Name: a galleria mellonella oral administration model to study commensal-induced innate immune responses
Uploaded: 2019-03-21T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Galleria mellonella Oral Administration Model to Study Commensal-Induced Innate Immune Responses at JoVE.com

Dette arbeidet ble finansiert av DFG (SPP1656), DFG trening forskningsgruppen 1708, Bundesministerium für Bildung und Forschung (BMBF) og tysk sentrum for infeksjon forskning (DZIF).

1. G. mellonella oppdrett og utarbeidelse av Larvene for eksperimenter
Merk: Syklus fra egg til siste skikkelsen Larven tar ca 5-6 uker.
<ol><li>Overføre eggene lagt av voksen møll 2 L-boksene som inneholder voks møll substrat (22% korn grits, 22% hvete måltid, 17,5% bivoks, 11% skummet melkepulver, 11% honning, 11% glyserol, 5,5% tørket gjær). Utføre hele den oppdrettende på 30 ° C i mørket.</li>
	<li>Overføre 25 g substrat som inneholder Larvene i frisk substrat etter c...

<ol>
	<li>Nell, S., Suerbaum, S., Josenhans, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+impact+of+the+microbiota+on+the+pathogenesis+of+IBD:+lessons+from+mouse+infection+models.">The impact of the microbiota on the pathogenesis of IBD: lessons from mouse infection models.</a> Nature Reviews Microbiology. 8 (8), 564-577 (2010).</li><li>Muniz, L. R., Knosp, C., Yeretssian, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+antimicrobial+peptides+during+homeostasis,+infection,+and+disease.">Intestinal antimicrobial peptides during homeostasis, infection, and disease.</a> Frontiers in Immunology. 3, 310 (2012).</li><li>Ivanov, I. I., Honda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+commensal+microbes+as+immune+modulators.">Intestinal commensal microbes as immune modulators.</a> Cell Host Microbe. 12 (4), 496-508 (2012).</li><li>Ayres, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammasome-microbiota+interplay+in+host+physiologies.">Inflammasome-microbiota interplay in host physiologies.</a> Cell Host Microbe. 14 (5), 491-497 (2013).</li><li>Champion, O. L., Titball, R. W., Bates, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standardization+of+G.+mellonella+Larvae+to+Provide+Reliable+and+Reproducible+Results+in+the+Study+of+Fungal+Pathogens.">Standardization of G. mellonella Larvae to Provide Reliable and Reproducible Results in the Study of Fungal Pathogens.</a> Journal of Fungi (Basel). 4 (3), (2018).</li><li>Wojda, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunity+of+the+greater+wax+moth+Galleria+mellonella.">Immunity of the greater wax moth Galleria mellonella.</a> Insect Science. , (2016).</li><li>Buchmann, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+Innate+Immunity:+Clues+from+Invertebrates+via+Fish+to+Mammals.">Evolution of Innate Immunity: Clues from Invertebrates via Fish to Mammals.</a> Frontiers in Immunology. 5, 459 (2014).</li><li>Lange, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Galleria+mellonella:+A+Novel+Invertebrate+Model+to+Distinguish+Intestinal+Symbionts+From+Pathobionts.">Galleria mellonella: A Novel Invertebrate Model to Distinguish Intestinal Symbionts From Pathobionts.</a> Frontiers in Immunology. 9 (2114), (2018).</li><li>Tsai, C. J., Loh, J. M., Proft, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Galleria+mellonella+infection+models+for+the+study+of+bacterial+diseases+and+for+antimicrobial+drug+testing.">Galleria mellonella infection models for the study of bacterial diseases and for antimicrobial drug testing.</a> Virulence. , 1-16 (2016).</li><li>Bolouri Moghaddam, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+potential+of+the+Galleria+mellonella+innate+immune+system+is+maximized+by+the+co-presentation+of+diverse+antimicrobial+peptides.">The potential of the Galleria mellonella innate immune system is maximized by the co-presentation of diverse antimicrobial peptides.</a> Biological Chemistry. 397 (9), 939-945 (2016).