Name: a galleria mellonella oral administration model to study commensal-induced innate immune responses
Uploaded: 2019-03-21T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Galleria mellonella Oral Administration Model to Study Commensal-Induced Innate Immune Responses at JoVE.com

Dette arbejde blev finansieret af DFG (SPP1656), uddannelse i DFG forskningsgruppen 1708, yder støtten Bundesministerium für Bildung und Forschung (BMBF) og den tyske Center for infektion forskning (DZIF).

1. G. mellonella opdræt og forberedelse af larverne til eksperimenter
Bemærk: Cyklus fra æg til sidste instar larve tager ca 5-6 uger.
<ol><li>Overføre æg lagt af adult møl til 2 L kasser indeholdende voks møl substrat (22% majs gryn, 22% hvede mel, 17,5% bivoks, 11% skummetmælkspulver, 11% honning, 11% glycerol, 5,5% tørret gær). Udføre hele avl på 30 ° C i mørke.</li>
	<li>Overføre 25 g af substrat, der indeholder larverne i frisk substrat efter ca 1-2 uger hvor rin...

<ol>
	<li>Nell, S., Suerbaum, S., Josenhans, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+impact+of+the+microbiota+on+the+pathogenesis+of+IBD:+lessons+from+mouse+infection+models.">The impact of the microbiota on the pathogenesis of IBD: lessons from mouse infection models.</a> Nature Reviews Microbiology. 8 (8), 564-577 (2010).</li><li>Muniz, L. R., Knosp, C., Yeretssian, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+antimicrobial+peptides+during+homeostasis,+infection,+and+disease.">Intestinal antimicrobial peptides during homeostasis, infection, and disease.</a> Frontiers in Immunology. 3, 310 (2012).</li><li>Ivanov, I. I., Honda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+commensal+microbes+as+immune+modulators.">Intestinal commensal microbes as immune modulators.</a> Cell Host Microbe. 12 (4), 496-508 (2012).</li><li>Ayres, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammasome-microbiota+interplay+in+host+physiologies.">Inflammasome-microbiota interplay in host physiologies.</a> Cell Host Microbe. 14 (5), 491-497 (2013).</li><li>Champion, O. L., Titball, R. W., Bates, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standardization+of+G.+mellonella+Larvae+to+Provide+Reliable+and+Reproducible+Results+in+the+Study+of+Fungal+Pathogens.">Standardization of G. mellonella Larvae to Provide Reliable and Reproducible Results in the Study of Fungal Pathogens.</a> Journal of Fungi (Basel). 4 (3), (2018).</li><li>Wojda, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunity+of+the+greater+wax+moth+Galleria+mellonella.">Immunity of the greater wax moth Galleria mellonella.</a> Insect Science. , (2016).</li><li>Buchmann, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+Innate+Immunity:+Clues+from+Invertebrates+via+Fish+to+Mammals.">Evolution of Innate Immunity: Clues from Invertebrates via Fish to Mammals.</a> Frontiers in Immunology. 5, 459 (2014).</li><li>Lange, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Galleria+mellonella:+A+Novel+Invertebrate+Model+to+Distinguish+Intestinal+Symbionts+From+Pathobionts.">Galleria mellonella: A Novel Invertebrate Model to Distinguish Intestinal Symbionts From Pathobionts.</a> Frontiers in Immunology. 9 (2114), (2018).</li><li>Tsai, C. J., Loh, J. M., Proft, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Galleria+mellonella+infection+models+for+the+study+of+bacterial+diseases+and+for+antimicrobial+drug+testing.">Galleria mellonella infection models for the study of bacterial diseases and for antimicrobial drug testing.</a> Virulence. , 1-16 (2016).</li><li>Bolouri Moghaddam, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+potential+of+the+Galleria+mellonella+innate+immune+system+is+maximized+by+the+co-presentation+of+diverse+antimicrobial+peptides.">The potential of the Galleria mellonella innate immune system is maximized by the co-presentation of diverse antimicrobial peptides.</a> Biological Chemistry. 397 (9), 939-945 (2016).