Name: a galleria mellonella oral administration model to study commensal-induced innate immune responses
Uploaded: 2019-03-21T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Galleria mellonella Oral Administration Model to Study Commensal-Induced Innate Immune Responses at JoVE.com

Dit werk werd gefinancierd door de DFG (SPP1656), het hulpprogramma voor het opleiding van de DFG-onderzoeksgroep 1708, het Bundesministerium für Bildung und Forschung (goedgekeurd) en het Duitse centrum voor onderzoek (DZIF) van de infecties.

1. G. mellonella fokken en voorbereiding van de larven van de experimenten
Opmerking: De cyclus van ei tot de laatste instar larve duurt ongeveer 5-6 weken.
<ol><li>Breng de eieren gelegd door volwassen vlinders en aan 2 L dozen met grisella substraat (22% maïs grutten, 22% tarwe maaltijd, 17,5% bijenwas, 11% magere-melkpoeder, 11% honing, 11% glycerol, 5,5% gedroogd gist). De gehele fokken bij 30 ° C in het donker uit te voeren.</li>
	<li>Overdracht van 25 g van substraat met de ...

<ol>
	<li>Nell, S., Suerbaum, S., Josenhans, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+impact+of+the+microbiota+on+the+pathogenesis+of+IBD:+lessons+from+mouse+infection+models.">The impact of the microbiota on the pathogenesis of IBD: lessons from mouse infection models.</a> Nature Reviews Microbiology. 8 (8), 564-577 (2010).</li><li>Muniz, L. R., Knosp, C., Yeretssian, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+antimicrobial+peptides+during+homeostasis,+infection,+and+disease.">Intestinal antimicrobial peptides during homeostasis, infection, and disease.</a> Frontiers in Immunology. 3, 310 (2012).</li><li>Ivanov, I. I., Honda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+commensal+microbes+as+immune+modulators.">Intestinal commensal microbes as immune modulators.</a> Cell Host Microbe. 12 (4), 496-508 (2012).</li><li>Ayres, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammasome-microbiota+interplay+in+host+physiologies.">Inflammasome-microbiota interplay in host physiologies.</a> Cell Host Microbe. 14 (5), 491-497 (2013).</li><li>Champion, O. L., Titball, R. W., Bates, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standardization+of+G.+mellonella+Larvae+to+Provide+Reliable+and+Reproducible+Results+in+the+Study+of+Fungal+Pathogens.">Standardization of G. mellonella Larvae to Provide Reliable and Reproducible Results in the Study of Fungal Pathogens.</a> Journal of Fungi (Basel). 4 (3), (2018).</li><li>Wojda, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunity+of+the+greater+wax+moth+Galleria+mellonella.">Immunity of the greater wax moth Galleria mellonella.</a> Insect Science. , (2016).</li><li>Buchmann, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+Innate+Immunity:+Clues+from+Invertebrates+via+Fish+to+Mammals.">Evolution of Innate Immunity: Clues from Invertebrates via Fish to Mammals.</a> Frontiers in Immunology. 5, 459 (2014).</li><li>Lange, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Galleria+mellonella:+A+Novel+Invertebrate+Model+to+Distinguish+Intestinal+Symbionts+From+Pathobionts.">Galleria mellonella: A Novel Invertebrate Model to Distinguish Intestinal Symbionts From Pathobionts.</a> Frontiers in Immunology. 9 (2114), (2018).</li><li>Tsai, C. J., Loh, J. M., Proft, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Galleria+mellonella+infection+models+for+the+study+of+bacterial+diseases+and+for+antimicrobial+drug+testing.">Galleria mellonella infection models for the study of bacterial diseases and for antimicrobial drug testing.</a> Virulence. , 1-16 (2016).</li><li>Bolouri Moghaddam, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+potential+of+the+Galleria+mellonella+innate+immune+system+is+maximized+by+the+co-presentation+of+diverse+antimicrobial+peptides.">The potential of the Galleria mellonella innate immune system is maximized by the co-presentation of diverse antimicrobial peptides.</a> Biological Chemistry. 397 (9), 939-945 (2016).