Name: three-dimensional bone extracellular matrix model for osteosarcoma
Uploaded: 2019-04-12T14:30:00
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著者らは、骨細胞外マトリックス足場の構築時に優れた技術的な援助の彼女の行政支援と長い趙柳営陳のサポートを値します。本研究は、中国の国家自然科学基金 (31871413) からの助成金によってサポートされます。

アニマル ・ ケアおよび使用の行われています健康ガイドの国家機関によると、ケア実験の動物の使用 (NIH 文書第 80-23、1996 年に改訂) 孫逸仙大学動物倫理委員会から承認された後。
1. 骨の準備
<ol><li>6 週齢 BALB/c マウス (なしセックス固有要件) に 4 を取得します。頚部転位によって無菌マウスを安楽死させるし、新鮮な腓骨、脛骨と大腿骨、後肢を滅菌手術用はさみで?...

<ol>
	<li>Longhi, A., Errani, C., De Paolis, M., Mercuri, M., Bacci, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+bone+osteosarcoma+in+the+pediatric+age:+State+of+the+art.">Primary bone osteosarcoma in the pediatric age: State of the art.</a> Cancer Treatment Reviews. 32, 423-436 (2006).</li><li>Mohseny, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteosarcoma+originates+from+mesenchymal+stem+cells+in+consequence+of+aneuploidization+and+genomic+loss+of+Cdkn2.">Osteosarcoma originates from mesenchymal stem cells in consequence of aneuploidization and genomic loss of Cdkn2.</a> Journal of Pathology. 219, 294-305 (2009).</li><li>Mutsaers, A. J., Walkley, C. 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B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+osteosarcoma+zebrafish+model+implicates+Mmp-19+and+Ets-1+as+well+as+reduced+host+immune+response+in+angiogenesis+and+migration.">An osteosarcoma zebrafish model implicates Mmp-19 and Ets-1 as well as reduced host immune response in angiogenesis and migration.</a> Journal of Pathology. 227, 245-253 (2012).</li><li>Saalfrank, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+porcine+model+of+osteosarcoma.">A porcine model of osteosarcoma.</a> Oncogenesis. 5, 210 (2016).</li><li>Zhang, Y., Pan, Y., Xie, C., Zhang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MiR-34a+exerts+as+a+key+regulator+in+the+dedifferentiation+of+osteosarcoma+via+PAI-1&#8211;Sox2+axis.">MiR-34a exerts as a key regulator in the dedifferentiation of osteosarcoma via PAI-1&#8211;Sox2 axis.</a> Cell Death &amp; Disease. 9, (2018).</li><li>Hashimoto, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+decellularized+bone/bone+marrow+produced+by+high-hydrostatic+pressurization+on+the+osteogenic+differentiation+of+mesenchymal+stem+cells.">The effect of decellularized bone/bone marrow produced by high-hydrostatic pressurization on the osteogenic differentiation of mesenchymal stem cells.</a> Biomaterials. 32, 7060-7067 (2011).</li><li>Benders, K. E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+matrix+scaffolds+for+cartilage+and+bone+regeneration.">Extracellular matrix scaffolds for cartilage and bone regeneration.</a> Trends in Biotechnology. 31, 169-176 (2013).</li><li>Grayson, W. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+initial+seeding+density+and+fluid+perfusion+rate+on+formation+of+tissue-engineered+bone.">Effects of initial seeding density and fluid perfusion rate on formation of tissue-engineered bone.</a> Tissue Engineering Part A. 14, 1809-1820 (2008).</li><li>Mikulic, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+angiogenesis+and+outcome+in+osteosarcoma.">Tumor angiogenesis and outcome in osteosarcoma.</a> Pediatric Hematology and Oncology. 21, 611-619 (2004).</li><li>Ren, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vasculogenic+mimicry:+a+new+prognostic+sign+of+human+osteosarcoma.">Vasculogenic mimicry: a new prognostic sign of human osteosarcoma.</a> Human Pathology. 45, 2120-2129 (2014).</li><li>Bonuccelli, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+mesenchymal+stem+cells+in+osteosarcoma+and+metabolic+reprogramming+of+tumor+cells.">Role of mesenchymal stem cells in osteosarcoma and metabolic reprogramming of tumor cells.</a> Oncotarget. 5, 7575-7588 (2014).</li></ol>

