Name: analysis of mitochondrial respiratory chain complexes in cultured human cells using blue native polyacrylamide gel electrophoresis and immunoblotting
Uploaded: 2019-02-12T15:00:00
Duration: 7 min 55 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Mitochondrial Respiratory Chain Complexes in Cultured Human Cells using Blue Native Polyacrylamide Gel Electrophoresis and Immunoblotting at JoVE.

Biblioteca de la Universidad de Helsinki se agradeció el apoyo financiero en la industria editorial.

spaNOTE: este protocolo se basa en una publicación asociada de Hilander et al13 .
1. preparación de buffers y soluciones
Nota: Todos los buffers y soluciones utilizadas en el protocolo se resumen en la tabla 1. Los volúmenes dados de los buffers son suficientes para preparar y ejecutar 10 muestras. Los buffers pueden almacenarse a + 4 ° C hasta por un año.
<ol><li>Prepare 20 mL de 3 x gel tampón que contiene ácido aminocaproico de 1,5 M, 150 mM Bis-tris en agua destilada (dH2O). Ajustar el pH a 7.0.</li>
	<li>Preparar 10 mL de 2 M el ácido aminocaproico en dH2O.</li>
	<li>Preparar 1 mL de tampón mitocondrial mediante la combinación de los siguientes: 0,5 mL de 3 x gel buffer, 0, 5 mL de ácido aminocaproico de 2 M y 4 μL de 500 mM de EDTA.</li>
	<li>Preparar 1000 mL de tampón de cátodo que contiene 15 mM de tris Bis y 50 mM de Tricina en dH2O. ajustar pH a 7.0.<ol>
<li>Preparar 200 mL de tampón de cátodo azul añadiendo 0,04 g de azul de Coomassie G-250 a 200 mL de tampón de cátodo.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparar 1000 mL de tampón de ánodo que contiene 50 mM tris Bis en dH2O. ajustar pH a 7.0.</li>
	<li>Preparar 2,5 mL del tampón de muestra que contiene el ácido aminocaproico 750 mM y 5% Coomassie blue G-250 en dH2O.</li>
</ol>2. preparación de lisados mitocondrial
<ol><li>Las células de la placa el día antes de la colección. Para las células HEK293 o 143B, use Dulbecco modificado medio de águila (DMEM) con suero bovino fetal 10%, 1% L-glutamina, 100 mg/mL de penicilina y estreptomicina 100 mg/mL. Crecen las células en una incubadora de cultivo celular a + 37 ° C en una atmósfera de 5% CO2 humidificada. Asegúrese de que hay al menos 500.000 células por cada muestra en el día de colección.</li>
	<li>Lave suavemente las células una vez con PBS helado. Evitar separar las células de la placa. Raspar las células y pellets a 800 x g por 10 min a 4 ° C.</li>
	<li>Lavar el precipitado de células dos veces con PBS helado y centrifugue como en el paso 2.2. Medir la concentración de proteínas mediante el método de Bradford utilizando un kit comercial. Sedimenten las células a 800 x g por 10 min a 4 ° C. Nota: Después de la recolección de células, realizar todos los pasos a + 4 ° C y hacer no agitar con vortex.</li>
	<li>Agregar 200 μL de inhibidor de la proteasa de 100 x 20 ml de PBS para preparar 20 mL de PBS con inhibidor de la proteasa. Mantener en hielo. Resuspender las células en PBS con inhibidor de la proteasa a una concentración final de proteína de 5 mg/mL.<ol>
<li>Para calcular el volumen de PBS con inhibidor de la proteasa necesario para resuspender las células en 5 mg/mL, calcular la cantidad de proteína en cada muestra. Para este cálculo, utilizar la concentración de proteína medida en el paso 2.3 y el volumen de PBS utilizada para resuspender las células después de lavar, lavadora en el paso 2.3.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparar 1 mL de digitonin de 3,3 mM en PBS con inhibidor de la proteasa. Añadir digitonin de 3,3 mM a una concentración final de 1,65 mM. Mezcla bien e incubar en hielo durante 5 minutos.<ol>
<li>Para preparar 1 mL de digitonin de 3,3 mM en PBS con inhibidor de la proteasa, disolver 4 mg de digitonin en 1 mL de PBS a 100 ° C hasta que el precipitado no es visible y fresco en hielo inmediatamente. Añadir 10 μl de inhibidor de la proteasa de 100 x 1 ml de solución de digitonin. Nota: Use solamente una solución fresca de digitonin. PRECAUCIÓN: Digitonin es tóxico! Use una mascarilla, guantes y una bata de laboratorio.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Añadir PBS con inhibidor de la proteinasa (preparado en el paso 2.4) hasta el volumen final de 1.5 mL. Centrifugar a 10.000 x g por 10 min a + 4 ° C. Eliminar el sobrenadante. En este paso, las mitocondrias son peleteadas.</li>
	<li>Resuspender el precipitado mitocondrial en buffer mitocondrial. El volumen de tampón mitocondrial es la mitad del volumen de PBS en el paso 2.4.</li>
	<li>Preparar el fresco maltoside de lauril de 10% en PBS con un inhibidor de la proteasa (preparado en el paso 2.4). 1 mL es suficiente para 10 muestras. Añadir 10% lauril maltoside a la concentración final de 1%. Incubar en hielo durante 15 minutos (este paso puede ser más largo hasta un par de horas).</li>
	<li>Centrifugar a 20.000 x g durante 20 minutos a + 4 ° C. Recoger el sobrenadante en un tubo nuevo. Medir la concentración de proteína por el método de Bradford con el equipo. Añadir el tampón de muestra, un volumen que es la mitad del volumen de lauril maltoside utilizado en el paso 2.8. Las muestras pueden almacenarse a-80 ° C hasta por 6 meses.</li>
</ol>3. preparación del gel del gradiente BN-PAGE