</li><li>Casanova-Torres, A. M., Goodrich-Blair, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+Signaling+and+Antimicrobial+Peptide+Expression+in+Lepidoptera.">Immune Signaling and Antimicrobial Peptide Expression in Lepidoptera.</a> Insects. 4 (3), 320-338 (2013).</li><li>Mukherjee, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Galleria+mellonella+as+a+model+system+for+studying+Listeria+pathogenesis.">Galleria mellonella as a model system for studying Listeria pathogenesis.</a> Applied and Environmental Microbiology. 76 (1), 310-317 (2010).</li><li>Brennan, M., Thomas, D. Y., Whiteway, M., Kavanagh, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlation+between+virulence+of+Candida+albicans+mutants+in+mice+and+Galleria+mellonella+larvae.">Correlation between virulence of Candida albicans mutants in mice and Galleria mellonella larvae.</a> FEMS Immunological and Medical Microbiology. 34 (2), 153-157 (2002).</li><li>Miyata, S., Casey, M., Frank, D. W., Ausubel, F. M., Drenkard, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+the+Galleria+mellonella+caterpillar+as+a+model+host+to+study+the+role+of+the+type+III+secretion+system+in+Pseudomonas+aeruginosa+pathogenesis.">Use of the Galleria mellonella caterpillar as a model host to study the role of the type III secretion system in Pseudomonas aeruginosa pathogenesis.</a> Infection and Immunity. 71 (5), 2404-2413 (2003).</li><li>Waidmann, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacteroides+vulgatus+protects+against+Escherichia+coli-induced+colitis+in+gnotobiotic+interleukin-2-deficient+mice.">Bacteroides vulgatus protects against Escherichia coli-induced colitis in gnotobiotic interleukin-2-deficient mice.</a> Gastroenterology. 125 (1), 162-177 (2003).</li><li>Lange, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extensive+Mobilome-Driven+Genome+Diversification+in+Mouse+Gut-Associated+Bacteroides+vulgatus+mpk.">Extensive Mobilome-Driven Genome Diversification in Mouse Gut-Associated Bacteroides vulgatus mpk.</a> Genome Biology and Evolution. 8 (4), 1197-1207 (2016).</li><li>Hermann-Bank, M. L., Skovgaard, K., Stockmarr, A., Larsen, N., Molbak, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Gut+Microbiotassay:+a+high-throughput+qPCR+approach+combinable+with+next+generation+sequencing+to+study+gut+microbial+diversity.">The Gut Microbiotassay: a high-throughput qPCR approach combinable with next generation sequencing to study gut microbial diversity.</a> BMC Genomics. 14, 788 (2013).</li><li>Sato, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=OmpA+variants+affecting+the+adherence+of+ulcerative+colitis-derived+Bacteroides+vulgatus.">OmpA variants affecting the adherence of ulcerative colitis-derived Bacteroides vulgatus.</a> Journal of Medical and Dental Science. 57 (1), 55-64 (2010).</li><li>Freitak, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+maternal+transfer+of+bacteria+can+mediate+trans-generational+immune+priming+in+insects.">The maternal transfer of bacteria can mediate trans-generational immune priming in insects.</a> Virulence. 5 (4), 547-554 (2014).</li><li>Pfaffl, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+mathematical+model+for+relative+quantification+in+real-time+RT-PCR.">A new mathematical model for relative quantification in real-time RT-PCR.</a> Nucleic Acids Research. 29 (9), 45 (2001).</li><li>Ramarao, N., Nielsen-Leroux, C., Lereclus, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+insect+Galleria+mellonella+as+a+powerful+infection+model+to+investigate+bacterial+pathogenesis.">The insect Galleria mellonella as a powerful infection model to investigate bacterial pathogenesis.</a> Journal of Visualized Experiments. (70), e4392 (2012).</li><li>Ramarao, N., Nielsen-Leroux, C., Lereclus, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+insect+Galleria+mellonella+as+a+powerful+infection+model+to+investigate+bacterial+pathogenesis.">The insect Galleria mellonella as a powerful infection model to investigate bacterial pathogenesis.</a> Journal of Visualized Experiments. (70), e4392 (2012).</li></ol>