</li><li>Casanova-Torres, A. M., Goodrich-Blair, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+Signaling+and+Antimicrobial+Peptide+Expression+in+Lepidoptera.">Immune Signaling and Antimicrobial Peptide Expression in Lepidoptera.</a> Insects. 4 (3), 320-338 (2013).</li><li>Mukherjee, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Galleria+mellonella+as+a+model+system+for+studying+Listeria+pathogenesis.">Galleria mellonella as a model system for studying Listeria pathogenesis.</a> Applied and Environmental Microbiology. 76 (1), 310-317 (2010).</li><li>Brennan, M., Thomas, D. Y., Whiteway, M., Kavanagh, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlation+between+virulence+of+Candida+albicans+mutants+in+mice+and+Galleria+mellonella+larvae.">Correlation between virulence of Candida albicans mutants in mice and Galleria mellonella larvae.</a> FEMS Immunological and Medical Microbiology. 34 (2), 153-157 (2002).</li><li>Miyata, S., Casey, M., Frank, D. W., Ausubel, F. M., Drenkard, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+the+Galleria+mellonella+caterpillar+as+a+model+host+to+study+the+role+of+the+type+III+secretion+system+in+Pseudomonas+aeruginosa+pathogenesis.">Use of the Galleria mellonella caterpillar as a model host to study the role of the type III secretion system in Pseudomonas aeruginosa pathogenesis.</a> Infection and Immunity. 71 (5), 2404-2413 (2003).</li><li>Waidmann, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacteroides+vulgatus+protects+against+Escherichia+coli-induced+colitis+in+gnotobiotic+interleukin-2-deficient+mice.">Bacteroides vulgatus protects against Escherichia coli-induced colitis in gnotobiotic interleukin-2-deficient mice.</a> Gastroenterology. 125 (1), 162-177 (2003).</li><li>Lange, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extensive+Mobilome-Driven+Genome+Diversification+in+Mouse+Gut-Associated+Bacteroides+vulgatus+mpk.">Extensive Mobilome-Driven Genome Diversification in Mouse Gut-Associated Bacteroides vulgatus mpk.</a> Genome Biology and Evolution. 8 (4), 1197-1207 (2016).</li><li>Hermann-Bank, M. L., Skovgaard, K., Stockmarr, A., Larsen, N., Molbak, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Gut+Microbiotassay:+a+high-throughput+qPCR+approach+combinable+with+next+generation+sequencing+to+study+gut+microbial+diversity.">The Gut Microbiotassay: a high-throughput qPCR approach combinable with next generation sequencing to study gut microbial diversity.</a> BMC Genomics. 14, 788 (2013).</li><li>Sato, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=OmpA+variants+affecting+the+adherence+of+ulcerative+colitis-derived+Bacteroides+vulgatus.">OmpA variants affecting the adherence of ulcerative colitis-derived Bacteroides vulgatus.</a> Journal of Medical and Dental Science. 57 (1), 55-64 (2010).</li><li>Freitak, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+maternal+transfer+of+bacteria+can+mediate+trans-generational+immune+priming+in+insects.">The maternal transfer of bacteria can mediate trans-generational immune priming in insects.</a> Virulence. 5 (4), 547-554 (2014).</li><li>Pfaffl, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+mathematical+model+for+relative+quantification+in+real-time+RT-PCR.">A new mathematical model for relative quantification in real-time RT-PCR.</a> Nucleic Acids Research. 29 (9), 45 (2001).</li><li>Ramarao, N., Nielsen-Leroux, C., Lereclus, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+insect+Galleria+mellonella+as+a+powerful+infection+model+to+investigate+bacterial+pathogenesis.">The insect Galleria mellonella as a powerful infection model to investigate bacterial pathogenesis.</a> Journal of Visualized Experiments. (70), e4392 (2012).</li><li>Ramarao, N., Nielsen-Leroux, C., Lereclus, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+insect+Galleria+mellonella+as+a+powerful+infection+model+to+investigate+bacterial+pathogenesis.">The insect Galleria mellonella as a powerful infection model to investigate bacterial pathogenesis.</a> Journal of Visualized Experiments. (70), e4392 (2012).</li></ol>