<ol><li>Verter el gel de gradiente para BN-PAGE a temperatura ambiente. Coloque la máquina de gradiente sobre una placa de agitación y conecte con un tubo flexible a la bomba peristáltica. Conecte un dispositivo de infusión con la aguja a la tubería. Coloque un agitador magnético en la cámara proximal de la fábrica de gradiente. Lavar el tubo con dH2O a velocidad máxima durante 10 minutos.</li>
	<li>Vacíe el tubo y la gradiente. Utilice una pipeta para quitar cualquier sobrante de dH2O en el canal entre las cámaras de la fábrica de gradiente. Cerrar el canal y tubería con la válvula.</li>
	<li>Utilizando pinzas y marco de fundición montar dos placas de vidrio en el soporte, que tiene un agujero en la parte inferior, y colóquela sobre el soporte. Asegúrese de que es más o menos en una superficie recta con un balance de agua. Lugar la aguja conectada a la tubería entre las placas de vidrio.</li>
	<li>Preparar soluciones de gel 6% y 15% (tabla 2). Mantener en hielo. Agregue el persulfato de amonio (APS) y tetramethylenediamine (TEMED) (empiezan a polimerización) pasado. Mezcle suavemente para evitar que el aire burbujea.</li>
	<li>El extremo proximal de la cámara del mezclador de gradiente gel tubo con gel al 6% y el extremo distal con gel de 15% de la carga. El volumen total del gel debe ser igual al volumen del gel de separación entre las placas de vidrio. Por lo tanto, utilice 2,6 mL de gel de 6% y 2.1 mL de gel de 15% a la mezcladora del gel del gradiente para gel un 8,3 cm x 7,3 cm de tamaño.</li>
	<li>Encender el agitador magnético y abrir la tubería o el canal entre las cámaras de la fábrica de gradiente. Inmediatamente encienda la bomba peristáltica a 5 mL/min llenar las placas de vidrio y no permita que las burbujas entrar en el gel. Retire la aguja cuando no hay ningún gel en el tubo.</li>
	<li>Suavemente el gel con dH2O. Mantenga el gel a temperatura ambiente durante al menos 1 h para la polimerización del recubrimiento.</li>
	<li>Inmediatamente después de verter el gel, lavar el tubo llenando las cámaras gradiente de dH2O y con la bomba peristáltica a máxima velocidad. Durante la preparación de los geles de dos y más, siempre entre limpiar el sistema.</li>
	<li>Preparar buffer de gel de 1 x mezclando 3 mL de 3 x gel buffer y agregar 6 mL de dH2O. quitar dH2O de la superficie del gel con papel de filtro con cuidado. Lavar la superficie del gel con 1 x gel buffer. Retire suavemente 1 x buffer gel con papel de filtro.<ol>
<li>Evitar las fibras del papel de filtro sobre el gel. Para ello, cortar el papel a trocitos con unas tijeras pero no rasgar el papel.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Colocar el peine entre las placas de cristal, pero ni la sumerja completamente para poder verter el gel de apilamiento en el peine. Preparar el 4% del stacking gel (tabla 2). Añadir APS y TEMED duran como empiezan polimerización fácilmente. Mezclar suavemente evitando burbujas de aire.</li>
	<li>Superponer el gel de apilamiento, evitando las burbujas bajo el peine y sumergir el peine completo. Deje que el gel de apilamiento polimerice para por lo menos 30 minutos Retire el peine y lavar los pocillos con 1 x buffer gel utilizando una pipeta.<ol>
<li>Después de la polimerización, el gel puede almacenarse a + 4 ° C durante un par de días. Para almacenar el gel, envuelva el gel en papel empapado con dH2O y plástico película para prevenir el secado del gel.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. azul electroforesis nativa
Nota: Para evitar la degradación de OXPHOS complejos corren electroforesis + 4 ° C. Usar tampones previamente enfriadas.
<ol><li>Cargar el cartucho de gel con el tampón de cátodo azul hasta el fondo de los pozos. Carga de las muestras es más fácil cuando el cartucho no se llena en la parte superior. Lavar los pocillos con el tampón de cátodo azul y luego llenar los pozos con el tampón de cátodo azul utilizando pipeta.</li>
	<li>Cargar las muestras (5-30 μg de la proteína) en los pocillos. Llene suavemente el cartucho de gel en la parte superior con el buffer de cátodo azul y el depósito con el almacenador intermediario del ánodo.</li>
	<li>Correr el gel durante 15 min a una tensión constante de 40 V. Entonces aumentar el voltaje a 80 V (o utilizar una constante corriente de 6 mA), no exceda de 10 mA. Correr el gel hasta que el tinte llegue a 2/3 de la longitud del gel.</li>
	<li>Cambie el búfer del cátodo azul con tampón de cátodo y electroforesis continúe al frente de tinte ha agotado. En total, electroforesis dura aproximadamente 3 horas.</li>
	<li>Recuperar las placas de vidrio y transferir las proteínas a la membrana de polivinilideno (PVDF) de fluoruro por semiseco borrar. Use una tensión constante de 25 V y una corriente limitada a 1.0 una durante 30 minutos.<ol>
<li>Alternativamente, use blotting húmedo para transferir los complejos OXPHOS a una membrana PVDF.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Continuar con el bloqueo de la membrana y anticuerpos incubación según el protocolo estándar de immunoblotting. Uso de los anticuerpos primarios contra subunidades de complejos OXPHOS secuencialmente. Nota: por ejemplo, usar anti-NDUFA9 anticuerpo (1: 2000) para el complejo I, anticuerpo anti-SDHA (1: 2000) para el complejo II, anticuerpos anti-UQCRC2 (1: 1000) para el complejo III, anticuerpo anti-COX1 (1: 2000) para el complejo IV y anti-ATP5A anticuerpo (1: 2000) para el complejo V. La lista de los anticuerpos se presenta en la Tabla de materiales.</li>
</ol>

