprotein+complexes+from+cellular+lysates.">Blue native polyacrylamide gel electrophoresis (BN-PAGE) for analysis of multiprotein complexes from cellular lysates.</a> Journal of Visualized Experiments. (48), (2011).</li><li>Itahana, K., Clegg, H. V., Zhang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ARF+in+the+mitochondria:+the+last+frontier?.">ARF in the mitochondria: the last frontier?.</a> Cell Cycle (Georgetown, Tex). 7 (23), 3641-3646 (2008).</li><li>Wittig, I., Beckhaus, T., Wumaier, Z., Karas, M., Schagger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+estimation+of+native+proteins+by+blue+native+electrophoresis:+principles+and+practical+hints.">Mass estimation of native proteins by blue native electrophoresis: principles and practical hints.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics. 9 (10), (2010).</li><li>Konovalova, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Redox+regulation+of+GRPEL2+nucleotide+exchange+factor+for+mitochondrial+HSP70+chaperone.">Redox regulation of GRPEL2 nucleotide exchange factor for mitochondrial HSP70 chaperone.</a> Redox Biology. 19, 37-45 (2018).</li><li>Konovalova, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exposure+to+arginine+analog+canavanine+induces+aberrant+mitochondrial+translation+products,+mitoribosome+stalling,+and+instability+of+the+mitochondrial+proteome.">Exposure to arginine analog canavanine induces aberrant mitochondrial translation products, mitoribosome stalling, and instability of the mitochondrial proteome.</a> The International Journal of Biochemistry &amp; Cell Biology. 65, 268-274 (2015).</li><li>Ahmed, S. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+a+quantitative+quadruple+immunofluorescent+assay+to+diagnose+isolated+mitochondrial+Complex+I+deficiency.">Using a quantitative quadruple immunofluorescent assay to diagnose isolated mitochondrial Complex I deficiency.</a> Scientific Reports. 7 (1), (2017).</li></ol>

Отсутствие конфликта интересов объявил.