Het model van G. mellonella is een vaak gebruikte model te beoordelen van bacteriële virulentiefactoren in een systemische infectie aanpak21. Aangezien veel ziekteverwekkers en bacteriën voer de host via de orale toediening van kolonisatie of infectie, moeten nieuwe inzichten worden gevonden om te evalueren van G. mellonella als een model voor mondelinge kolonisatie en infectie.
De mogelijkheid tot achterzijde G. mellonella tussen 15-37 ° C...

De intestinale microbiome is een essentieel onderdeel voor onderhoud van homeostase, en omvat zowel aangeboren en adaptieve immuunresponsen1,2. De commensale microbiota Gemeenschap wordt gekenmerkt door verschillende commensale hoofdbestanddelen: symbionten die gunstige effecten door belangrijke immunomodulerende functies en pathobionts die nadelige gevolgen kunnen hebben, genetisch vatbaar verlenen gastheren en bevorderen en leiden tot darmontstekingen3,4. Veel studies over symbionten en pathobionts en hun invloed op het immuunsysteem van de gastheer verschenen hoofdzakelijk het bestuderen van adaptieve immuunrespons.
Aangezien deze studies veel dieren voor het onderzoek en de bescherming omvatten en vervanging van dieren die voor experimenten is van toenemende publieke belangstelling, willen wij een vervanging model te staan voor een screening van verschillende bacteriële immunogene vinden Eigenschappen. Insecten, vooral wasmot, zijn een gebruikte vervanging model in het onderzoek van de infectie. G. mellonella combineert verschillende voordelen zoals lage kosten en hoge doorvoer; Hierdoor orale toediening van bacteriën, die de natuurlijke blootstellingsroute is, en het zorgt voor systemische infectie5,6. G. mellonella verder kunt incubatie bij 37 ° C, oftewel de fysiologische lichaamstemperatuur van zoogdieren en de optimale voor bacteriële virulentie factor expressie5. Het belangrijkste voordeel van G. mellonella is het geconserveerde ingeboren immune systeem waarmee de discriminatie van het zelf van niet-zelf en codeert een verscheidenheid van patroon erkenning receptoren zoals apolipophorin of de opsonin hemolin6, 7. bij microbe opname, G. mellonella kan leiden tot verschillende downstream humorale immuunreacties. Het kan induceren oxidatieve stress reacties en afscheiden van reactieve zuurstof soorten (ROS), waarbij de activiteit van de NOS (nitraat oxidase synthase) en NOX (NADPH oxidase)6,8. Bovendien, G. mellonella activeert een potente antimicrobiële peptide (AMP) antwoord, wat in de afscheiding van een mengsel van verschillende versterkers zoals gloverin, moricin, cecropin of de defensin-achtige gallerimycin6, resulteert 8109,,. In het algemeen, versterkers hebben nogal breed gastheerspecificiteit tegen gram-positieve en gram-negatieve bacteriën en schimmels en hebben een krachtig antwoord geven aangezien insecten een adaptieve reactie10 ontbreken. Gloverin is een versterker actief tegen bacteriën en schimmels en remt de buitenmembraan vorming6,11. Moricins exposeren hun antimicrobiële functie tegen gram-positieve en gram-negatieve bacteriën door het membraan te penetreren en de vorming van een porie9,11. Cecropins bieden activiteit tegen bacteriën en schimmels en het membraan ook zoals moricins9,10permeabilize. Gallerimycin is een defensin-achtige peptide met anti-schimmel eigenschappen9. Interessant, bleek dat de combinatie van cecropin en gallerimycin had een synergetische activiteit tegen E. coli10.
Dank zij hun easy-to-use-karakter G. mellonella zijn larven een model van de vaak gebruikte infectie te beoordelen van bacteriële pathogeniteit. In het bijzonder correleren onderzoeken in welke gegevens verkregen uit G. mellonella met gegevens die zijn verkregen uit muizen ondersteuning de sterkte van deze alternatieve hostmodel. Bleek dat de meest pathogene serotypes van Listeria monocytogenes in een muismodel infectie ook tot hogere sterftecijfers in G. mellonella na systemische infectie leiden. Verder, minder virulente serotypen bleek te zijn ook minder virulente in de G. mellonella model12. Vergelijkbare waarnemingen hebben geboekt met de menselijke pathogene schimmels Candida albicans. Virulentie van verschillende C. albicans stammen is beoordeeld door systemische infectie en de daaropvolgende monitoring van larval survival. Muis Avirulente stammen waren ook Avirulente of tentoongestelde verminderde virulentie in G. mellonella, overwegende dat de muis virulente stammen ook tot hoge larvale sterfte13 leiden. De G. mellonella model kan verder worden gebruikt type 3 secretie systeem pathogeniteit factoren van Pseudomonas aeruginosa14te identificeren.