</li><li>Casanova-Torres, A. M., Goodrich-Blair, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+Signaling+and+Antimicrobial+Peptide+Expression+in+Lepidoptera.">Immune Signaling and Antimicrobial Peptide Expression in Lepidoptera.</a> Insects. 4 (3), 320-338 (2013).</li><li>Mukherjee, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Galleria+mellonella+as+a+model+system+for+studying+Listeria+pathogenesis.">Galleria mellonella as a model system for studying Listeria pathogenesis.</a> Applied and Environmental Microbiology. 76 (1), 310-317 (2010).</li><li>Brennan, M., Thomas, D. Y., Whiteway, M., Kavanagh, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlation+between+virulence+of+Candida+albicans+mutants+in+mice+and+Galleria+mellonella+larvae.">Correlation between virulence of Candida albicans mutants in mice and Galleria mellonella larvae.</a> FEMS Immunological and Medical Microbiology. 34 (2), 153-157 (2002).</li><li>Miyata, S., Casey, M., Frank, D. W., Ausubel, F. M., Drenkard, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+the+Galleria+mellonella+caterpillar+as+a+model+host+to+study+the+role+of+the+type+III+secretion+system+in+Pseudomonas+aeruginosa+pathogenesis.">Use of the Galleria mellonella caterpillar as a model host to study the role of the type III secretion system in Pseudomonas aeruginosa pathogenesis.</a> Infection and Immunity. 71 (5), 2404-2413 (2003).</li><li>Waidmann, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacteroides+vulgatus+protects+against+Escherichia+coli-induced+colitis+in+gnotobiotic+interleukin-2-deficient+mice.">Bacteroides vulgatus protects against Escherichia coli-induced colitis in gnotobiotic interleukin-2-deficient mice.</a> Gastroenterology. 125 (1), 162-177 (2003).</li><li>Lange, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extensive+Mobilome-Driven+Genome+Diversification+in+Mouse+Gut-Associated+Bacteroides+vulgatus+mpk.">Extensive Mobilome-Driven Genome Diversification in Mouse Gut-Associated Bacteroides vulgatus mpk.</a> Genome Biology and Evolution. 8 (4), 1197-1207 (2016).</li><li>Hermann-Bank, M. L., Skovgaard, K., Stockmarr, A., Larsen, N., Molbak, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Gut+Microbiotassay:+a+high-throughput+qPCR+approach+combinable+with+next+generation+sequencing+to+study+gut+microbial+diversity.">The Gut Microbiotassay: a high-throughput qPCR approach combinable with next generation sequencing to study gut microbial diversity.</a> BMC Genomics. 14, 788 (2013).</li><li>Sato, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=OmpA+variants+affecting+the+adherence+of+ulcerative+colitis-derived+Bacteroides+vulgatus.">OmpA variants affecting the adherence of ulcerative colitis-derived Bacteroides vulgatus.</a> Journal of Medical and Dental Science. 57 (1), 55-64 (2010).</li><li>Freitak, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+maternal+transfer+of+bacteria+can+mediate+trans-generational+immune+priming+in+insects.">The maternal transfer of bacteria can mediate trans-generational immune priming in insects.</a> Virulence. 5 (4), 547-554 (2014).</li><li>Pfaffl, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+mathematical+model+for+relative+quantification+in+real-time+RT-PCR.">A new mathematical model for relative quantification in real-time RT-PCR.</a> Nucleic Acids Research. 29 (9), 45 (2001).</li><li>Ramarao, N., Nielsen-Leroux, C., Lereclus, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+insect+Galleria+mellonella+as+a+powerful+infection+model+to+investigate+bacterial+pathogenesis.">The insect Galleria mellonella as a powerful infection model to investigate bacterial pathogenesis.</a> Journal of Visualized Experiments. (70), e4392 (2012).</li><li>Ramarao, N., Nielsen-Leroux, C., Lereclus, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+insect+Galleria+mellonella+as+a+powerful+infection+model+to+investigate+bacterial+pathogenesis.">The insect Galleria mellonella as a powerful infection model to investigate bacterial pathogenesis.</a> Journal of Visualized Experiments. (70), e4392 (2012).</li></ol>