Одним из наиболее важных частей протокола является сохранить нетронутыми OXPHOS комплексов во время подготовки проб, хранения и электрофорез геля. Таким образом митохондрии, должен быть изолирован на + 4 ° C и образцов не должен пройти циклов замораживания оттаивания. OXPHOS комплексы допускает только один цикл замораживания оттаивания в течение всей процедуры. Несколько циклов замораживания оттаивания уничтожить OXPHOS комплексов (рис. 1B). Управления и экспериментальных образцов, которые необходимо сравнить должны быть готовы параллельно избежать каких-либо различий в условиях хранения, которые могут дать результаты заблуждение. Если это не возможно для выполнения всех шагов протокола параллельно с всех образцов, мы рекомендуем заморозить промывают клеток окатышей на-80 ° C (шаг 1.4 в этом протоколе) и позднее выполнять остальные протокола для всех образцов вместе по крайней мере до elec гель trophoresis. Особое внимание должно уделяться чистоты электрофорез аппарата (танк, кассета). Если же аппарат используется для SDS-PAGE, очень хорошо Вымойте перед BN-страницы. Любые остаточные ИКБ может привести к диссоциации OXPHOS комплексов во время электрофореза.
Высокое качество градиента гели являются другой важной частью протокола. Сборный гели для голубой родной страницы являются коммерчески доступными; Однако это не рекомендуется использовать их, поскольку буферов, используемых для коммерческих гели могут иметь состав, который отличается от образца буферов. Градиент геля использованы здесь (6-15%) является оптимальным для разделения отдельных OXPHOS комплексов. Чтобы обнаружить более высокого порядка супрамолекулярные структуры OXPHOS, также известный как дыхательной цепи supercomplexes14, некоторые оптимизации является требуется11.
Для визуализации OXPHOS комплексы используют специфические антитела последовательно, на основе их свойств. Например используйте сначала антител, что последний дает слабый сигнал и антитела с наиболее сильным сигналом. Это важно, поскольку зачистки ослабляет обнаружения (рис. 1 d). Состав комплексов дыхательной цепи могут быть исследованы, если после BN-страница геля подвергается второго измерения SDS-PAGE15.
Протокол, описанные здесь предполагает последовательно с использованием антител против отдельных OXPHOS комплексов. Однако коммерчески доступных OXPHOS антитела коктейль может использоваться для обнаружения всех пяти OXPHOS комплексы одновременно. Тем не менее чтобы иметь возможность обнаружить неполно собрал OXPHOS комплексов и определить их самобытности, антитела против отдельных комплексов OXPHOS должен использоваться последовательно. Этот шаг является длительным; Однако это может быть важно для тестирования новых экспериментальных условий и моделей.
Концентрация digitonin, используемых для митохондриального изоляции должна быть оптимизирована для конкретной ячейки типа. Как моющее средство digitonin permeabilizes клеточной мембраны. Оптимальная концентрация digitonin эффективно permeabilizes плазматической мембраны клеток, оставляя нетронутыми митохондриальной мембраны. Слишком низкая концентрация digitonin вызывает высокое загрязнение митохондриальной экстрактов, пока слишком высокая концентрация повреждения митохондриальных мембран и уменьшает общее митохондриальной доходность. Оптимальное digitonin/белков соотношение (g/g) колеблется от 0,3 до 1. Западный анализ помаркой белков, извлеченные из окатышей и supernatants может использоваться для тестирования оптимальная концентрация digitonin16.
Этот протокол не содержит белка загрузки элемента управления на immunoblot; Таким образом концентрация белка извлеченные комплексов следует тщательно оценивать по крайней мере в triplicates для обеспечения равных загрузки. Кроме того образцы можно запустить в БН-страницы в реплицирует. Если Ассамблея селективного OXPHOS комплексов нарушается, неизменным комплексов может служить в качестве управления загрузки.
Оценка молекулярной массы белковых комплексов в БН-страница является сложной задачей,18. Текущий протокол не включают в себя маркер молекулярного веса; Таким образом чтобы оценить Ассамблея OXPHOS комплексов, контрольные образцы, содержащие не влияет комплексов должен всегда быть включен в анализ. Контрольные образцы для БН-страницы, как правило, неочищенные или дикого типа клеток.
Метод, представленный здесь оптимизирован для обнаружения дыхательной цепи митохондрий комплексов; Однако он также может применяться для оценки олигомеризации митохондриальных протеинов19. Кроме того Ассамблея ставка OXPHOS комплексов могут быть изучены первый озоноразрушающие митохондриальной кодировке Субблок содержащие комплексы, хлорамфеникола и затем после их восстановления после удаления хлорамфеникола10. Таким образом BN-страница может использоваться для оценки уровня устойчивого состояния и Ассамблеи OXPHOS для различных приложений, включая молекулярной диагностики человека митохондриальных нарушений9,11.