G. mellonella model er en hyppigt anvendt model til at vurdere bakteriel virulens faktorer i en systemisk infektion tilgang21. Da mange patogener og bakterier Indtast vært via mundtlige kolonisering eller infektion rute, skal ny indsigt findes til at evaluere G. mellonella som en model for mundtlige kolonisering og infektion.
Muligheden for at bageste G. mellonella mellem 15-37 ° C er en stor fordel, da de fleste pattedyr modeller opretholde...

Den intestinale microbiome er et væsentligt element for opretholdelsen af homøostase, og involverer både medfødte og adaptive immunrespons1,2. Commensal mikrobiota samfund er karakteriseret ved forskellige commensal hovedbestanddele: symbionter, der giver gavnlige virkninger af vigtigt, immunmodulerende funktioner og pathobionts, som kan have skadelige virkninger genetisk disponerede vært og fremme og udløse tarmbetændelse3,4. Mange undersøgelser på symbionter og pathobionts og deres indflydelse på immunsystemet vært er blevet offentliggjort primært studerer adaptive immunrespons.
Da disse undersøgelser omfatter mange dyr til undersøgelserne og beskyttelse og udskiftning af dyr, der anvendes til forsøg er at øge offentlighedens interesse, søger vi at finde en erstatning model til at tillade en screening af forskellige bakterielle immunogen egenskaber. Insekter, især barciak, er en meget anvendt erstatning model i infektion forskning. G. mellonella kombinerer forskellige fordele såsom lave omkostninger og høj produktivitet; Det giver mulighed for oral administration af bakterier, som er den naturlige eksponeringsvej, og det giver mulighed for systemisk infektion5,6. G. mellonella yderligere muliggør inkubation ved 37 ° C, som er den fysiologiske kropstemperatur af pattedyr og optimalt for bakteriel virulens faktor udtryk5. Den største fordel ved G. mellonella er den bevarede medfødte immunsystem, der giver mulighed for forskelsbehandling af selv fra ikke-selv og koder en bred vifte af mønster anerkendelse receptorer som apolipophorin eller opsonin hemolin6, 7. på mikrobe anerkendelse, G. mellonella kan udløse forskellige downstream humorale immunrespons. Det kan fremkalde oxidativt stress svar og udskiller reaktive ilt arter (ROS), som omfatter aktivitet af NOS (salpetersyre oxidase syntase) og NOX (NADPH oxidase)6,8. Derudover G. mellonella aktiveres en potent antimikrobielt peptid (AMP) svar, hvilket resulterer i udskillelsen af en blanding af forskellige forstærkere som gloverin, moricin, cecropin eller defensin-lignende gallerimycin6, 8,9,10. Generelt, forstærkere har ret brede værtsspecificitet mod Gram-positive og Gram-negative bakterier og svampe og er nødt til at give en potent svar da insekter mangler enhver adaptiv respons10. Gloverin er en AMP aktive mod bakterier og svampe og hæmmer ydre membran dannelse6,11. Moricins udstiller deres antimikrobielle funktion mod Gram-positive og Gram-negative bakterier af gennemtrængende membranen og danner en pore9,11. Cecropins give aktivitet mod bakterier og svampe og permeabilize membran på samme måde som moricins9,10. Gallerimycin er en defensin-lignende peptid med anti-svampe egenskaber9. Interessant, konstateredes det, at kombinationen af cecropin og gallerimycin havde en synergistisk aktivitet mod E. coli10.
På grund af deres let-at-bruge karakter G. mellonella er larver en ofte brugt infektion model til at vurdere bakteriel sygdomsfremkaldende evne. Især korrelerer undersøgelser i hvilke data fra G. mellonella med data fra mus støtte styrken af denne alternative host model. Det konstateredes, at de mest patogene serotyper af Listeria monocytogenes i en musemodel infektion også medføre højere dødelighed i G. mellonella efter systemisk infektion. Yderligere, mindre virulente serotyper viste sig for at være også mindre virulente i G. mellonella model12. Lignende observationer er gjort med de menneskelige patogene svampe Candida albicans. Virulens af forskellige C. albicans stammer, der er blevet vurderet af systemisk infektion og efterfølgende overvågning af larve overlevelse. Musen Avirulente stammer blev også Avirulente eller udstillede reduceret virulens i G. mellonella, mens musen virulente stammer fører også til høj larve dødelighed13. G. mellonella model kan yderligere bruges til at identificere type 3 sekretion system sygdomsfremkaldende faktorer af Pseudomonas aeruginosa14.