Aangezien de meeste onderzoeken waarbij G. mellonella richtten op virulentiefactoren met behulp van de systemische infectie aanpak waren we vooral geïnteresseerd in het verstrekken van een methode die geschikt is voor de analyse van intestinale commensals in een mondelinge dwangvoeding model waarin we kunnen een duidelijke dosering van bacteriën per larven toepassing en niet alleen het observeren van het larvale sterftecijfer maar analyseren verschillende kenmerken van aangeboren immuunresponsen te handhaven van intestinale homeostase.
Onze methode helpt bij het verhogen van het gebruik van G. mellonella als een vervanging model aangezien we de toepassing van de bacteriën en de analyse van RNA expressie combineren. Het is niet alleen nuttig voor het versterken van de zin van bacteriële pathogenese studies wanneer met inbegrip van de analyse van immuunresponsen na orale toediening en niet alleen de observatie van sterftecijfers na systemische infectie. Onze werkwijze zorgt voor de analyse van immunogene eigenschappen van bacteriële niet-pathogene commensals omdat het biedt meer complexe voorwaarden dan de cultuur van de cel door het aanbieden van een intestinale barrière in een levend organisme.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:701px;" width="702">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">1.5 mL tubes</td>
			<td style="width:200px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:119px;">0030120086</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">100 bp DNA ladder&#160;</td>
			<td style="width:200px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">15628019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1-Bromo-3-Chloropropane (BCP)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">B9673</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">2 mL tubes</td>
			<td style="width:200px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:119px;">0030120094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">2x Mangomix</td>
			<td style="width:200px;">Bioline</td>
			<td style="width:119px;">BIO-25033</td>
			<td>Colony PCR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">50 mL tubes</td>
			<td style="width:200px;">Greiner Bio-One</td>
			<td style="width:119px;">210 261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Agarose</td>
			<td style="width:200px;">Biozym</td>
			<td style="width:119px;">840004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Beeswax</td>
			<td style="width:200px;">Mixed-Store.de</td>
			<td style="width:119px;">&#160;-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Brain heart infusion broth</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">CM1135</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CloneJET PCR Cloning Kit</td>
			<td style="width:200px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">K1232</td>
			<td>Cloning vector for 16S fragments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Corn grits</td>
			<td style="width:200px;">Osterm&#252;hle Naturkost GmbH</td>
			<td style="width:119px;">306</td>
			<td>Organic cultivation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Difco LB Agar, Miller (Luria-Bertani)</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td style="width:119px;">BD</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Difoco LB Broth, Miller (Luria-Bertani)</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td style="width:119px;">244610</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DNA-free DNA Removal Kit&#160;</td>
			<td style="width:200px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">244510</td>
			<td>&#160;Dnase digestion</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dried yeast</td>
			<td style="width:200px;">Rapunzel</td>
			<td style="width:119px;">&#160;-</td>
			<td>Organic cultivation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dulbecco&#39;s Phosphate-Buffered Saline (DPBS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">14040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Ethanol</td>
			<td style="width:200px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">20821.330</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">W252506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Honey</td>
			<td style="width:200px;">Osterm&#252;hle Naturkost GmbH</td>
			<td style="width:119px;">487</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Isopropanol&#160;</td>
			<td style="width:200px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">20842.330</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Lightcycler 480 Instrument II</td>