<ol>
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No hay conflicto de interés declarado.

Una de las partes más importantes del protocolo es preservar complejos OXPHOS intactos durante la preparación de la muestra, almacenamiento y electrophoresis del gel. Así, las mitocondrias deben aislarse a + 4 ° C y las muestras no deben someterse a ciclos hielo-deshielo. Complejos OXPHOS pueden tolerar sólo un ciclo de congelación y descongelación durante todo el procedimiento. Múltiples ciclos de congelación y descongelación destruyen complejos OXPHOS (figura 1B). Control y las muestras experimentales que deben ser comparados deben estar preparadas en paralelo para evitar las diferencias en las condiciones de almacenamiento, que pueden dar resultados engañosos. Si no es posible realizar todos los pasos del protocolo en paralelo con las muestras, se recomienda congelar los pellets de células lavadas a-80 ° C (paso 1.4 en este protocolo) y más tarde llevar a cabo el resto del protocolo para todas las muestras de juntos por lo menos hasta gel elec trophoresis. Debería prestarse atención especial a la limpieza de los aparatos de electroforesis (tanque, cassette). Si el mismo aparato se usa para SDS-PAGE, lave muy bien antes de BN-PAGE. Cualquier SDS residual puede causar la disociación de los complejos OXPHOS durante electroforesis.
Geles de gradiente de alta calidad son otra parte fundamental del protocolo. Geles prefabricados para página nativa azul están comercialmente disponibles; sin embargo, no se recomienda usarlos, ya que los buffers utilizados para geles comerciales podrían tener una composición diferente de los buffers de la muestra. El gradiente del gel usado aquí (6-15%) es óptimo para la separación de los complejos OXPHOS. Para detectar estructuras supramoleculares de orden superior de OXPHOS, supercomplexes de cadena respiratorios también conocido como14, algunos la optimización es necesario11.
Para la visualización de OXPHOS complejos utilizan los anticuerpos específicos, basados en sus propiedades. Por ejemplo, utilice primero el anticuerpo que da la señal más débil y el anticuerpo con la señal más fuerte de último. Esto es importante puesto que el desmontaje debilita la detección (figura 1). La composición de complejos de cadena respiratorios puede investigarse si después página de BN el gel se somete a la segunda dimensión de SDS-PAGE15.
El protocolo descrito aquí sugiere usando los anticuerpos contra complejos OXPHOS individuales secuencialmente. Sin embargo, el anticuerpo disponible comercialmente de OXPHOS cóctel puede utilizarse para detectar simultáneamente los cinco complejos OXPHOS. Sin embargo, para poder detectar complejos incompletamente montados de OXPHOS y definir su identidad, anticuerpos contra complejos individuales OXPHOS pueden usarse secuencialmente. Este paso es desperdiciadora de tiempo; sin embargo, puede ser esencial para probar modelos y nuevas condiciones experimentales.
La concentración de digitonin utilizado para el aislamiento mitocondrial debe ser optimizada para el tipo de célula específica. Como detergente, digitonin permeabilizes las membranas celulares. La concentración óptima de digitonin permeabilizes eficientemente la membrana plasmática de las células dejando intactas las membranas mitocondriales. Concentración demasiado baja de digitonin causa alta contaminación de los extractos mitocondriales mientras que la concentración demasiado alta daña las membranas mitocondriales y reduce la producción mitocondrial total. La relación óptima digitonin/proteína (g/g) varía de 0.3 a 1. Mancha blanca /negra occidental análisis de proteínas extraída de pellet y sobrenadante pueden utilizarse para probar la concentración óptima de digitonin16.
Este protocolo no incluye proteína de carga control de immunoblot; por lo tanto, la concentración de complejos extraídos deberá ser cuidadosamente medida por lo menos en triplicado para igual carga. Además, las muestras se pueden funcionar en BN-PAGE en repeticiones. Si el ensamblaje de complejos OXPHOS selectivas se deteriora, complejos pueden servir como controles de carga.
La estimación de la masa molecular de los complejos de proteína en la página de la BN es un reto18. El actual protocolo no incluye el marcador de peso molecular; por lo tanto, para estimar el conjunto de los complejos OXPHOS, las muestras de control que contiene complejos afectados deben siempre incluirse en el análisis. Las muestras de control de página de la BN son generalmente células de tipo salvaje o sin tratar.
El método presentado aquí está optimizado para la detección de complejos de la cadena respiratoria mitocondrial; sin embargo, también puede ser aplicado para la evaluación de Oligomerización de proteínas mitocondriales19. Además, la tasa de ensamblaje de complejos OXPHOS puede estudiarse por primera que agota complejos que contienen subunidad mitocondrial codificada por cloranfenicol y luego siguiendo su recuperación después de la eliminación de cloramfenicol10. Por lo tanto, BN-página puede utilizarse para evaluar los niveles de estado estacionario y montaje de OXPHOS para diferentes aplicaciones incluyendo diagnóstico molecular de trastornos mitocondriales humanos9,11.