G. mellonella modellen er en brukte modell å vurdere bakteriell virulens faktorer i en systemisk infeksjon tilnærming21. Siden mange patogener og bakterier inn verten via muntlig kolonisering eller infeksjon rute, må ny innsikt finne evaluere G. mellonella som en modell for muntlig kolonisering og infeksjon.
Baksiden G. mellonella mellom 15-37 ° C er en stor fordel siden de fleste pattedyr modeller vedlikeholde kroppen temperaturer på 37 ...

Den intestinal microbiome er en viktig komponent for vedlikehold av homeostase, og involverer både medfødte og adaptive immunreaksjoner1,2. Commensal bakterieflora fellesskapet er preget av ulike viktigste commensal bestanddeler: symbionter som gir gunstige effekter av viktige immunmodulerende funksjoner og pathobionts som kan ha skadelige effekter i genetisk predisposed vert og fremme og utløse intestinale betennelsen3,4. Mange studier på symbionter og pathobionts og deres innflytelse på verten immunsystemet er publisert hovedsakelig studere adaptive immunreaksjoner.
Siden disse studiene involverer mange dyr for undersøkelser og beskyttelse og utskifting av dyr som brukes til eksperimentering er økende offentlig interesse, søker vi å finne en erstatning modell å tillate en screening av ulike bakteriell immunogenic egenskaper. Insekter, spesielt Galleria mellonella, er en mye brukt erstatning modell i infeksjon forskning. G. mellonella kombinerer forskjellige fordeler som lave kostnader og høy gjennomstrømning; det tillater peroral administrering av bakterier, som er naturlig eksponering ruten, og det tillater systemisk infeksjon5,6. G. mellonella videre kan inkubasjonstiden ved 37 ° C, som er fysiologisk kroppstemperaturen av pattedyr og optimal for bakteriell virulens faktor uttrykk5. Den største fordelen med G. mellonella er det bevarte medfødte immunsystemet som muliggjør diskriminering av selvtillit fra ikke-selv og koder en rekke mønster anerkjennelse reseptorer som apolipophorin eller opsonin hemolin6, 7. på mikrobe anerkjennelse, G. mellonella kan utløse ulike nedstrøms humoral immunreaksjoner. Indusere oksidativt stress svar kan og skiller reaktive oksygen arter (ROS) som innebærer NOS (nitrat oksidase syntase) og NOX (NADPH oksidase)6,8. I tillegg G. mellonella aktiverer en potent antimikrobielle peptid (AMP) respons, som resulterer i utskillelsen av en blanding av forskjellige forsterkere som gloverin, moricin, cecropin eller defensin-lignende gallerimycin6, 8,9,10. Vanligvis forsterkere har ganske bred vert spesifisitet mot Gram-positive og Gram-negative bakterier og sopp og gi et potent svar siden insekter mangler noen adaptive responsen10. Gloverin er en forsterker aktiv mot bakterier og sopp og hemmer ytre membran formasjon6,11. Moricins viser sine antimikrobielle funksjon mot Gram-positive og Gram-negative bakterier av gjennomtrengende membranen og danner en pore9,11. Cecropins gir aktivitet mot bakterier og sopp og permeabilize membranen på samme måte som moricins9,10. Gallerimycin er et defensin som peptid med Antifungal egenskaper9. Interessant, ble det funnet at kombinasjonen av cecropin og gallerimycin hadde en samvirkningen mot E. coli10.
På grunn av deres lett-å-bruke karakter G. mellonella er Larvene en ofte brukt infeksjon modell å vurdere bakteriell virusets. Spesielt korrelerer studier i hvilke data fra G. mellonella med data fra mus støtte styrken på denne alternative vert modellen. Det ble funnet at de mest patogene serotypene av Listeria monocytogenes i en mus infeksjon modell også føre til høyere dødelighet i G. mellonella etter systemisk infeksjon. Videre mindre virulente serotyper viste seg for å være også mindre virulente i G. mellonella model12. Lignende observasjoner er gjort med den menneskelige patogene sopp Candida albicans. Virulens av ulike C. albicans stammer er vurdert av systemisk smitte og påfølgende overvåking av larver overlevelse. Mus avirulent stammer var også avirulent eller utstilt redusert virulens i G. mellonella, mens musen virulente stammene fører også til høy larver dødelighet13. G. mellonella modellen kan videre brukes til å identifisere typen 3 sekresjon systemet virusets faktorer Pseudomonas aeruginosa14.