一般的には、OS は、骨芽細胞分類できます、chondroblastic と ﬁbroblastic は、その支配的な組織のコンポーネントによってサブタイプします。その予後はだけではなく、また、その解剖学的部位の組織学的パラメーターに依存します。それは表面の骨と extraosseous サイト19(髄または皮質内コンパートメント) で骨の内部に起こるかもしれない。出現および OS の不均一性、発癌イ?...

骨肉腫 (OS) は、思春期成長分野、長骨の骨幹端が積極的に通常発生します。OS の影響を受けたサイトの 80% 以上には、脛骨近位端、上腕骨近位成長板1の位置に対応する、遠位、近位大腿骨の骨幹端のための好みがあります。OS には、間葉系組織学的特徴とグレードのかなりの多様性と複数の細胞サブタイプが装備されています。証拠は、起源2,3,4、5の細胞と間葉系幹細胞 (Msc)、骨芽細胞前駆体コミットとペリサイトをサポートします。これらの細胞は、遺伝やエピジェネティックな変化を蓄積し、OS を生じさせる特定の骨アイソレータケージ信号の影響の下でできます。組み込みと外因性のメカニズムは、ゲノム不安定性と複数の形態学的および臨床的表現型6,7OS の不均一性。個別療法や新薬のスクリーニングは、新しいモデルが不均一性やその他の疾患に対して生成される必要があります。
OS は、内骨の悪性固形腫瘍です。複雑さと周囲の微小環境要素の活動、腫瘍の場所が異なる OS 細胞に表現型および機能に違いを与えます。骨の細胞外マトリックス (BEM) は、鉱物の堆積と骨リモデリングの構造および生化学的足場を提供します。細胞外マトリックス (ECM) の有機性部分主に成っているタイプ私ハイドロキシアパ タイト8の形でリン酸カルシウムの石灰化部分を作曲しながら骨芽細胞系細胞から分泌されるコラーゲン。ECM ネットワークの動的な役割は細胞接着を調整することは、差別化、クロストーク、組織機能メンテナンス9。
脱灰の BEM と ECM のゲルは、細胞培養で正常に使用されているおよび細胞増殖10,11を高めることができます。合成の骨のような ECM は、プールのサイズ、運命の決定と MSCs12,13,14系統進行を調整できます。さらに、結果は、骨形成と再生15,16,17の中に刺激的な細胞プロセスによって貪食を提供する臨床的意義を証拠します。
この記事で私たちのグループは、変更されたモデルと長期培養の好ましい代わりを確立します。OS 細胞組織由来 BEM に注入はプラスチックの二次元文化に比べて容易に異質間葉系表現型を紹介します。境界要素法はその劇的な利点サイト固有の同種組織をから派生した OS のネイティブ ニッチをされている培養細胞し、OS 理論と臨床的研究では大きな可能性があります。この特徴の BEM プラットフォームはシンプルですが生体外で研究効率と他臓器重複癌のモデリングに拡張可能性があります。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1049px;" width="1049">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21">15 mL centrifuge tube</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>188271</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21">50 mL centrifuge tube</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>227270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21">6 cm cell culture dish</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>628160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21">6-well plate</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>657160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21">Ampicillin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9393</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42">C57-BL/6J mouse</td>
			<td>Sun Yat-sen University Laboratory Animal Center</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25">CO2 incubator</td>
			<td>SHEL LAB</td>
			<td>SCO5A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42">Dibasic sodium phosphate</td>
			<td>Guangzhou Chemical Reagent Factory</td>
			<td>BE14-GR-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21">DMEM/F12</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D0547</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21">Fetal bovine serum</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30084.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21">Hemocytometer</td>
			<td>BLAU</td>
			<td>717805</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21">Kanamycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>PHR1487</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42">MG-63</td>
			<td>Chinese Academy of Science, Shanghai Cell Bank</td>
			<td></td>
			<td>Human osteosarcoma cell line</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42">MNNG/HOS</td>
			<td>Chinese Academy of Science, Shanghai Cell Bank</td>
			<td></td>
			<td>Human osteosarcoma cell line</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42">Phenol red</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4633</td>
			<td>A solution of phenol red is used as a pH indicator: its color exhibits a gradual transition from yellow to red over the pH range 6.6 to 8.0.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21">Potassium chloride</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A100395</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21">Potassium Phosphate Monobasic</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A501211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21">Sodium chloride</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A501218</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