Las mitocondrias son organelos multifuncionales, desempeñando un papel importante en la producción de energía, regulación del metabolismo celular, señalización, apoptosis, envejecimiento, etc.1,2,3. La producción de energía en la mitocondria depende de la función de fosforilación oxidativa que respiración con síntesis de ATP. En las células humanas, el sistema de fosforilación oxidativa mitocondrial (OXPHOS) se compone de cinco complejos. Complejos I-IV crea un gradiente electroquímico de protones en el espacio de intermembrane mitocondrial que se utiliza para producir ATP por el complejo V. Cada complejo OXPHOS es multimérica y excepto el complejo II, compuesto por las subunidades codificadas por genes nucleares y mitocondriales. Cualquier defecto en los componentes de los complejos OXPHOS causados por mutaciones o estrés ambiental puede perturbar la Asamblea y la funcionalidad del sistema de fosforilación oxidativa. Además, el montaje correcto de complejos OXPHOS funcionales requiere de un gran número de factores de montaje4,5,6.
Electroforesis en gel de poliacrilamida nativo azul (BN-PAGE) es una técnica fundamental que permite el análisis de los complejos de la proteína intacta y pueden utilizarse para estudiar el conjunto de complejos OXPHOS. En primer lugar, las mitocondrias están aisladas de las células de digitonin, que es un detergente que permeabilizes la membrana plasmática de las células. Luego, usando lauril maltoside, complejos OXPHOS son liberados de las membranas mitocondriales. Mediante la electroforesis del gel del gradiente, los complejos OXPHOS están separados según su masa. Coomassie blue G-250 (no R-250) agregó el tampón de muestra y el buffer del cátodo azul disocia asociaciones detergente lábil pero conserva intacto de complejos de cadena respiratoria individual8. Durante la electroforesis, el tampón de cátodo azul que contiene tinte se sustituye por el búfer de cátodo sin tinte, que asegura la transferencia eficiente de complejos OXPHOS en el PVDF membrana8. Para visualizar complejos OXPHOS, la membrana PVDF secuencialmente se incuba con anticuerpos correspondientes a las subunidades seleccionadas de los cinco complejos OXPHOS.
El método descrito aquí con algunas modificaciones puede aplicarse a cualquier células cultivadas. Además, este método puede utilizarse para el análisis de complejos OXPHOS en mitocondrias aisladas de muestras de tejido9. BN-página requiere al menos 5-10 μg de mitocondrias para cada muestra por ejecución. Utilizando el método descrito aquí, 500.000 cultivado células como HEK293, SH-SY5Y o células 143B pueden rendir aproximadamente 10 μg de mitocondrias. Sin embargo, una cantidad suficiente de células para el análisis BN depende del tipo de célula específica.
El método más común para el estudio de proteínas mitocondriales de OXPHOS es SDS-PAGE y western blot. Sin embargo, SDS-PAGE permite estudiar sólo individuales subunidades OXPHOS y, en contraste con la página de la BN, no se puede utilizar para evaluar el conjunto de enteros complejos OXPHOS. Claro nativo-página separa complejos de la proteína en condiciones nativas sin la presencia de tinte cargado negativamente y tiene una resolución significativamente menor en comparación con BN-PAGE. Sin embargo, clara nativo-página es más suave que BN-PAGE por lo que pueden mantener asambleas supramoleculares lábiles de complejos proteicos tales como supercomplexes OXPHOS que son disociados bajo las condiciones de BN-página10. En el presente Protocolo, del gel del gradiente se utiliza para separar complejos; sin embargo, alternativamente, separación del gradiente no puede utilizarse si el fabricante gradiente relativamente costoso no es disponible11.
Importante, el método aquí descrito permite analizar el conjunto de complejos OXPHOS, mientras que no se evalúa la funcionalidad de los complejos. Una alta resolución BN-PAGE seguido por actividad en gel ensayo11 como ensayo espectrofotométrico de actividad enzimática de los complejos mitocondriales12 son técnicas eficientes para el análisis funcional de los complejos OXPHOS. Sin embargo, estos dos métodos de ensayo no el ensamblaje de complejos OXPHOS.
Por lo tanto, BN-PAGE es el método óptimo para investigar el conjunto de los complejos OXPHOS. Por ejemplo, algunos desordenes mitocondriales, como la neuropatía óptica hereditaria Leber (LHON), encefalopatía mitocondrial con acidosis láctica y movimiento-como episodios (MELAS), se asocian a alteración Asamblea de uno o más componentes de los OXPHOS sistema5. Mediante el método de página BN descrito aquí, se pueden estudiar los mecanismos moleculares de las enfermedades mitocondriales.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:693px;" width="693">
	<tbody>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:316px;">100 mm cell plates</td>
			<td style="width:97px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:111px;">130182</td>
			<td style="width:169px;"></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">40% Acrylamide/Bis 37.5:1</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>161-0148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Aminocaproic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A2504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Ammonium persulfate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A3678</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Anti-ATP5A</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>14748</td>
			<td>Complex V subunit</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Anti-MTCOI</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>14705</td>
			<td>Complex VI subunit</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Anti-NDUFA9</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>14713</td>
			<td>Complex I subunit</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Anti-SDHA</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>14715</td>
			<td>Complex II subunit</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Anti-UQCRC2</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>14745</td>
			<td>Complex III subunit</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Bis-tris</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B7535</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Bradford protein assay kit</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>5000006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Cell scrapers</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>11597692</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Coomassie blue G250 (Serva Blue G)</td>
			<td>Serva</td>
			<td>35050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Digitonin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">DMEM</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>12-614F/12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">EDTA</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15575-038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">FBS</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10270106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Fetal bovine serum</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10270106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Glycerol</td>
			<td>(Sigma</td>
			<td>G5516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Gradient maker</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1654120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Lauryl maltoside (n-Dodecyl &#946;-D-maltoside)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D4641</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">L-glutamine</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>25030024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">L-glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">N,N,N&#8242;,N&#8242;-Tetramethylethylenediamine (TEMED)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T9281</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">PBS</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>BE17-516F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>17-602E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Penicillin/streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Power supply</td>
			<td>GE Healthcare&#160;</td>
			<td>EPS 301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Protease inhibitors</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>10137963</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Trans-blot turbo mini PVDF</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1704156</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Tricine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T9784</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Trypsin-EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15400054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Vertical electrophoresis apparatus</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1658004</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of mitochondrial respiratory chain complexes in cultured human cells using blue native polyacrylamide gel electrophoresis and immunoblotting