Siden de fleste undersøkelser som involverer G. mellonella var fokusert på virulens faktorer ved hjelp av systemisk infeksjon tilnærming var vi spesielt interessert i å tilby en metode egnet for analyse av intestinal commensals i en muntlig kraft-mating modell som vi kan bruke en distinkt dosering av bakterier per larver og ikke bare observere larver dødelighet, men du kan analysere ulike kjennetegner medfødte immunreaksjoner å opprettholde intestinal homeostase.
Vår metode bidrar til å øke bruken av G. mellonella som erstatning modell siden vi kombinerer anvendelse av bakterier og analyse av RNA uttrykk. Det er ikke bare nyttig å styrke betydningen av bakteriell patogenesen studier inkludert analyse av immunreaksjoner etter peroral administrering og ikke bare observasjon av dødelighet etter systemisk infeksjon. Våre metoder kan for analyse av immunogenic egenskaper av bakteriell ikke-patogene commensals siden det gir mer komplisert forhold enn cellekultur ved å tilby en intestinal barriere i en levende organisme.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:701px;" width="702">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">1.5 mL tubes</td>
			<td style="width:200px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:119px;">0030120086</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">100 bp DNA ladder&#160;</td>
			<td style="width:200px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">15628019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1-Bromo-3-Chloropropane (BCP)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">B9673</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">2 mL tubes</td>
			<td style="width:200px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:119px;">0030120094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">2x Mangomix</td>
			<td style="width:200px;">Bioline</td>
			<td style="width:119px;">BIO-25033</td>
			<td>Colony PCR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">50 mL tubes</td>
			<td style="width:200px;">Greiner Bio-One</td>
			<td style="width:119px;">210 261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Agarose</td>
			<td style="width:200px;">Biozym</td>
			<td style="width:119px;">840004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Beeswax</td>
			<td style="width:200px;">Mixed-Store.de</td>
			<td style="width:119px;">&#160;-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Brain heart infusion broth</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">CM1135</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CloneJET PCR Cloning Kit</td>
			<td style="width:200px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">K1232</td>
			<td>Cloning vector for 16S fragments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Corn grits</td>
			<td style="width:200px;">Osterm&#252;hle Naturkost GmbH</td>
			<td style="width:119px;">306</td>
			<td>Organic cultivation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Difco LB Agar, Miller (Luria-Bertani)</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td style="width:119px;">BD</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Difoco LB Broth, Miller (Luria-Bertani)</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td style="width:119px;">244610</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DNA-free DNA Removal Kit&#160;</td>
			<td style="width:200px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">244510</td>
			<td>&#160;Dnase digestion</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dried yeast</td>
			<td style="width:200px;">Rapunzel</td>
			<td style="width:119px;">&#160;-</td>
			<td>Organic cultivation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dulbecco&#39;s Phosphate-Buffered Saline (DPBS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">14040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Ethanol</td>
			<td style="width:200px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">20821.330</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">W252506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Honey</td>
			<td style="width:200px;">Osterm&#252;hle Naturkost GmbH</td>
			<td style="width:119px;">487</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Isopropanol&#160;</td>
			<td style="width:200px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">20842.330</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Lightcycler 480 Instrument II</td>
			<td style="width:200px;">Roche Molecular Systems</td>
			<td style="width:119px;">5015278001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">LightCycler 480 Multiwell Plate 96, white</td>