Da de fleste undersøgelser der involverer G. mellonella var fokuseret på virulens faktorer ved hjælp af metoden med systemisk infektion var vi især interesseret i at levere en metode egnet for analysen af intestinal latente i en mundtlig tvangsfodring model, vi kan anvende en særskilt dosering af bakterier pr. larver og ikke kun overholde larve dødeligheden men analysere forskellige stempler af medfødte immunrespons at opretholde intestinal homeostase.
Vores metode hjælper med at øge brugen af G. mellonella som en erstatning model, da vi kombinerer anvendelsen af bakterier og analyse af RNA udtryk. Det er ikke kun nyttig til at styrke betydningen af bakteriel patogenese undersøgelser, når herunder analyse af immunrespons efter oral administration og ikke kun observationer af dødelighed efter systemisk infektion. Vores metoder giver mulighed for analyse af immunogen egenskaber af bakteriel apatogene latente da det giver mere komplekse forhold end cellekultur ved at tilbyde en tarm barriere i en levende organisme.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:701px;" width="702">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">1.5 mL tubes</td>
			<td style="width:200px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:119px;">0030120086</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">100 bp DNA ladder&#160;</td>
			<td style="width:200px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">15628019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1-Bromo-3-Chloropropane (BCP)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">B9673</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">2 mL tubes</td>
			<td style="width:200px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:119px;">0030120094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">2x Mangomix</td>
			<td style="width:200px;">Bioline</td>
			<td style="width:119px;">BIO-25033</td>
			<td>Colony PCR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">50 mL tubes</td>
			<td style="width:200px;">Greiner Bio-One</td>
			<td style="width:119px;">210 261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Agarose</td>
			<td style="width:200px;">Biozym</td>
			<td style="width:119px;">840004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Beeswax</td>
			<td style="width:200px;">Mixed-Store.de</td>
			<td style="width:119px;">&#160;-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Brain heart infusion broth</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">CM1135</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CloneJET PCR Cloning Kit</td>
			<td style="width:200px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">K1232</td>
			<td>Cloning vector for 16S fragments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Corn grits</td>
			<td style="width:200px;">Osterm&#252;hle Naturkost GmbH</td>
			<td style="width:119px;">306</td>
			<td>Organic cultivation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Difco LB Agar, Miller (Luria-Bertani)</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td style="width:119px;">BD</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Difoco LB Broth, Miller (Luria-Bertani)</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td style="width:119px;">244610</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DNA-free DNA Removal Kit&#160;</td>
			<td style="width:200px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">244510</td>
			<td>&#160;Dnase digestion</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dried yeast</td>
			<td style="width:200px;">Rapunzel</td>
			<td style="width:119px;">&#160;-</td>
			<td>Organic cultivation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dulbecco&#39;s Phosphate-Buffered Saline (DPBS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">14040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Ethanol</td>
			<td style="width:200px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">20821.330</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">W252506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Honey</td>
			<td style="width:200px;">Osterm&#252;hle Naturkost GmbH</td>
			<td style="width:119px;">487</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Isopropanol&#160;</td>
			<td style="width:200px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">20842.330</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Lightcycler 480 Instrument II</td>
			<td style="width:200px;">Roche Molecular Systems</td>