La respiración mitocondrial se realiza por fosforilación oxidativa (OXPHOS) complejos dentro de las mitocondrias. Factores internos y ambientales pueden perturbar la Asamblea y la estabilidad de complejos OXPHOS. Este protocolo describe el análisis de los complejos de la cadena respiratoria mitocondrial por electroforesis en gel de poliacrilamida nativo azul (BN-PAGE) en el uso de células humanas cultivadas. Primero, las mitocondrias se extraen de las células utilizando digitonin, luego usando lauril maltoside, los complejos OXPHOS intactos son aislados de las membranas mitocondriales. Los complejos OXPHOS luego se resuelven por electroforesis del gel del gradiente en presencia del colorante cargado negativamente, Coomassie blue, que previene la agregación proteica y asegura la movilidad electroforética de los complejos de la proteína hacia el cátodo. Por último, los complejos OXPHOS son detectados por immunoblotting estándar. Por lo tanto, BN-PAGE es una técnica conveniente y barata que puede utilizarse para evaluar el conjunto de enteros complejos OXPHOS, en contraste con el SDS-PAGE básico que permite el estudio de solamente subunidades complejos individuales OXPHOS.

Mediante la página de la BN, defectos en el ensamblaje de complejos OXPHOS mitocondriales pueden ser investigados. Figura 1A muestra el ensamblaje de complejos de cadena respiratorios en células de neuroblastoma humano (SH-SY5Y) tratadas con cloranfenicol, que inhibe específicamente la traducción de subunidades mtDNA-codificadas de OXPHOS. Cloramfenicol ha agotado los complejos OXPHOS que contienen subunidades codificadas mitochondrially (complejo I, III, IV; Figura 1A), mientras que complejo II, que exclusivamente está codificada por genes nucleares, compensatorily era upregulated. Complejo V no fue immunoblotted aquí.
Múltiples ciclos de congelación y descongelación destruyen complejos OXPHOS. Figura 1B muestra la degradación de complejos OXPHOS por los ciclos de hielo-deshielo. Mitocondriales complejos respiratorios en muestra 3 que han sido sometidos a múltiples ciclos de congelación y descongelación tienen una intensidad menor de la banda y se cambian de puesto en comparación con las mismas muestras, que fueron congeladas con sólo una vez. Inmunoblot uncropped imagen de la figura 1B se muestra en la complementaria figura 1.
La calidad del gel es importante para las bandas nítidas y claras. Figura 1 C muestra un immunoblot de un gel que no polimerizar bien. Pelando de la membrana también puede afectar la detección de complejos OXPHOS. En la figura 1D, complejo me detecté antes o después de decapar. La relación señal a ruido es mucho menor después de decapar.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59269/59269fig1.jpg"> Figura 1. BN-PAGE immunoblots de experimentos exitosos y óptimos. (A) complejos de agotamiento de OXPHOS por inhibidor de la traducción mitocondrial. Células de neuroblastoma humano (SH-SY5Y) fueron tratadas con cloranfenicol (CAP) durante 48 horas. CTRL, control de células sin tratamiento de cloranfenicol. El panel inferior muestra la cuantificación de la immunoblot. El valor del control se toma como 1 (se muestra como una línea discontinua). Los datos se presentan como media ± SD, n = 3, * P < 0.0001 en comparación con el control utilizando desapareado t-pruebas del estudiante. (B) complejos de interrupción de OXPHOS por varios ciclos de congelación y descongelación. Muestras 1-3 se prepararon de las células de osteosarcoma humano (143B) en las mismas condiciones. Número de muestras 1 y 2 fueron congelados y derretido solamente una vez, mientras que el número de muestra 3 experimentó cuatro ciclos de hielo-deshielo. (C) BN-PAGE immunoblots de complejos OXPHOS aislados de las células HEK293. El aplastamiento de las bandas es causada por la baja calidad del gel. (D) efecto de decapado en la detección de complejos OXPHOS. Detección de complejo I en las células de neuroblastoma humano (SH-SY5Y) antes y después del desmontaje de la misma membrana. Complejos OXPHOS fueron detectadas usando anticuerpos anti-NDUFA9 (complejo I), anti-SDHA (complejo II), anticuerpos anti-UQCRC2 (complejo III) y el anticuerpo anti-COX1 (complejo IV). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59269/59269fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Tampón o solución</td>