			<td style="width:200px;">Roche Molecular Systems</td>
			<td style="width:119px;">4729692001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Manual Microsyringe Pump with Digital Display</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td style="width:119px;">DMP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Micro-Fine+ U-100 insulin syringe 0.3 x 8 mm</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td style="width:119px;">324826</td>
			<td>Oral administration</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Mortar, unglazed</td>
			<td style="width:200px;">VWR</td>
			<td>410-9327&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nanodrop</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">13-400-518</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nuclease-free water&#160;</td>
			<td style="width:200px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">10977035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Oxoid AnaeroGen sachets&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">AN0025A</td>
			<td>Quality and quantity of RNA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">PCR stripes</td>
			<td style="width:200px;">Biozym</td>
			<td style="width:119px;">710970</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Pestle, unglazed grinding surface</td>
			<td style="width:200px;">VWR</td>
			<td>410-9324&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phusion proof-reading enzyme&#160;</td>
			<td style="width:200px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">F553S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Primers</td>
			<td style="width:200px;">Biomers</td>
			<td style="width:119px;">&#160;-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">PureYield Plasmid Miniprep System</td>
			<td style="width:200px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;">A1222</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">QuantiFast SYBR Green PCR kit&#160;</td>
			<td style="width:200px;">Qiagen</td>
			<td style="width:119px;">204056</td>
			<td>qPCR for bacterial copy number measurment</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">QuantiFast SYBR Green RT-PCR Kit&#160;</td>
			<td style="width:200px;">Qiagen</td>
			<td>204156</td>
			<td>qRT-PCR for gene expression measurements</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">QuantiTect Reverse Transcription Kit&#160;</td>
			<td style="width:200px;">Qiagen</td>
			<td style="width:119px;">205311</td>
			<td>cDNA synthesis</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Qubit Assay Tubes</td>
			<td style="width:200px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">Q32856</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Qubit dsHS DNA kit&#160;</td>
			<td style="width:200px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">Q32851</td>
			<td>Quantification of plasmid and cDNA samples</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Qubit fluorometer</td>
			<td style="width:200px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">Q33226</td>
			<td>Quantification of plasmid and cDNA samples</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">RNase-ExitusPlus</td>
			<td style="width:200px;">AppliChem</td>
			<td style="width:119px;">A7153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Rnasin Ribonuclease Inhibitor</td>
			<td style="width:200px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;">N2511</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Skimmed milk powder</td>
			<td>Sucofin</td>
			<td style="width:119px;">&#160;-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">SYBR safe DNA Gel Stain</td>
			<td style="width:200px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">S33102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TRI reagent&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">T9424</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Weighing boat</td>
			<td>VWR</td>
			<td style="width:119px;">10803-148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Wheat meal</td>
			<td style="width:200px;">Osterm&#252;hle Naturkost GmbH</td>
			<td style="width:119px;">6462</td>
			<td>Organic cultivation</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a galleria mellonella oral administration model to study commensal-induced innate immune responses