			<td style="width:119px;">5015278001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">LightCycler 480 Multiwell Plate 96, white</td>
			<td style="width:200px;">Roche Molecular Systems</td>
			<td style="width:119px;">4729692001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Manual Microsyringe Pump with Digital Display</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td style="width:119px;">DMP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Micro-Fine+ U-100 insulin syringe 0.3 x 8 mm</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td style="width:119px;">324826</td>
			<td>Oral administration</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Mortar, unglazed</td>
			<td style="width:200px;">VWR</td>
			<td>410-9327&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nanodrop</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">13-400-518</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nuclease-free water&#160;</td>
			<td style="width:200px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">10977035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Oxoid AnaeroGen sachets&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">AN0025A</td>
			<td>Quality and quantity of RNA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">PCR stripes</td>
			<td style="width:200px;">Biozym</td>
			<td style="width:119px;">710970</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Pestle, unglazed grinding surface</td>
			<td style="width:200px;">VWR</td>
			<td>410-9324&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phusion proof-reading enzyme&#160;</td>
			<td style="width:200px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">F553S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Primers</td>
			<td style="width:200px;">Biomers</td>
			<td style="width:119px;">&#160;-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">PureYield Plasmid Miniprep System</td>
			<td style="width:200px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;">A1222</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">QuantiFast SYBR Green PCR kit&#160;</td>
			<td style="width:200px;">Qiagen</td>
			<td style="width:119px;">204056</td>
			<td>qPCR for bacterial copy number measurment</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">QuantiFast SYBR Green RT-PCR Kit&#160;</td>
			<td style="width:200px;">Qiagen</td>
			<td>204156</td>
			<td>qRT-PCR for gene expression measurements</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">QuantiTect Reverse Transcription Kit&#160;</td>
			<td style="width:200px;">Qiagen</td>
			<td style="width:119px;">205311</td>
			<td>cDNA synthesis</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Qubit Assay Tubes</td>
			<td style="width:200px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">Q32856</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Qubit dsHS DNA kit&#160;</td>
			<td style="width:200px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">Q32851</td>
			<td>Quantification of plasmid and cDNA samples</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Qubit fluorometer</td>
			<td style="width:200px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">Q33226</td>
			<td>Quantification of plasmid and cDNA samples</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">RNase-ExitusPlus</td>
			<td style="width:200px;">AppliChem</td>
			<td style="width:119px;">A7153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Rnasin Ribonuclease Inhibitor</td>
			<td style="width:200px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;">N2511</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Skimmed milk powder</td>
			<td>Sucofin</td>
			<td style="width:119px;">&#160;-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">SYBR safe DNA Gel Stain</td>
			<td style="width:200px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">S33102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TRI reagent&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">T9424</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Weighing boat</td>
			<td>VWR</td>
			<td style="width:119px;">10803-148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Wheat meal</td>
			<td style="width:200px;">Osterm&#252;hle Naturkost GmbH</td>
			<td style="width:119px;">6462</td>
			<td>Organic cultivation</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a galleria mellonella oral administration model to study commensal-induced innate immune responses