			<td style="width:200px;">Roche Molecular Systems</td>
			<td style="width:119px;">5015278001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">LightCycler 480 Multiwell Plate 96, white</td>
			<td style="width:200px;">Roche Molecular Systems</td>
			<td style="width:119px;">4729692001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Manual Microsyringe Pump with Digital Display</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td style="width:119px;">DMP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Micro-Fine+ U-100 insulin syringe 0.3 x 8 mm</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td style="width:119px;">324826</td>
			<td>Oral administration</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Mortar, unglazed</td>
			<td style="width:200px;">VWR</td>
			<td>410-9327&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nanodrop</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">13-400-518</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nuclease-free water&#160;</td>
			<td style="width:200px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">10977035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Oxoid AnaeroGen sachets&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">AN0025A</td>
			<td>Quality and quantity of RNA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">PCR stripes</td>
			<td style="width:200px;">Biozym</td>
			<td style="width:119px;">710970</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Pestle, unglazed grinding surface</td>
			<td style="width:200px;">VWR</td>
			<td>410-9324&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phusion proof-reading enzyme&#160;</td>
			<td style="width:200px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">F553S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Primers</td>
			<td style="width:200px;">Biomers</td>
			<td style="width:119px;">&#160;-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">PureYield Plasmid Miniprep System</td>
			<td style="width:200px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;">A1222</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">QuantiFast SYBR Green PCR kit&#160;</td>
			<td style="width:200px;">Qiagen</td>
			<td style="width:119px;">204056</td>
			<td>qPCR for bacterial copy number measurment</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">QuantiFast SYBR Green RT-PCR Kit&#160;</td>
			<td style="width:200px;">Qiagen</td>
			<td>204156</td>
			<td>qRT-PCR for gene expression measurements</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">QuantiTect Reverse Transcription Kit&#160;</td>
			<td style="width:200px;">Qiagen</td>
			<td style="width:119px;">205311</td>
			<td>cDNA synthesis</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Qubit Assay Tubes</td>
			<td style="width:200px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">Q32856</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Qubit dsHS DNA kit&#160;</td>
			<td style="width:200px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">Q32851</td>
			<td>Quantification of plasmid and cDNA samples</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Qubit fluorometer</td>
			<td style="width:200px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">Q33226</td>
			<td>Quantification of plasmid and cDNA samples</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">RNase-ExitusPlus</td>
			<td style="width:200px;">AppliChem</td>
			<td style="width:119px;">A7153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Rnasin Ribonuclease Inhibitor</td>
			<td style="width:200px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;">N2511</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Skimmed milk powder</td>
			<td>Sucofin</td>
			<td style="width:119px;">&#160;-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">SYBR safe DNA Gel Stain</td>
			<td style="width:200px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">S33102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TRI reagent&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">T9424</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Weighing boat</td>
			<td>VWR</td>
			<td style="width:119px;">10803-148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Wheat meal</td>
			<td style="width:200px;">Osterm&#252;hle Naturkost GmbH</td>
			<td style="width:119px;">6462</td>
			<td>Organic cultivation</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a galleria mellonella oral administration model to study commensal-induced innate immune responses