Etterforskningen av immunogenic potensialet av commensal bakterier på verten immunsystem er en viktig komponent når studere intestinal vert-mikrobe interaksjoner. Det er godt etablert at ulike commensals ha en annen potensial til å stimulere vert intestinal immunforsvaret. Dette involverer vertebrate dyr, særlig gnagere. Siden økende Etiske bekymringene er knyttet til forsøk med virveldyr, er det en høy etterspørsel etter virvelløse erstatninger modeller.
Her gir vi en Galleria mellonella peroral administrering modell med commensal ikke-patogene bakterier og mulig vurdering av immunogenic potensialet i commensals på G. mellonella immunsystemet. Vi viser at G. mellonella er et nyttig alternativ virvelløse erstatning modell for analyse av commensals med forskjellige immunogenic potensial som Bacteroides vulgatus og Escherichia coli. Interessant, utstilt bakterier ingen drap virkning på larvene, som er lik for pattedyr. Immunreaksjoner av G. mellonella var sammenlignbart med virveldyr medfødte immunreaksjoner og anerkjennelse av bakterier og produksjon av antimikrobielle molekyler. Vi foreslår at G. mellonella kunne gjenopprette forrige bakterieflora saldo, som er kjent fra friske pattedyr individer. Selv om å gi sammenlignbare medfødte immunreaksjoner både G. mellonella og virveldyr, G. mellonella ikke havn en adaptive immunsystemet. Siden de undersøkte komponentene av det medfødte immunsystemet er evolusjonære bevart, tillater modellen en kvalifisering prescreening og første analyse av bakteriell immunogenic egenskaper.