Undersøgelse af commensal bakterier på immunsystemet vært immunogen potentiale er et vigtigt element når man studerer intestinal vært-mikrobe interaktioner. Det er veletableret, at forskellige latente udviser en anderledes potentiale til at stimulere vært intestinal immunsystemet. Disse undersøgelser omfatter hvirveldyr, især gnavere. Eftersom stigende etiske bekymringer er forbundet med eksperimenter, der involverer hvirveldyr, er der en høj efterspørgsel efter hvirvelløse udskiftninger modeller.
Her give vi et barciak oral administration model ved hjælp af commensal ikke-sygdomsfremkaldende bakterier og de mulige vurdering af latente immunogen potentiale på immunsystemet G. mellonella . Vi demonstrere, at G. mellonella er et nyttigt alternativ hvirvelløse udskiftning model, der giver mulighed for analyse af latente med forskellige immunogen potentiale som Bacteroides vulgatus og Escherichia coli. Interessant, udstillet bakterier ingen dræbende virkning på larverne, der ligner pattedyr. Immunrespons af G. mellonella var sammenlignelige med hvirveldyr medfødte immunrespons og inddrage anerkendelse af bakterier og produktion af antimikrobielle molekyler. Vi foreslår, at G. mellonella var i stand til at gendanne tidligere mikrobiota balance, som er kendt fra sunde pattedyr individer. Selv om at levere sammenlignelige medfødte immunrespons i både G. mellonella og hvirveldyr, havnen G. mellonella ikke en adaptive immunsystem. Da de undersøgte komponenter af den medfødte immunsystem er evolutionær bevaret, modellen giver mulighed for en prescreening og første analyse af bakterielle immunogen egenskaber.