Het onderzoek van het immunogene potentieel van commensale bacteriën op het immuunsysteem van de gastheer is een essentieel onderdeel bij de studie van intestinale host-microbe interacties. Het is reeds lang gevestigd dat verschillende commensals een verschillende potentieel vertonen ter stimulering van de intestinale immuunsysteem van de gastheer. Dergelijke onderzoeken betrekking hebben op gewervelde dieren, vooral knaagdieren. Aangezien steeds meer ethische bezwaren zijn gekoppeld aan experimenten met gewervelde dieren, is er een grote vraag naar ongewervelde vervangingen modellen.
Wij bieden hier een wasmot orale toediening model met behulp van commensale niet-pathogene bacteriën en de mogelijke evaluatie van de immunogene potentieel van commensals op het immuunsysteem G. mellonella . We laten zien dat G. mellonella is een nuttig alternatief-ongewervelde vervanging model waarmee de analyse van commensals met verschillende immunogene potentieel zoals Bacteroides vulgatus en Escherichia coli. Interessant, tentoongesteld de bacteriën geen effect van de moord op de larven, die lijkt op zoogdieren. De immuunrespons van G. mellonella waren vergelijkbaar met gewervelde aangeboren immuunresponsen en erkenning van de bacteriën en de productie van antimicrobiële moleculen te betrekken. Wij stellen voor dat G. mellonella kon vorige microbiota evenwicht, dat bekend van gezonde zoogdieren individuen is te herstellen. Hoewel het verstrekken van vergelijkbare aangeboren immuunresponsen bij zowel G. mellonella en gewervelde dieren, doet G. mellonella niet haven een adaptieve immuunsysteem. Aangezien de onderzochte componenten van het aangeboren immuunsysteem evolutionaire bewaard zijn, het model laat toe een prescreening en eerste analyse van bacteriële immunogene eigenschappen.