G. mellonella hemolymph infeksjon modellen i mye brukt til å analysere virulens faktorer i et stort utvalg av patogener. De fleste målinger inkluderer analyse av Larvene dødelighet, som er en ganske enkel metode. Likevel, denne metoden ikke tillate konklusjoner om immunreaksjoner generelt og koble resultatene av G. mellonella immunreaksjoner med virveldyr immun mekanismer. G. mellonella peroral administrering modellen brukes derimot bare sjelden til muntlig i...

Watch this Scientific Journal Video about A Galleria mellonella Oral Administration Model to Study Commensal-Induced Innate Immune Responses at JoVE.com

A Galleria mellonella Oral Administration Model to Study Commensal-Induced Innate Immune Responses

Her gir vi en detaljert protokoll for en muntlig administrasjonsmodell bruker Galleria mellonella larver og hvordan å karakterisere indusert medfødte immunreaksjoner. Bruker denne protokollen, vil forskere uten praktisk erfaring kunne bruke G. mellonella kraft-mating metoden.

Galleria mellonella muntlig administrasjonsmodell til Study Commensal-Induced medfødte immunreaksjoner

The investigation of the immunogenic potential of commensal bacteria on the host immune system is one essential component when studying intestinal ...

Vår protokoll utvider bruken av G.mellonella fra en systemisk infeksjonsmodell til en modell som tillater bakteriell administrasjon via den naturlige orale ruten. G.mellonella er en egnet erstatningsmodell for gnagere i å analysere forskjellige kjennetegn på medfødte mikropostinteraksjoner, da larver kan brukes til menneskelige patogene bakterier. Begynn med å overføre eggene lagt av voksne møll til to liters bokser som inneholder voksmotsubstrat, ved 30 grader Celsius, i mørket.Etter en til to uker, overføre 25 gram larve som inneholder substrat i friskt substrat, når liten og liten larve blir synlig. Synkroniser larver etter to uker i henhold til deres størrelse, i grupper på 30 til 40 larver i nye to liters beholdere på voksmot substrat. Etter to uker velger du larver for eksperimentet etter vekt.Bruk bare bleke, raske larver med en masse på 180 til 200 milligram. For å tvinge mate larver, last en insulinsprøyte med en stump kanyle for muntlig påføring, med en ganger 10 til den syvende bakterien per 10 mikroliter DPBS per larve. Legg sprøyten i en mikrosyringpumpe.Vent til en larve åpner munndelene før du setter sprøyten forsiktig inn mellom mandiblene og leverer bakteriene. Når alle larvene har blitt matet, inkuber dyrene i mørket ved 37 grader Celsius, mellom en til 24 timer. For larvebehandling må du rengjøre en sikkerhetshette med etanol og sprayreagens for å forhindre RNase-kontaminering.Snap fryse levende larve i flytende nitrogen. Homogeniser hver enkelt frossen larve ved hjelp av en mørtel og pestle og et lite volum flytende nitrogen. Når et pulverisert homogenat er produsert, overfører du homogenatet til en engangs ventebåt og venter på at det flytende nitrogenet fordamper.Når alle larvene har blitt homogenisert, bland de pulveriserte homogenatene med en milliliter TRIzol i et to milliliter rør. Inkuber blandingen ved romtemperatur i en time. På slutten av inkubasjonen, pellet homogenatet ved sentrifugering.Overfør det overnaturlige til et nytt rør. Bland det overnaturlige med 200 mikroliter 1-Bromo-3-kloropropan, eller BCP. Vortex og inkuber i fem minutter ved romtemperatur, etterfulgt av en 10 minutters inkubasjon på is.På slutten av den andre inkubasjonen, sentrifugere BCP lagt reaksjon og overføre det øvre gjennomsiktige laget til en ny, to milliliter rør. Utfell RNA av det overførte øvre laget med 500 mikroliter isopropanol ved å blande og invertere røret i fem minutter. Deretter samler du utfelling RNA ved sentrifugering.Vask den utfelte RNA pellet med 500 mikroliter på 75% etanol og tørk RNA i fem til 10 minutter ved romtemperatur. Når etanol har fordampet, tilsett 100 mikroliter ribonukleærhemmer i kjernefritt vann til den tørkede RNA pellet, og forsiktig virvle røret til pelleten er helt oppløst. Mål RNA-kvaliteten og kvantiteten etter standardprotokoller, slik at forholdet mellom 260 og 280 er omtrent to, og forholdet mellom 260 og 230 er i området to til 2,2.Bruk deretter fem mikrogram av den isolerte RNA for DNase fordøyelse og genuttrykksanalyse, i henhold til standardprotokoller. G.mellonella er i stand til å fjerne den første kraften matet bakteriell belastning til ingen bakterier er påviselig. Med 16-tallet reduserte genkopinumrene til både B.vulgatus og E.coli betydelig innen 24 timer.Commensal administrerte en G.mellonella larver indusere RNA genuttrykk av ulike medfødte immunitet markør gener. For eksempel uttrykkes LPS-gjenkjenningsmolekylene, apolipophorin og hemolin generelt mer høyt i E.coli administrerte larver sammenlignet med B.vulgatus administrert larver. Videre er produksjonen av reaktive oksygen- og nitrogenarter sterkt oppregulert på E.coli-kraftfôring sammenlignet med B.vulgatus, samt antioksidativt GST-genuttrykk.I tillegg induseres differensial mikrobiell peptiduttrykk sterkere etter administrering av E.coli enn som respons på B.vulgatus kraftfôring. Husk å bruke bare sunne, hvite, raskt bevegelige larver, for å bruke tålmodighet under kraftfôring for å unngå å stresse larver og å inkludere alle nødvendige kontroller. Aktiveringen av G.mellonella immunmarkører kan bestemmes direkte av RUS eller GST aktivitetsanalyser og overflod av ANPs kan bestemmes av bakteriell vekst hemming analyser.Denne teknikken kan brukes som et screeningverktøy for kommensale og patogene bakterier og for å utforske tarmsymfbiomer og patobiomer uten offer av mange virveldyr. Bruk alltid egnet personlig verneutstyr når du arbeider med flytende nitrogen, BCP eller TRIzol stoffer.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

A Galleria mellonella Oral Administration Model to Study Commensal-Induced Innate Immune Responses

The Insect Galleria mellonella as a Powerful Infection Model to Investigate Bacterial Pathogenesis

The Insect Galleria mellonella as a Powerful Infection Model to Investigate Bacterial Pathogenesis

Insektet<em&gt; Galleria mellonella</em&gt; Som en kraftig infeksjon Model for å etterforske Bakteriell Patogenese

The study of bacterial virulence often requires a suitable animal model. Mammalian models of infection are costly and may raise ethical issues. The use of ...