G. mellonella hemolymph infektion model i almindeligt anvendt til at analysere virulens faktorer i et stort udvalg af patogener. De fleste målinger omfatter analyse af larver dødelighed, som er en ganske let metode. Ikke desto mindre, denne metode ikke tillade konklusioner om immunrespons i almindelighed og sammenkæde resultaterne af G. mellonella immunrespons med hvirveldyr immun mekanismer. G. mellonella oral administration model bruges på den anden side k...

Watch this Scientific Journal Video about A Galleria mellonella Oral Administration Model to Study Commensal-Induced Innate Immune Responses at JoVE.com

A Galleria mellonella Oral Administration Model to Study Commensal-Induced Innate Immune Responses

Her, vi leverer en detaljeret protokol for en oral administration model ved hjælp af barciak larver og hvordan til at karakterisere induceret medfødte immunrespons. Bruger denne protokol, vil forskere uden praktisk erfaring være i stand til at bruge G. mellonella tvangsfodring metode.

En barciak Oral Administration Model til Study Commensal-Induced medfødte immunrespons

The investigation of the immunogenic potential of commensal bacteria on the host immune system is one essential component when studying intestinal ...

Vores protokol udvider brugen af G.mellonella fra en systemisk infektion model til en model, der tillader bakteriel administration via den naturlige orale rute. G.mellonella er en egnet erstatningsmodel for gnavere til at analysere forskellige kendetegn ved medfødte mikro-post interaktioner, da larverne kan bruges til humane patogene bakterier. Begynd med at overføre æggene lagt af voksne møl til to liter kasser, der indeholder voks møl substrat, ved 30 grader Celsius, i mørke.Efter en til to uger overføres 25 gram larver indeholdende substrat til frisk substrat, når små og små larver bliver synlige. Synkroniser larverne efter to uger i henhold til deres størrelse, i grupper på 30 til 40 larver i nye to liters beholdere på voks møl substrat. Efter to uger skal du vælge larver til eksperimentet efter vægt.Brug kun bleg, hurtigt bevægende larver med en masse på 180 til 200 milligram. For at tvinge larverne til at veje skal en insulinsprøjte veje med en stumpnedende nål til oral påføring med en gange 10 til den syvende bakterie pr. 10 mikroliter DPBS pr. larver. Læg sprøjten i en mikrosyringspumpe.Vent på, at en larver åbner munden, før sprøjten indsættes forsigtigt mellem underkæberne og leverer bakterierne. Når alle larver er blevet fodret, inkubere dyrene i mørke ved 37 grader Celsius, mellem en til 24 timer. Til lavebehandling rengøres en sikkerhedshætte med ethanol og sprayrenser for at forhindre RNase-kontaminering.Snap fryse levende larver i flydende nitrogen. Homogeniser hver enkelt frossen larver ved hjælp af en morter og støder og en lille mængde flydende nitrogen. Når der er produceret en pulveriseret homogenat, overføres homogenatet til en engangskølebåd, og væskens nitrogen fordampes.Når hele larven er homogeniseret, blandes de pulveriserede homogenater med en milliliter TRIzol i et rør med to milliliter. Inkuber blandingen ved stuetemperatur i en time. Ved inkubationens afslutning pellets homogenatet ved centrifugering.Overfør supernatanten til et nyt rør. Bland supernatanten med 200 mikroliter af 1-Bromo-3-chloropropan eller BCP. Vortex og inkubere i fem minutter ved stuetemperatur, efterfulgt af en 10 minutters inkubation på is.Ved afslutningen af den anden inkubation tilføjede centrifuge bcp'en reaktion og overfør det øverste gennemsigtige lag til et nyt, to milliliterrør. Udfælde RNA af det overførte øverste lag med 500 mikroliter isopropanol ved at blande og vende røret i fem minutter. Derefter indsamles bundfaldet RNA ved centrifugering.Den udfældede RNA-pellet vaskes med 500 mikroliter på 75 % ethanol, og RNA tørres i fem til 10 minutter ved stuetemperatur. Når ethanolen er fordampet, tilsættes 100 mikroliter ribonucleasehæmmer i nukleasefrit vand til den tørrede RNA-pellet, og røret, indtil pellets er helt opløst, tilsættes. Mål RNA-kvaliteten og -kvantiteten efter standardprotokoller, hvilket sikrer, at forholdet mellem 260 og 280 er ca. to, og at forholdet 260 til 230 ligger i intervallet to til 2,2.Brug derefter fem mikrogram af det isolerede RNA til DNase-fordøjelse og genudtryksanalyse i henhold til standardprotokoller. G.mellonella er i stand til at rydde den oprindelige kraft fodret bakteriel belastning, indtil ingen bakterier kan påvises. Med 16'erne genkopi numre af både B.vulgatus og E.coli væsentligt faldt inden for 24 timer.Commensal administreret en G.mellonella larver fremkalde RNA genekspression af forskellige medfødte immunitet markør gener. For eksempel udtrykkes LPS-genkendelsesmolekylerne, apolipophorin og hemolin generelt højere i E.coli-administrerede larver sammenlignet med B.vulgatus administrerede larver. Endvidere er produktionen af reaktiv ilt og nitrogenarter stærkt upregulated på E.coli kraft fodring i forhold til B.vulgatus, samt antioxidative GST genekspression.Desuden induceres differentialemikrobielt peptidsudtryk stærkere efter E.coli-administration end som reaktion på B.vulgatus kraftfodring. Husk at bruge kun sunde, hvide, hurtigt bevægelige larver, at bruge tålmodighed under kraft fodring for at undgå at understrege larver og til at omfatte alle de nødvendige kontroller. Aktiveringen af G.mellonella immun markører kan bestemmes direkte ved RUS eller GST aktivitet analyser og tæthed af ANPs kan bestemmes af bakteriel vækst hæmning assays.Denne teknik kan bruges som screeningsværktøj for kommensale og patogene bakterier og til udforskning af tarm symbiomer og patobiomes uden ofring af mange hvirveldyr. Brug altid det relevante personlige værnemiddel, når du arbejder med flydende nitrogen, BCP eller TRIzol stoffer.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

A Galleria mellonella Oral Administration Model to Study Commensal-Induced Innate Immune Responses

The Insect Galleria mellonella as a Powerful Infection Model to Investigate Bacterial Pathogenesis

The Insect Galleria mellonella as a Powerful Infection Model to Investigate Bacterial Pathogenesis

The Insect<em&gt; Galleria mellonella</em&gt; Som en kraftfuld Infektion modellen til bakteriel patogenese

The study of bacterial virulence often requires a suitable animal model. Mammalian models of infection are costly and may raise ethical issues. The use of ...