three-dimensional bone extracellular matrix model for osteosarcoma

骨肉腫 (OS) は、最も一般的な非常に積極的な原発性骨腫瘍です。診断や予後の難しさと共に解剖学的および組織学的変化が特徴です。OS には、際と表現型異種癌細胞が装備されています。骨の微小環境要素は腫瘍の多様性と疾患の進行が証明しました。骨の細胞外マトリックス (BEM) は、微細構造のマトリックスおよびネイティブの細胞外マトリックスの生化学成分を保持します。この組織固有のニッチは、OS の細胞播種の増殖有利と長期的な足場を提供します。この資料では、境界要素法モデルとそのさらに実験アプリケーションの準備のため、プロトコルを提供します。OS 細胞が成長し、OS 臨床検体の病理組織学的複雑さと一貫性のある複数の表現型に分化することができます。モデルには多様な形態と遺伝子異常や根本的な規制メカニズムとの関連付けの可視化ができます。相同性の高い人間の OS、としてこの BEM OS モデルを開発し、病理学および OS の臨床研究に適用できます。

脱灰と decellularization、BEM は強い弾力性と粘り強さのネイティブ マウスの骨に比べて半透明に表示されます。少し筋肉残渣と髄腔の空間明確に観察できる (図 1A, B)。境界要素法の効果的な decellularization を決定するには、境界要素法は固定後パラフィンに埋め込まれ、ヘマトキシリン-エオシン (H & E) 汚損のため 3-5 μ m のセクションにスライスします。明視野...

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Three-Dimensional Bone Extracellular Matrix Model for Osteosarcoma

骨肉腫 (OS) の骨細胞外マトリックス (BEM) モデルは、よく確立され、表示をここでです。原発腫瘍の成長の in vitro真似をして OS の組織学的および cytogenic の多様性を研究するための理想的なモデルを提供するため、適切な足場として使用できます。

骨肉腫に対する三次元骨細胞外マトリックス モデル

Osteosarcoma (OS) is the most common and a highly aggressive primary bone tumor. It is characterized with anatomic and histologic variations along with ...