			<td>Composición</td>
			<td>Receta</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="4">3 x gel buffer</td>
			<td>1.5 el ácido aminocaproico M</td>
			<td>3,94 g de ácido aminocaproico</td>
		</tr>
<tr>
<td>150 mM Bis-tris</td>
			<td>0,63 g de Bis-tris</td>
		</tr>
<tr>
<td>dH2O</td>
			<td>Añadir dH2O a 20 mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>pH 7.0</td>
			<td>Ajustar el pH a 7.0</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="4">Buffer de cátodo</td>
			<td>15 mM Bis-tris</td>
			<td>3,14 g de Bis-tris</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tricina 50 mM</td>
			<td>8,96 g de Tricina</td>
		</tr>
<tr>
<td>dH2O</td>
			<td>Añadir dH2O a 1000 mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>pH 7.0</td>
			<td>Ajustar el pH a 7.0</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="5">Buffer de cátodo azul</td>
			<td>0.02% coomassie blue G</td>
			<td>0.04 g de Serva azul G</td>
		</tr>
<tr>
<td>15 mM Bis-tris</td>
			<td rowspan="4">200 mL de tampón de cátodo</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tricina 50 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>dH2O</td>
		</tr>
<tr>
<td>pH 7.0</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="3">Buffer de ánodo</td>
			<td>50 mM tris Bis</td>
			<td>g 20,93</td>
		</tr>
<tr>
<td>dH2O</td>
			<td>Añadir dH2O a 2000 mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>pH 7.0</td>
			<td>Ajustar el pH a 7.0</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="5">Búfer mitocondrial</td>
			<td>1.75 el ácido aminocaproico M</td>
			<td>0,5 mL de 3 x gel buffer</td>
		</tr>
<tr>
<td>75 mM tris Bis</td>
			<td>0,5 mL de ácido aminocaproico de 2 M</td>
		</tr>
<tr>
<td>2 mM EDTA</td>
			<td>4 μL de EDTA de 500 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>dH2O</td>
			<td>-</td>
		</tr>
<tr>
<td>pH 7.0</td>
			<td>-</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="3">Tampón de muestra</td>
			<td>ácido aminocaproico 750 mM</td>
			<td>0,94 mL de 2 M el ácido aminocaproico</td>
		</tr>
<tr>
<td>5% comassie blue G</td>
			<td>0,125 g de Serva azul G</td>
		</tr>
<tr>
<td>dH2O</td>
			<td>Añadir dH2O 2,5 ml</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">Ácido aminocaproico de 2 M</td>
			<td>Ácido aminocaproico de 2 M</td>
			<td>2,62 g de ácido aminocaproico</td>
		</tr>
<tr>
<td>dH2O</td>
			<td>Añadir dH2O a 10 mL</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabla 1. Buffers y soluciones usadas por BN-PAGE.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Geles nativos azul</td>
			<td>6% gel separador</td>
			<td>15% de gel separador</td>
			<td>4% gel de apilamiento</td>
		</tr>
<tr>
<td>3 x gel buffer</td>
			<td>3.3 mL</td>
			<td>3.3 mL</td>
			<td>1,64 mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>40% acrilamida/Bis 37.5:1</td>
			<td>1.5 mL</td>
			<td>3,75 mL</td>
			<td>0, 5 mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>dH2O</td>
			<td>5,14 mL</td>
			<td>0,93 mL</td>
			<td>2,77 mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Glicerol</td>
			<td>0</td>
			<td>2 mL</td>
			<td>0</td>
		</tr>
<tr>
<td>Persulfato de amonio 10% *</td>
			<td>60 ΜL</td>
			<td>10 ΜL</td>
			<td>60 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>TEMED</td>
			<td>4 ΜL</td>
			<td>2 ΜL</td>
			<td>6 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Volumen total</td>
			<td>10 mL</td>
			<td>10 mL</td>
			<td>5 mL</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="4">* Hacer persulfato de amonio 10% siempre fresca en dH2O</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabla 2. Receta de gel para BN-PAGE.
Complementarias Figura 1. inmunoblot uncropped imagen de figura 1B. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59269/Supplementary_figure_1.eps" target="_blank">Haga clic aquí para descargar esta figura.</a>