Митохондрии являются многофункциональными органеллы, играет важную роль в производстве энергии, регуляции клеточного метаболизма, сигнализаторы, апоптоз, старение,2,1,и т.д.3. Производство энергии в митохондриях полагается на функции окислительного фосфорилирования, пары дыхания с синтез АТФ. В клетках человека митохондриальных Оксидативное фосфорилирование системы (OXPHOS) состоит из пяти комплексов. Комплексы-IV создание электрохимических протонного градиента в пространстве митохондриальных межмембранное, который используется для производства АТФ, комплекс V. Каждый комплекс OXPHOS-multimeric и, за исключением комплекс II, состоящий из субъединиц, кодируется как ядерных, так и митохондриальных генов. Любые дефекты в основные компоненты OXPHOS комплексов, вызванные мутации или экологический стресс может повлиять Ассамблеи и функциональность системы окислительного фосфорилирования. Кроме того надлежащее Ассамблея функциональных комплексов OXPHOS требуется большое количество Ассамблеи факторы4,5,6.
Синий родной гель полиакриламида электрофореза (БН-PAGE) является включение анализа нетронутыми белковых комплексов фундаментальных техника и могут быть использованы для изучения Ассамблея OXPHOS комплексов. Во-первых митохондрии изолированы от клеток, digitonin, который является мягким моющим средством, которое permeabilizes плазматической мембраны клеток. Затем используя maltoside лаурилсульфат, OXPHOS комплексы освобождаются от митохондриальной мембраны. С помощью градиента электрофорез, OXPHOS комплексы разделены согласно их массы. Кумасси синий G-250 (не R-250) добавлены в буфер образца и синий катод буфера разъединяет моющее средство лабильного ассоциаций, но сохраняет отдельные дыхательной цепи комплексы нетронутыми8. Во время электрофорез синий катод буфер, содержащий краситель заменяется на катод буфера без красителя, который обеспечивает эффективную передачу OXPHOS комплексов PVDF мембрану8. Чтобы визуализировать OXPHOS комплексов, PVDF мембрану последовательно инкубировали с антителами, соответствующие выбранной подразделений пяти OXPHOS комплексов.
Метод, описанный здесь, с некоторыми изменениями может применяться к любой культивируемых клеток. Кроме того этот метод может использоваться для анализа OXPHOS комплексов в митохондриях, изолированных от образцов ткани9. BN-страница требует по крайней мере 5-10 мкг митохондрий для каждого образца, в перспективе. Используя метод, описанный здесь, 500000 культивируемых клеток, таких как HEK293, SH-SY5Y или 143B клетки могут принести около 10 мкг митохондрий. Однако достаточное количество клеток для анализа млрд зависит от типа конкретные ячейки.
Наиболее распространенным способом для изучения белков митохондриальных OXPHOS, SDS-PAGE и Западный blotting. Однако SDS-PAGE позволяет изучать только отдельные подразделения OXPHOS и, в отличие от БН-страницы, не может использоваться для оценки Ассамблея весь OXPHOS комплексов. Ясно, родной страница отделяет белковых комплексов в родной условий отрицательно заряженных красителя без присутствия и имеет значительно более низкое разрешение по сравнению с БН-страницы. Однако ясно родной страница мягче, чем BN-страницы так, что он может сохранить лабильной супрамолекулярные сборки белковых комплексов, таких как OXPHOS supercomplexes, которые отделены под условия BN-страница10. В этом протоколе градиент гель используется для разделения комплексов; Однако в качестве альтернативы,-градиент разделения может использоваться если относительно дорогих градиента maker является не наличие11.
Важно, в описанный здесь метод позволяет анализировать Ассамблея OXPHOS комплексов, в то время как функциональность комплексов не оценивается. Высоким разрешением BN-страница следуют в гель деятельности пробирного11 , а также пробирного спектрофотометрические ферментативной активности митохондриальных комплексов12 являются эффективные методы для функционального анализа OXPHOS комплексов. Однако оба этих методов не пробирного Ассамблея OXPHOS комплексов.
Таким образом BN-страница является оптимальный метод расследовать Ассамблея отдельных OXPHOS комплексов. Например некоторые митохондриальных расстройств, таких как Лебер наследственной оптической невропатии (LHON), митохондриальных энцефалопатия с молочно-кислый ацидоз и инсульта подобных эпизодов (MELAS), связаны с изменены Ассамблеей одного или более компонентов OXPHOS система5. С помощью BN-страницы метод, описанный здесь, могут быть изучены молекулярных механизмов митохондриальных болезней.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:693px;" width="693">
	<tbody>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:316px;">100 mm cell plates</td>
			<td style="width:97px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:111px;">130182</td>
			<td style="width:169px;"></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">40% Acrylamide/Bis 37.5:1</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>161-0148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Aminocaproic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A2504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Ammonium persulfate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A3678</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Anti-ATP5A</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>14748</td>
			<td>Complex V subunit</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Anti-MTCOI</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>14705</td>
			<td>Complex VI subunit</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Anti-NDUFA9</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>14713</td>
			<td>Complex I subunit</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Anti-SDHA</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>14715</td>
			<td>Complex II subunit</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Anti-UQCRC2</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>14745</td>
			<td>Complex III subunit</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Bis-tris</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B7535</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Bradford protein assay kit</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>5000006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Cell scrapers</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>11597692</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Coomassie blue G250 (Serva Blue G)</td>
			<td>Serva</td>
			<td>35050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Digitonin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">DMEM</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>12-614F/12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">EDTA</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15575-038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">FBS</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10270106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Fetal bovine serum</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10270106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Glycerol</td>
			<td>(Sigma</td>
			<td>G5516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Gradient maker</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1654120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Lauryl maltoside (n-Dodecyl &#946;-D-maltoside)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D4641</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">L-glutamine</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>25030024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">L-glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">N,N,N&#8242;,N&#8242;-Tetramethylethylenediamine (TEMED)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T9281</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">PBS</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>BE17-516F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>17-602E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Penicillin/streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Power supply</td>
			<td>GE Healthcare&#160;</td>
			<td>EPS 301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Protease inhibitors</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>10137963</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Trans-blot turbo mini PVDF</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1704156</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Tricine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T9784</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Trypsin-EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15400054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Vertical electrophoresis apparatus</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1658004</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of mitochondrial respiratory chain complexes in cultured human cells using blue native polyacrylamide gel electrophoresis and immunoblotting