An In vitro Model to Study Immune Responses of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells to Human Respiratory Syncytial Virus Infection

An In vitro Model to Study Immune Responses of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells to Human Respiratory Syncytial Virus Infection

Human respiratory syncytial  virus (HRSV) infections present a broad spectrum of disease severity, ranging  from mild infections to life-threatening ...

Use of Galleria mellonella as a Model Organism to Study Legionella pneumophila Infection

Use of Galleria mellonella as a Model Organism to Study Legionella pneumophila Infection

Anvendelse af<em&gt; Galleria mellonella</em&gt; Som en model organisme til at studere<em&gt; Legionella pneumophila</em&gt; Infektion

Legionella pneumophila, the causative agent of a severe pneumonia named Legionnaires&#39; disease, is an important human pathogen that infects and ...

Dissecting Innate Immune Signaling in Viral Evasion of Cytokine Production

Dissekere medfødte immunforsvar signalering i Viral Evasion af cytokinproduktion

In response to a viral infection, the host innate immune response is activated to up-regulate gene expression and production of antiviral cytokines. ...

Using RNA-interference to Investigate the Innate Immune Response in Mouse Macrophages

Brug af RNA-interferens Undersøge Innate immunresponset i musemakrofager

Macrophages are key phagocytic innate immune cells.  When macrophages encounter a pathogen, they produce antimicrobial proteins and compounds to kill the ...

Non-invasive Imaging of the Innate Immune Response in a Zebrafish Larval Model of Streptococcus iniae Infection

Non-invasive Imaging of the Innate Immune Response in a Zebrafish Larval Model of Streptococcus iniae Infection

Ikke-invasiv billeddannelse af Innate immunrespons i en zebrafisk Larve Model af<em&gt; Streptococcus iniae</em&gt; Infektion

The aquatic pathogen, Streptococcus iniae, is responsible for over 100 million dollars in annual losses for the aquaculture industry and is capable of ...

Increased Recovery Time and Decreased LPS Administration to Study the Vagus Nerve Stimulation Mechanisms in Limited Inflammatory Responses

Øget Recovery Time og Nedsat LPS administration til at undersøge den Vagus nerve stimulation Mekanismer i Begrænsede inflammatoriske reaktioner

Inflammation is a local response to infection and tissue damage mediated by activated macrophages, monocytes, and other immune cells that release ...

The Galleria mellonella Waxworm Infection Model for Disseminated Candidiasis

The Galleria mellonella Waxworm Infection Model for Disseminated Candidiasis

Barciak Waxworm infektion Model for formidlet Candidiasis

Candida species are common fungal commensals of humans colonizing the skin, mucosal surfaces, and gastrointestinal tract. Under certain conditions, ...

A Mouse Model to Assess Innate Immune Response to Staphylococcus aureus Infection

A Mouse Model to Assess Innate Immune Response to Staphylococcus aureus Infection

En musemodel at vurdere medfødte immunrespons for Staphylococcus aureus infektioner

Staphylococcus aureus (S. aureus)&#160;infections, including methicillin resistant stains, are an enormous burden on the healthcare system. With incidence ...

Use of the Invertebrate Galleria mellonella as an Infection Model to Study the Mycobacterium tuberculosis Complex

Use of the Invertebrate Galleria mellonella as an Infection Model to Study the Mycobacterium tuberculosis Complex

Brug af invertebrate Galleria mellonella som en infektions model til undersøgelse af Mycobacterium tuberkulose komplekset

Tuberculosis is the leading global cause of infectious disease mortality and roughly a quarter of the world&#8217;s population is believed to be infected ...