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Analysis of Mitochondrial Respiratory Chain Complexes in Cultured Human Cells using Blue Native Polyacrylamide Gel Electrophoresis and Immunoblotting

Análisis de complejos de cadena respiratoria mitocondrial en células humanas cultivadas usando electroforesis en Gel de poliacrilamida nativo azul e Immunoblotting

Este protocolo muestra el análisis de los complejos de la cadena respiratoria mitocondrial por electroforesis en gel de poliacrilamida nativo azul. Aquí se describe el método aplicado a las células humanas cultivadas.

Mitochondrial respiration is performed by oxidative phosphorylation (OXPHOS) complexes within mitochondria. Internal and environmental factors can perturb ...

La electroforesis de gel de poliacrilamida nativa azul permite el análisis de complejos en el tacto del sistema de fosforilación oxidativa mitocondrial. Es una técnica conveniente y económica que se puede utilizar para superponer el montaje de complejos enteros del sistema de fosforilación oxidativa mitocondrial. Para preparar los licatos mitocondriales, primero use la solución de PBS helada para lavar suavemente las células una vez.Raspa las células y las pelete a cuatro grados centígrados a 800 G durante 10 minutos. Luego, lave el pellet celular dos veces con el PBS helado y la centrífuga a cuatro grados centígrados a 800 G durante 10 minutos. A continuación, agregue 200 microlitros de inhibidor de la proteasa 100x a 20 mililitros de PBS.Re-suspender las células en la mezcla inhibidora de la proteasa PBS a una concentración final de proteína de cinco miligramos por mililitro. Para preparar 3,3 digitonesiones mililitros en PBS con inhibidor de la proteasa, disolver cuatro miligramos de digitonina en un mililitro de PBS a 100 grados Celsius hasta que no sea visible ningún precipitado. Enfríe sobre hielo inmediatamente y agregue 10 microlitros de inhibidor de la proteasa 100x a un mililitro de la solución de digitonina.A continuación, añadir la mezcla inhibidora de la proteasa de digitonina a las células a la concentración final de 1,65 milimolares. Mezcle bien e incubar sobre hielo durante cinco minutos. Luego, agregue la mezcla inhibidora de la proteasa PBS a las células al volumen final de 1,5 mililitros.Centrifugar a cuatro grados centígrados a 10.000 G durante 10 minutos. Retire el sobrenadante y vuelva a suspender el gránulo mitocondrial en el tampón mitocondrial. Preparar un mililitro de montura fresca 10%loreal en solución inhibidora de PBS.Añadir 10%loreal mountased a las mitocondrias a la concentración final de 1%Incubar sobre hielo durante al menos 15 minutos. Centrifugar a cuatro grados centígrados a 20.000 G durante 20 minutos. Recoja el sobrenadante en un tubo nuevo y agregue el búfer de muestra.Para preparar el gel degradado para la página azul nativo, coloque primero el fabricante de degradado en una placa de agitación y conéctelo con un tubo flexible a la bomba peristáltica. Coloque un juego de perfusión con una aguja en el tubo. Coloque un agitador magnético en la cámara proximal del fabricante de gradientes y lave el tubo con agua destilada a la velocidad máxima de la bomba durante 10 minutos.A continuación, vacíe el tubo y el fabricante de degradados. Utilice una pipeta para eliminar cualquier agua destilada sobrante en el canal entre las cámaras del fabricante de gradientes. Cierre el canal y el tubo con la válvula.Ensamble dos placas de vidrio en el soporte y colóquela en el soporte. Con el orificio en la parte inferior del soporte de gel, coloque la aguja conectada al tubo entre las placas de vidrio. Para hacer un gel de 8,3 por 7,3 centímetros, primero prepara soluciones de 6% y 15% de gel y mantenlas en hielo.Mézclalos suavemente para evitar hacer burbujas de aire. A continuación, cargue el extremo proximal de la cámara de tubos del mezclador de gel degradado con 2,6 mililitros del 6% de gel y el extremo distal con 2,1 mililitros del 15%gel. A continuación, encienda el agitador magnético y abra el tubo y el canal entre las cámaras del fabricante de gradientes.Encienda inmediatamente la bomba peristáltica a cinco mililitros por minuto. Llene las placas de vidrio y retire la aguja cuando no haya gel en el tubo. Superponga suavemente el gel con agua destilada y mantenga el gel a