Митохондриальное дыхание осуществляется комплексы окислительного фосфорилирования (OXPHOS) в митохондриях. Внутренние и экологические факторы могут повлиять Ассамблеи и стабильность OXPHOS комплексов. Этот протокол описывает Анализ митохондриальной дыхательной цепи комплексов, синий родной гель полиакриламида электрофореза (БН-страница) в приложении для культивируемых клеток человека. Во-первых митохондрии извлекаются из клетки, с помощью digitonin, а затем с помощью maltoside лаурилсульфат, нетронутыми OXPHOS комплексы изолированы от митохондриальной мембраны. OXPHOS комплексы, затем решаются градиента гель-электрофорез в присутствии отрицательно заряженных краситель, Кумасси синий, который препятствует агрегации белков и гарантирует электрофоретической подвижности белковых комплексов к катоду. Наконец OXPHOS комплексы определяются стандартные immunoblotting. Таким образом BN-страница является удобный и недорогой метод, который может использоваться для оценки Ассамблея весь OXPHOS комплексов, в отличие от основных SDS-PAGE, позволяя исследование только отдельные OXPHOS комплекс субъединиц.

BN-странице, могут быть исследованы дефекты в Ассамблее митохондриальной OXPHOS комплексов. Рисунок 1A показывает Ассамблея дыхательной цепи комплексов в человеческой нейробластомы клеток (SH-SY5Y) относились с хлорамфениколом, который конкретно запрещает преобразование митохондриальной ДНК кодировке OXPHOS подразделений. Хлорамфеникол обедненного OXPHOS комплексов, которые содержали mitochondrially кодировке субблоков (комплекс I, III, IV; Рисунок 1A), в то время как комплекс II, который кодируется исключительно ядерных генов, беспрепятственно был upregulated. Комплекс V был не immunoblotted здесь.
Несколько циклов замораживания оттаивания уничтожить OXPHOS комплексов. Рисунок 1B демонстрирует деградации OXPHOS комплексов циклов замораживания оттаивания. Митохондриальной дыхательных комплексов в примере 3, которые подверглись несколько циклов замораживания оттаивания имеют снижение интенсивности группы и сдвинуты по сравнению с же образцы, которые были заморожены только один раз. Невозделываемых иммуноблоттинга изображение Рисунок 1B приводится в дополнительных Рисунок 1.
Качество гель имеет важное значение для четкого и полос. Рисунок 1 C показывает immunoblot от гель, который не сделал хорошо полимеризоваться. Также зачистки мембраны может повлиять на определение OXPHOS комплексов. На рисунке 1 Dсложные я был обнаружен до или после зачистки. Соотношение сигнал-шум намного ниже после зачистки.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59269/59269fig1.jpg"> Рисунок 1. BN-страница иммуноблотов от успешных и субоптимальных экспериментов. (A) истощение OXPHOS комплексов ингибиторов митохондриальных перевода. Человеческой нейробластомы клетки (SH-SY5Y) относились с хлорамфениколом (CAP) на 48 часов. CTRL, клетки управления без лечения хлорамфеникола. Нижней панели показывает количественная оценка immunoblot. Значение элемента управления берется как 1 (отображается как пунктирная линия). Данные представлены как означает ± SD, n = 3, * P < 0,0001 по сравнению с использованием управления непарные студента t тесты. (B) нарушение OXPHOS комплексы на несколько циклов замораживания оттаивания. Образцы 1-3 были подготовлены от человека остеосаркома клеток (143B) в тех же условиях. Образцы номер 1 и 2 были заморожены и плавится только один раз, в то время как пример №3 прошли четыре циклов замораживания оттаивания. (C) BN-страница иммуноблотов OXPHOS комплексов, изолированный от HEK293 клеток. Смазывание полос обусловлено низкое качество геля. (D) эффект зачистки на обнаружении OXPHOS комплексов. Определение комплекса в человеческой нейробластомы клеток (SH-SY5Y) до и после зачистки же мембраны. OXPHOS комплексы были обнаружены с помощью антител анти NDUFA9 (комплекс я), антитела анти SDHA (комплекс II), антитела анти UQCRC2 (комплекс III) и антитела анти-COX1, так (комплекс IV). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59269/59269fig1large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Буфер или раствор</td>