De G. mellonella Hemolymfe infectie model in op grote schaal gebruikt voor het analyseren van de virulentiefactoren van een groot aantal ziekteverwekkers. De meeste metingen omvatten de analyse van larven sterfte, dat een vrij gemakkelijke methode is. Echter deze methode niet tot conclusies over immuunresponsen in het algemeen en de resultaten van G. mellonella immuunresponsen koppelen met gewervelde immuun mechanismen. Het model G. mellonella orale toediening w...

Watch this Scientific Journal Video about A Galleria mellonella Oral Administration Model to Study Commensal-Induced Innate Immune Responses at JoVE.com

A Galleria mellonella Oral Administration Model to Study Commensal-Induced Innate Immune Responses

Hier bieden wij een gedetailleerd protocol voor een model van de orale toediening met behulp van de larven van de wasmot en hoe te karakteriseren geïnduceerde aangeboren immuunresponsen. Met behulp van dit protocol, zal onderzoekers zonder praktische ervaring kunnen gebruiken de G. mellonella dwangvoeding methode.

Een mondelinge beheermodel voor wasmot te Study Commensal-Induced aangeboren immuunresponsen

The investigation of the immunogenic potential of commensal bacteria on the host immune system is one essential component when studying intestinal ...

Ons protocol breidt het gebruik van G.mellonella uit van een systemisch infectiemodel naar een model dat bacteriële toediening via de natuurlijke orale route mogelijk maakt. G.mellonella is een geschikt vervangingsmodel voor knaagdieren bij het analyseren van verschillende kenmerken van aangeboren micro-post interacties als de larven kunnen worden gebruikt voor menselijke pathogene bacteriën. Begin met het overbrengen van de eieren gelegd door volwassen motten naar twee liter dozen met wasmot substraat, op 30 graden Celsius, in het donker.Breng na één tot twee weken 25 gram larve met substraat over in vers substraat, wanneer kleine en kleine larven zichtbaar worden. Synchroniseer de larven na twee weken op basis van hun grootte, in groepen van 30 tot 40 larven in nieuwe twee liter containers op wasmotsubstraat. Selecteer na twee weken larven voor het experiment per gewicht.Met behulp van alleen bleke, snel bewegende larven met een massa van 180 tot 200 milligram. Om de larven te voeden, laad je een insulinespuit met een botte naald voor orale toepassing, met één keer 10 tot de zevende bacterie per 10 microliter DPBS per larve. Laad de spuit in een microsyringepomp.Wacht tot een larve zijn monddelen opent voordat u de spuit voorzichtig tussen de kaken plaatst en de bacteriën aflevert. Wanneer alle larven zijn gevoed, broeden de dieren in het donker op 37 graden Celsius, tussen een tot 24 uur. Voor de verwerking van larven moet u een veiligheidskap met ethanol en spuitreagens reinigen om RNase-verontreiniging te voorkomen.Snap bevriest de levende larve in vloeibare stikstof. Homogenize elk individueel bevroren larve met behulp van een mortier en stamper en een klein volume vloeibare stikstof. Wanneer een gepoederd homogenaat is geproduceerd, breng het homogenaat over naar een wegwerpwachtboot en wacht tot de vloeibare stikstof verdampt.Wanneer alle larve zijn gehomogeniseerd, meng de gepoederde homogenaten met een milliliter TRIzol in een twee milliliter buis. Broed het mengsel een uur op kamertemperatuur. Aan het einde van de incubatie, pellet het homogenaat door centrifugatie.Breng de supernatant in een nieuwe buis. Meng de supernatant met 200 microliter 1-Bromo-3-chloropropaan, of BCP. Vortex en incubeer gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur, gevolgd door een 10 minuten incubatie op ijs.Aan het einde van de tweede incubatie, centrifugeren de BCP toegevoegde reactie en breng de bovenste transparante laag in een nieuwe, twee milliliter buis. Precipitate het RNA van de overgebrachte bovenste laag met 500 microliter isopropanol door het mengen en omkeren van de buis gedurende vijf minuten. Verzamel vervolgens het neerslagRNA door centrifugatie.Was de neergeslagen RNA-pellet met 500 microliter van 75% ethanol en droog het RNA gedurende vijf tot tien minuten bij kamertemperatuur. Wanneer de ethanol is verdampt, voeg 100 microliters ribonuclease remmer in nuclease-vrij water aan de gedroogde RNA pellet, en zorgvuldig vortex de buis totdat de pellet volledig is opgelost. Meet de RNA-kwaliteit en -kwantiteit volgens standaardprotocollen, waarbij ervoor wordt gezorgd dat de verhouding 260 tot 280 ongeveer twee is en de verhouding 260 tot 230 tussen twee en 2,2.Gebruik vervolgens vijf microgram van het geïsoleerde RNA voor DNase-vertering en genexpressieanalyse, volgens standaardprotocollen. G.mellonella is in staat om de initiële kracht gevoed bacteriële belasting duidelijk totdat er geen bacteriën detecteerbaar zijn. Met de 16s genexemplaar aantallen van zowel B.vulgatus als E.coli daalden wezenlijk binnen 24 uren.Commensal toegediend een G.mellonella larven induceren RNA genexpressie van verschillende aangeboren immuniteit marker genen. De LPS-herkenningsmoleculen, apolipophorine en hemolin worden bijvoorbeeld over het algemeen meer uitgedrukt in de door E.coli toegediende larven in vergelijking met B.vulgatus toegediende larven. Verder wordt de productie van reactieve zuurstof- en stikstofsoorten sterk opgevoerd bij E.coli-krachtvoeding in vergelijking met B.vulgatus, evenals antioxidatieve GST-genexpressie.Bovendien wordt differentiële microbiële peptideexpressie sterker geïnduceerd na e.coli toediening dan in reactie op B.vulgatus krachtvoeding. Vergeet niet om alleen gezonde, witte, snel bewegende larven te gebruiken, om geduld te gebruiken tijdens krachtvoeding om te voorkomen dat de larven worden belast en om alle noodzakelijke controles op te nemen. De activering van G.mellonella immuunmarkeringen kan direct worden bepaald door RUS of GST activiteitstesten en de overvloed aan ANPs kan worden bepaald door bacteriële groeiremmingstesten.Deze techniek kan worden gebruikt als een screening tool voor commensal en pathogene bacteriën en voor het verkennen van darmsympbiomen en pathobiomes zonder offer van vele gewervelde dieren. Gebruik altijd de juiste persoonlijke beschermingsmiddelen bij het werken met vloeibare stikstof-, BCP- of TRIzol-stoffen.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

A Galleria mellonella Oral Administration Model to Study Commensal-Induced Innate Immune Responses

The Insect Galleria mellonella as a Powerful Infection Model to Investigate Bacterial Pathogenesis

The Insect Galleria mellonella as a Powerful Infection Model to Investigate Bacterial Pathogenesis

Het Insect<em&gt; Galleria mellonella</em&gt; Als een krachtige Infectie model te Bacteriële Pathogenese Onderzoek

The study of bacterial virulence often requires a suitable animal model. Mammalian models of infection are costly and may raise ethical issues. The use of ...