temperatura ambiente durante al menos una hora.Lave el tubo inmediatamente llenando las cámaras de gradiente con agua destilada y utilizando la bomba peristáltica a la velocidad máxima. Añadir seis mililitros de agua destilada a tres mililitros del tampón de gel 3x para hacer 1x tampón de gel. Con un papel de filtro, retire suavemente el agua destilada de la superficie del gel.Lave la superficie del gel con el tampón de gel 1x y retire suavemente el tampón con el papel de filtro. Preparar un 4% de gel de apilamiento según el manuscrito. Mezclar suavemente para evitar hacer burbujas de aire.A continuación, coloque el peine entre las placas de vidrio y vierta el gel de apilamiento debajo del peine. Sumerja el peine completamente. Deje que el gel de apilamiento se polimerice durante al menos 30 minutos.A continuación, retire el peine y use una pipeta para lavar los pozos con 1x tampón de gel. Para realizar la electroforesis de gel nativo azul, primero, agregue el tampón de cátodo azul al cassette de gel. Utilice una pipeta para lavar y llenar los pozos con el tampón de cátodo azul.Luego, cargue de cinco a 30 microgramos de muestras de proteínas en los pozos. Llene suavemente el cassette de gel hasta la parte superior con el tampón de cátodo azul y el tanque con el tampón de ánodo. En primer lugar, ejecute el gel a una tensión constante de 40 voltios durante 15 minutos.A continuación, aumente la tensión a 80 voltios. Ejecute el gel hasta que el tinte alcance 2/3 de la longitud del gel. Sustituya el tampón de cátodo azul por el tampón de cátodo y continúe la electroforesis hasta que el frente del tinte haya quedado sin el gel.Recuperar las placas de vidrio y transferir las proteínas a la membrana PVDF por hinchazón semi-seca. Utilice un voltaje constante de 25 voltios y una corriente limitada a un amperio durante 30 minutos. El montaje de los complejos de la cadena respiratoria en las células del neuroblastoma humano se inhibió tras el tratamiento con cloramphenicol en comparación con las células de control sin tratamiento.Por el contrario, los complejos codificados por los genes nucleares fueron regulados. Se observó degradación de los complejos de fosforilación oxidativa en múltiples ciclos de congelación y deshielo. La calidad del gel podría afectar a la detección de los complejos de fosforilación oxidativa.Además, el desmontaje de la membrana redujo la relación señal-ruido. Al realizar el procedimiento, es importante recordar llevar a cabo una simple preparación y electroforesis de gel en condiciones frías para preservar los complejos OXPHOS en tacto. Después de la página nativa azul, se puede aplicar una segunda página SDS de dimensión para estudiar las subuncuciones de proteínas de los complejos de cadenas respiratorias.La página nativa azul permite a los investigadores estudiar el montaje de complejos e incluso super-complejos del sistema de fosforilación oxidativa.

Research

JoVE Journal

Biology

Denaturing Gradient Gel Electrophoresis (DGGE)

Denaturing Gradient Gel Electrophoresis DGGE

Gradiente desnaturalizante electroforesis en gel (DGGE)

Investigación

Biología

Probing for Mitochondrial Complex Activity in Human Embryonic Stem Cells

Sondeo de la actividad mitocondrial complejo en células estaminales embrionarias humanas

Mitochondria are cytoplasmic organelles that have a primary role in cellular metabolism and homeostasis, regulation of the cell signaling network, and ...

Denaturing Urea Polyacrylamide Gel Electrophoresis (Urea PAGE)

Denaturing Urea Polyacrylamide Gel Electrophoresis Urea PAGE

Poliacrilamida electroforesis en gel de urea (urea PÁGINA)

Urea PAGE or denaturing urea polyacrylamide gel electrophoresis employs 6-8 M urea, which denatures secondary DNA or RNA structures and is used for their ...

Blue Native Polyacrylamide Gel Electrophoresis (BN-PAGE) for Analysis of Multiprotein Complexes from Cellular Lysates

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Azul nativos electroforesis en gel de poliacrilamida (BN-PAGE) para el análisis de los complejos Multiproteinas de lisados ​​celulares

Multiprotein complexes (MPCs) play a crucial role in cell signalling, since most proteins can be found in functional or regulatory complexes with other ...

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