			<td>Состав</td>
			<td>Рецепт</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="4">3 x гель буфера</td>
			<td>1.5 Аминокапроновая кислота М</td>
			<td>расположена в 3.94 g Аминокапроновая кислота</td>
		</tr>
<tr>
<td>150 мм бис трис</td>
			<td>0,63 g бис-трис</td>
		</tr>
<tr>
<td>dH2O</td>
			<td>Добавить dH2O 20 мл</td>
		</tr>
<tr>
<td>pH 7.0</td>
			<td>Отрегулируйте пэ-аш до 7.0</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="4">Катод буфер</td>
			<td>15 мм бис трис</td>
			<td>3.14 g бис-трис</td>
		</tr>
<tr>
<td>Трицин 50 мм</td>
			<td>8.96 g Трицин</td>
		</tr>
<tr>
<td>dH2O</td>
			<td>Добавить dH2O до 1000 мл</td>
		</tr>
<tr>
<td>pH 7.0</td>
			<td>Отрегулируйте пэ-аш до 7.0</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="5">Синий катод буфера</td>
			<td>0,02% Кумасси синий G</td>
			<td>0,04 г Serva синий G</td>
		</tr>
<tr>
<td>15 мм бис трис</td>
			<td rowspan="4">200 мл буфера катода</td>
		</tr>
<tr>
<td>Трицин 50 мм</td>
		</tr>
<tr>
<td>dH2O</td>
		</tr>
<tr>
<td>pH 7.0</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="3">Анодный буфер</td>
			<td>50 мм бис трис</td>
			<td>20.93 g</td>
		</tr>
<tr>
<td>dH2O</td>
			<td>Добавить dH2O до 2000 мл</td>
		</tr>
<tr>
<td>pH 7.0</td>
			<td>Отрегулируйте пэ-аш до 7.0</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="5">Митохондриальные буфер</td>
			<td>1,75 Аминокапроновая кислота М</td>
			<td>0,5 мл 3 x гель буфера</td>
		</tr>
<tr>
<td>75 мм бис трис</td>
			<td>0,5 мл 2 М Аминокапроновая кислота</td>
		</tr>
<tr>
<td>2 мм ЭДТА</td>
			<td>4 мкл 500 мм ЭДТА</td>
		</tr>
<tr>
<td>dH2O</td>
			<td>-</td>
		</tr>
<tr>
<td>pH 7.0</td>
			<td>-</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="3">Буфер образца</td>
			<td>750 мм Аминокапроновая кислота</td>
			<td>0.94 мл 2 М Аминокапроновая кислота</td>
		</tr>
<tr>
<td>5% comassie синий G</td>
			<td>0,125 г Serva синий G</td>
		</tr>
<tr>
<td>dH2O</td>
			<td>Добавить dH2O 2,5 мл</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">Аминокапроновая кислота 2 М</td>
			<td>Аминокапроновая кислота 2 М</td>
			<td>2.62 g Аминокапроновая кислота</td>
		</tr>
<tr>
<td>dH2O</td>
			<td>Добавить dH2O 10 мл</td>
		</tr>
</tbody></table>Таблица 1. Буферы и решения, используемые для БН-страницы.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Синий родной гели</td>
			<td>Отделяя гель 6%</td>
			<td>Отделяя гель 15%</td>
			<td>Штабелируя гель 4%</td>
		</tr>
<tr>
<td>3 x гель буфера</td>
			<td>3,3 мл</td>
			<td>3,3 мл</td>
			<td>1.64 мл</td>
		</tr>
<tr>
<td>40% акриламида/Bis 37.5:1</td>
			<td>1,5 мл</td>
			<td>3,75 мл</td>
			<td>0,5 мл</td>
		</tr>
<tr>
<td>dH2O</td>
			<td>5.14 мл</td>
			<td>0.93 мл</td>
			<td>2.77 мл</td>
		</tr>
<tr>
<td>Глицерин</td>
			<td>0</td>
			<td>2 мл</td>
			<td>0</td>
		</tr>
<tr>
<td>Персульфат аммония 10% *</td>
			<td>60 МКЛ</td>
			<td>10 МКЛ</td>
			<td>60 МКЛ</td>
		</tr>
<tr>
<td>TEMED</td>
			<td>4 МКЛ</td>
			<td>2 МКЛ</td>
			<td>6 МКЛ</td>
		</tr>
<tr>
<td>Общий объем</td>
			<td>10 мл</td>
			<td>10 мл</td>
			<td>5 мл</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="4">* DH2O сделать всегда свежие 10% Аммония персульфат</td>
		</tr>
</tbody></table>Таблица 2. Рецепты гель для БН-страницы.
Дополнительные Рисунок 1. невозделываемых иммуноблоттинга образ Рисунок 1B. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59269/Supplementary_figure_1.eps" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот показатель.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Mitochondrial Respiratory Chain Complexes in Cultured Human Cells using Blue Native Polyacrylamide Gel Electrophoresis and Immunoblotting at JoVE.