An In vitro Model to Study Immune Responses of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells to Human Respiratory Syncytial Virus Infection

An In vitro Model to Study Immune Responses of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells to Human Respiratory Syncytial Virus Infection

Human respiratory syncytial  virus (HRSV) infections present a broad spectrum of disease severity, ranging  from mild infections to life-threatening ...

Use of Galleria mellonella as a Model Organism to Study Legionella pneumophila Infection

Use of Galleria mellonella as a Model Organism to Study Legionella pneumophila Infection

Gebruik<em&gt; Galleria mellonella</em&gt; Als modelorganisme om te studeren<em&gt; Legionella pneumophila</em&gt; Infectie

Legionella pneumophila, the causative agent of a severe pneumonia named Legionnaires&#39; disease, is an important human pathogen that infects and ...

Dissecting Innate Immune Signaling in Viral Evasion of Cytokine Production

Ontleden Innate Immune Signalering in Viral Evasion van cytokine productie

In response to a viral infection, the host innate immune response is activated to up-regulate gene expression and production of antiviral cytokines. ...

Using RNA-interference to Investigate the Innate Immune Response in Mouse Macrophages

Met behulp van RNA-interferentie te onderzoeken de aangeboren immuunrespons in muizenmacrofagen

Macrophages are key phagocytic innate immune cells.  When macrophages encounter a pathogen, they produce antimicrobial proteins and compounds to kill the ...

Non-invasive Imaging of the Innate Immune Response in a Zebrafish Larval Model of Streptococcus iniae Infection

Non-invasive Imaging of the Innate Immune Response in a Zebrafish Larval Model of Streptococcus iniae Infection

Niet-invasieve beeldvorming van de aangeboren immuunrespons in een zebravis larven Model van<em&gt; Streptococcus iniae</em&gt; Infectie

The aquatic pathogen, Streptococcus iniae, is responsible for over 100 million dollars in annual losses for the aquaculture industry and is capable of ...

Increased Recovery Time and Decreased LPS Administration to Study the Vagus Nerve Stimulation Mechanisms in Limited Inflammatory Responses

Verhoogde Recovery Time en verminderde LPS Administration aan de Nervus Vagus Stimulatie Mechanismen in Limited ontstekingsreacties Studie

Inflammation is a local response to infection and tissue damage mediated by activated macrophages, monocytes, and other immune cells that release ...

The Galleria mellonella Waxworm Infection Model for Disseminated Candidiasis

The Galleria mellonella Waxworm Infection Model for Disseminated Candidiasis

De wasmot Waxworm infectie Model voor verspreid Candidiasis

Candida species are common fungal commensals of humans colonizing the skin, mucosal surfaces, and gastrointestinal tract. Under certain conditions, ...

A Mouse Model to Assess Innate Immune Response to Staphylococcus aureus Infection

A Mouse Model to Assess Innate Immune Response to Staphylococcus aureus Infection

Een muismodel te beoordelen ingeboren immuunreactie op Staphylococcus aureus -infectie

Staphylococcus aureus (S. aureus)&#160;infections, including methicillin resistant stains, are an enormous burden on the healthcare system. With incidence ...

Use of the Invertebrate Galleria mellonella as an Infection Model to Study the Mycobacterium tuberculosis Complex

Use of the Invertebrate Galleria mellonella as an Infection Model to Study the Mycobacterium tuberculosis Complex

Gebruik van de ongewervelde Galleria wasmot als een infectie model voor de studie van de Mycobacterium tuberculose complex

Tuberculosis is the leading global cause of infectious disease mortality and roughly a quarter of the world&#8217;s population is believed to be infected ...