An In vitro Model to Study Immune Responses of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells to Human Respiratory Syncytial Virus Infection

An In vitro Model to Study Immune Responses of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells to Human Respiratory Syncytial Virus Infection

Human respiratory syncytial  virus (HRSV) infections present a broad spectrum of disease severity, ranging  from mild infections to life-threatening ...

Use of Galleria mellonella as a Model Organism to Study Legionella pneumophila Infection

Use of Galleria mellonella as a Model Organism to Study Legionella pneumophila Infection

Ved å bruke<em&gt; Galleria mellonella</em&gt; Som modellorganisme for å studere<em&gt; Legionella pneumophila</em&gt; Infeksjon

Legionella pneumophila, the causative agent of a severe pneumonia named Legionnaires&#39; disease, is an important human pathogen that infects and ...

Dissecting Innate Immune Signaling in Viral Evasion of Cytokine Production

Dissekere medfødte immunsignalisering i Viral Evasion av cytokinproduksion

In response to a viral infection, the host innate immune response is activated to up-regulate gene expression and production of antiviral cytokines. ...

Using RNA-interference to Investigate the Innate Immune Response in Mouse Macrophages

Ved hjelp av RNA-interferens for å undersøke det medfødte immunrespons i Musemakrofager

Macrophages are key phagocytic innate immune cells.  When macrophages encounter a pathogen, they produce antimicrobial proteins and compounds to kill the ...

Non-invasive Imaging of the Innate Immune Response in a Zebrafish Larval Model of Streptococcus iniae Infection

Non-invasive Imaging of the Innate Immune Response in a Zebrafish Larval Model of Streptococcus iniae Infection

Non-invasiv Imaging av det medfødte immunrespons i en Sebrafisk Larve Modell av<em&gt; Streptococcus iniae</em&gt; Infeksjon

The aquatic pathogen, Streptococcus iniae, is responsible for over 100 million dollars in annual losses for the aquaculture industry and is capable of ...

Increased Recovery Time and Decreased LPS Administration to Study the Vagus Nerve Stimulation Mechanisms in Limited Inflammatory Responses

Økt utvinning tid og Redusert LPS Administration å studere vagus nerve stimulering Mekanismer i begrensede inflammatoriske responser

Inflammation is a local response to infection and tissue damage mediated by activated macrophages, monocytes, and other immune cells that release ...

The Galleria mellonella Waxworm Infection Model for Disseminated Candidiasis

The Galleria mellonella Waxworm Infection Model for Disseminated Candidiasis

Galleria mellonella Waxworm infeksjon modell for spres Candidiasis

Candida species are common fungal commensals of humans colonizing the skin, mucosal surfaces, and gastrointestinal tract. Under certain conditions, ...

A Mouse Model to Assess Innate Immune Response to Staphylococcus aureus Infection

A Mouse Model to Assess Innate Immune Response to Staphylococcus aureus Infection

En musemodell å vurdere medfødte immunforsvaret til Staphylococcus aureus infeksjoner

Staphylococcus aureus (S. aureus)&#160;infections, including methicillin resistant stains, are an enormous burden on the healthcare system. With incidence ...

Use of the Invertebrate Galleria mellonella as an Infection Model to Study the Mycobacterium tuberculosis Complex

Use of the Invertebrate Galleria mellonella as an Infection Model to Study the Mycobacterium tuberculosis Complex

Bruk av virvelløse Galleria mellonella som en infeksjon modell for å studere Mycobacterium tuberkulose kompleks

Tuberculosis is the leading global cause of infectious disease mortality and roughly a quarter of the world&#8217;s population is believed to be infected ...