Analysis of Mitochondrial Respiratory Chain Complexes in Cultured Human Cells using Blue Native Polyacrylamide Gel Electrophoresis and Immunoblotting

Анализ митохондриальной дыхательной цепи комплексов в культивируемых клеток человека, используя синий родной электрофореза геля полиакриламида и Immunoblotting

Этот протокол демонстрирует анализ митохондриальной дыхательной цепи комплексов, синий родной полиакриламидный гель-электрофорез. Здесь описан метод, применяемый для культивируемых клеток человека.

Mitochondrial respiration is performed by oxidative phosphorylation (OXPHOS) complexes within mitochondria. Internal and environmental factors can perturb ...

Синий родной полиакриламинид гель электрофорез позволяет анализ в такт комплексов митохондриальной окислительной фосфорилирующей системы. Это удобная и недорогая техника, которая может быть использована для наложения сборки целых комплексов митохондриальной окислительной фосфорилирующей системы. Чтобы подготовить митохондриальные лисаты, сначала используйте ледяной раствор PBS, чтобы аккуратно вымыть клетки один раз.Очистить клетки и гранулировать их при четырех градусах по Цельсию при 800 Г в течение 10 минут. Затем дважды промыть клеточные гранулы с помощью ледяного PBS и центрифуги при четырех градусах Цельсия при 800 G в течение 10 минут. Затем добавьте 200 микролитров ингибитора протеазы 100x до 20 миллилитров PBS.Повторное приостановление клеток в смеси ингибитора ПБС протеазы до конечной концентрации белка в пять миллиграммов на миллилитр. Для подготовки 3,3 миллимолярный дигитонин в PBS с ингибитором протеазы, растворить четыре миллиграмма дигонина в одном миллилитре PBS при 100 градусах по Цельсию, пока не будет видно осадков. Немедленно охладите лед и добавьте 10 микролитров ингибитора протеазы 100x к одному миллилитру раствора дигонина.Затем добавьте смесь ингибитора дигонина протеазы к клеткам при конечной концентрации 1,65 миллимолара. Хорошо перемешать и инкубировать на льду в течение пяти минут. Затем добавьте в клетки смесь ингибитора ПБС протеазы до конечного объема в 1,5 миллилитров.Центрифуга при четырех градусах Цельсия при 10 000 Г в течение 10 минут. Удалите супернатант и повторно приостанавливайте митохондриальные гранулы в митохондриальном буфере. Приготовьте один миллилитр свежего 10%loreal, установленного в растворе ингибитора PBS.Добавьте 10%loreal mountased к митохондриям при конечной концентрации 1%Incubate на льду, по крайней мере 15 минут. Центрифуга при четырех градусах Цельсия при 20 000 Г в течение 20 минут. Соберите супернатант в новую трубку и добавьте буфер образца.Чтобы подготовить градиентный гель для синей родной страницы, сначала поместите градиент производителя на пластину перемешивания и соедините его с гибкой трубой к перистальтическому насосу. Прикрепите набор настоя иглой к трубе. Поместите магнитный мешалку в проксимальную камеру градиентного производителя и промыть трубку дистиллированной водой с максимальной скоростью насоса в течение 10 минут.Далее, опорожните трубки и градиент производителя. Используйте пипетки, чтобы удалить остатки дистиллированной воды в канале между камерами градиента производителя. Закройте канал и трубы с клапаном.Соберите две стеклянные пластины в держатель и поместите его на стенде. Используя отверстие на дне держателя геля, поместите иглу, соединенную с трубами между стеклянными пластинами. Чтобы сделать гель 8,3 на 7,3 сантиметра, сначала приготовьте 6%и 15%gel растворы и держите их на льду.Смешайте их осторожно, чтобы избежать пузырьков воздуха. Затем загрузите проксимальный конец градиентного гель-миксера трубной камерой с 2,6 миллилитров 6%геля и дистальным концом с 2,1 миллилитров 15%геля. Затем включите магнитный мешалка и откройте трубы и канал между камерами градиентного производителя.Немедленно включите перистальтический насос до пяти миллилитров в минуту. Заполните стеклянные пластины и удалить иглу, когда нет геля в трубе. Аккуратно наложить гель с дистиллированной водой и держать гель при комнатной температуре, по крайней мере один час.Вымойте трубки немедленно, заполнив градиентные камеры дистиллированной водой и используя перистальтический насос на максимальной скорости. Добавьте шесть миллилитров дистиллированной воды в три миллилитров буфера 3x геля, чтобы сделать 1x гель буфера. С помощью фильтровальной бумаги аккуратно удалите дистиллированную воду с поверхности геля.Вымойте поверхность геля с 1x гель буфера, и осторожно удалить буфер с фильтровальной бумагой. Подготовь 4%укладки геля в соответствии с рукописью. Смешайте осторожно, чтобы избежать пузырьков воздуха.Затем поместите гребень между стеклянными пластинами и залить укладки гель под гребень. Погрузите гребень полностью. Пусть укладка гель полимеризации, по крайней мере 30 минут.Затем снимите гребень и используйте пипетку для мытья колодцев с 1x гель буфера. Для выполнения синего родного гель электрофорез, во-первых, добавить синий буфер катода на кассету геля. Используйте пипетку для мытья и заполнения колодцев синим катодным буфером.Затем загрузите в скважины от 5 до 30 микрограммов образцов белка. Аккуратно заполните гель кассету доверху с синим катодным буфером, а бак с анодным буфером. Во-первых, запустить гель при постоянном напряжении 40 вольт в течение 15 минут.Затем увеличьте напряжение до 80 вольт. Вы запустите гель, пока краситель не достигнет 2/3 длины геля. Замените синий катодный буфер катодным буфером и продолжайте электрофорез до тех пор, пока передняя краска не сбежать от геля.Извлеките стеклянные пластины и перенесите белки на мембрану PVDF полусухой блоттингом. Используйте постоянное напряжение 25 вольт и ток ограничен одним ампером в течение 30 минут. Сборка респираторных цепных комплексов в клетках нейробластомы человека была ингибирована при лечении хлорамфениколом по сравнению с контрольными клетками без лечения.В отличие от этого, комплексы, кодируемые ядерными генами, были дорегулируемы. Деградация окислительных фосфорилирующих комплексов наблюдалась на нескольких циклах замораживания-оттепели. Качество геля может повлиять на обнаружение окислительных фосфорилирующих комплексов.Кроме того, зачистка мембраны снизила соотношение сигнала к шуму. При выполнении процедуры важно помнить о проведении простого препарата и гель-электрофореза в холодных условиях для сохранения в тактных комплексов OXPHOS. После синей родной страницы, второе измерение SDS страница может быть применена для изучения белковых поду единиц дыхательных цепных комплексов.Голубая родная страница позволяет исследователям изучать сборку комплексов и даже суперкомплексов окислительной фосфорилирующей системы.

Research

JoVE Journal

Biology

Denaturing Gradient Gel Electrophoresis (DGGE)

Denaturing Gradient Gel Electrophoresis DGGE

Денатурирующих Электрофорез Градиент гель (DGGE)

Probing for Mitochondrial Complex Activity in Human Embryonic Stem Cells

Зондирование для митохондриального комплекса активность в эмбриональных стволовых клеток человека

Mitochondria are cytoplasmic organelles that have a primary role in cellular metabolism and homeostasis, regulation of the cell signaling network, and ...

Denaturing Urea Polyacrylamide Gel Electrophoresis (Urea PAGE)

Denaturing Urea Polyacrylamide Gel Electrophoresis Urea PAGE

Денатурирующих Мочевина полиакриламидном геле (мочевина PAGE)

Urea PAGE or denaturing urea polyacrylamide gel electrophoresis employs 6-8 M urea, which denatures secondary DNA or RNA structures and is used for their ...

Blue Native Polyacrylamide Gel Electrophoresis (BN-PAGE) for Analysis of Multiprotein Complexes from Cellular Lysates

Blue Native Polyacrylamide Gel Electrophoresis BN-PAGE for Analysis of Multiprotein Complexes from Cellular Lysates

Синий Родные электрофореза в полиакриламидном геле (BN-PAGE) для анализа Multiprotein Комплексы из ячеистого Лизаты

Multiprotein complexes (MPCs) play a crucial role in cell signalling, since most proteins can be found in functional or regulatory complexes with other ...

Visualization of Mitochondrial Respiratory Function using Cytochrome C Oxidase / Succinate Dehydrogenase (COX/SDH) Double-labeling Histochemistry

Visualization of Mitochondrial Respiratory Function using Cytochrome C Oxidase / Succinate Dehydrogenase COX/SDH Double-labeling Histochemistry

Визуализация митохондриальной дыхательной функции использованием цитохрома C Оксидазы / сукцинатдегидрогеназы (ЦОГ / SDH) Дважды маркировки гистохимии

Mitochondrial DNA (mtDNA) defects are an important cause of disease and may underlie aging and aging-related alterations 1,2. The mitochondrial theory of ...

Agarose Gel Electrophoresis for the Separation of DNA Fragments

Агарозном геле для разделения фрагментов ДНК

Agarose gel electrophoresis is the most effective way of separating DNA fragments of varying sizes ranging from 100 bp to 25 kb1. Agarose is isolated from ...

Isolation and Functional Analysis of Mitochondria from Cultured Cells and Mouse Tissue

Выделение и функциональный анализ митохондрий из культивируемых клеток и мышь ткани

Comparison between two or more distinct groups, such as healthy vs. disease, is necessary to determine cellular status. Mitochondria are at the nexus of ...

Silencing of BRCA2 to Identify Novel BRCA2-regulated Biological Functions in Cultured Human Cells

Silencing of BRCA2 to Identify Novel BRCA2-regulated Biological Functions in Cultured Human Cells

Подавление<em&gt; BRCA2</em&gt; Для идентификации новых BRCA2-биологические функции регулируются в культивируемых клетках человека

Silencing of the tumor suppressor protein BRCA2 and its detection by conventional biochemical analyses represent a great technical challenge owing to the ...

High-resolution Time-lapse Imaging and Automated Analysis of Microtubule Dynamics in Living Human Umbilical Vein Endothelial Cells

Высокое разрешение Покадровый изображений и автоматизированный анализ динамики микротрубочек в живых человеческих эндотелиальных клеток пупочной вены

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes ...

Purification of Native Complexes for Structural Study Using a Tandem Affinity Tag Method

Очистка Native Комплексы для структурного исследования с использованием метода Tag Тандем Affinity

Affinity purification approaches have been successful in isolating native complexes for proteomic characterization. Structural heterogeneity and a degree ...