この方法は、骨腫瘍研究のための機能的な足場を調製するための効率的な戦略を提供する。骨外細胞化マトリックスを脱細胞化し、骨肉腫細胞の生存および活動に対する可変的な血清相溶性を示した。この技術の主な利点は、骨由来マトリックス中の骨肉腫細胞培養が臨床骨肉腫組織病理学と同様に非常に異種形態を示していることである。この方法は、骨肉腫、ユーイング肉腫、および骨への転移の他の悪性腫瘍などの骨腫瘍の発達、薬物感受性の進行を調査するための理想的なモデルを提供する。まず、4〜6週齢のBALB/cマウスを得て、無菌手術用ハサミを使用してマウスを安楽死させた後、後肢から新鮮な脛骨、脛骨、大腿骨を切断する。ピンセットの助けを借りて、上皮組織を剥がし、できるだけ多くの軟部組織を取り除きます。無菌10 mM PBS溶液で脚の骨を2回洗い流し、6センチメートルの皿の中の血液を取り除きます。骨を75%エタノールで3分間皿に浸し、PBSで2回洗いすます。清潔な骨を無菌の50ミリリットル遠心管に保管し、滅菌PBSチューブを摂氏80度で保存します。凍った骨を室温で解凍し、摂氏80度で再び1時間凍結します。骨を細胞のリシスと組織の分解のための2つ以上の凍結融解サイクルに服従させる。その後、0.5正常なHClで満たされた無菌50ミリリットル遠心管に骨を入れ、骨の完全かつ均等なカバレッジを確保するために穏やかな揺れで軌道シェーカーの室温で一晩インキュベートします。脱灰後、塩酸溶液を完全に脱栓し、流水の下で骨を1時間リンスします。その後、蒸留水を使用して、軌道シェーカーで1回15分間骨を2回洗浄します。ソリューションを完全にデカンスします。脱塩した骨の脂質を抽出するには、メタノールとクロロホルムの1:1混合物で50ミリリットル遠心管に骨を入れます。クロロホルム分解防止のため、チューブをスズ箔で包み込んで光を避けます。そして、1時間軌道シェーカーにチューブを置きます。その後、ピンセットを使用して、30分間スズ箔でメタノールの別のチューブに骨を移します。メタノールを完全に取り出し、眼窩シェーカーで蒸留水を15分間2回洗います。デカント最終洗浄水と滅菌条件下で進みます。滅菌PBSで6センチメートルの皿で骨を3分間洗いすみます。無菌0.05%TE溶液40ミリリットルを50ミリリットルの遠心管に加え、37°Cの二酸化炭素インキュベーターで23時間骨をインキュベートします。TE溶液を廃棄し、90 g/mLアンピシリンと90 g/mLカナマイシンをオービタルシェーカーでそれぞれ15分間補充した滅菌PBSで2回リンスします。最終洗浄を完全にデカントした後、抗生物質で滅菌PBSの40ミリリットルで再び補充する。多孔質空間の効果的な滅菌を達成するために穏やかな揺れで室温で24時間十分に洗います。次に、抗生物質で滅菌PBSで満たされた50ミリリットル遠心分離管に骨を移す。調製された骨細胞外マトリックスは、摂氏4度で2ヶ月間保存することができる。BEMを75%エタノールに入れ、30秒間手で軽く振ります。その後、PBSで30秒間、2回リンスします。BEMを清潔な6ウェル細胞培養プレートに移します。各ウェルに完全な培養培地の2ミリリットルを追加します。37°Cの二酸化炭素インキュベーターでBEMを一晩インキュベートします。標識フェノールレッドを含む予め温めたPBSの100マイクロリットルでヒトOS細胞株を得る。ピペットを使用して、およそ10倍から5日までの濃度のOS細胞を一時停止します。BEMが培地に完全に浸漬された後、近位または遠位の骨端から、針をBEMの髄腔に穿孔し、OS細胞をBEMに注入する。37°Cの加湿された5%の二酸化炭素雰囲気で最低2時間、OS-BEMモデルをインキュベートし、注入された細胞がBEMにしっかりと付着するようにします。次に、インキュベーターからプレートを取り出します。プレートに1ミリリットルの培養培地を加え、一晩インキュベーターに保管してBEM培養物の表面を完全にコーティングします。OS-BEMモデルを滅菌用トゥイザー付きの6ウェルプレートの新しいウェルにそっと移し、1ミリリットルの新鮮な培養培地を再供給します。インキュベーターで14日間モデルを培養する。14日間のインキュベーション中は、中色をモニタリングし続けてください。メディアがオレンジ色、あるいは黄色に変わったら、古い媒体の半分を捨てて新しい媒体を追加して、すぐにメディアをリフレッシュして、OSセルの健全な環境を維持します。反転蛍光顕微鏡下で細胞の状態を監視し続けます。OS細胞がプレートに膨張したら、OS-BEMモデルを滅菌ピンセットで別の新しいウェルにそっと移します。14日間培養した後、PBSでOS-BEMモデルをそっとすすいで培養液を除去します。その後、15ミリリットル遠心分離管に移し、組織学的同定のために10%緩衝ホルマリンを加える。脱塩・脱細胞化後、BEMはネイティブマウスの骨に比べて強い弾力性と粘り強さを持つ半透明であるように見えます。髄腔の空間に少し筋残渣が明確に観察される。天然骨および脱細胞化BEMの明視野イメージングは、細胞核の徹底的な除去を示す。コラーゲンネットワーク配置における自然多孔質構造は、脱細胞化BEMにおいて十分に維持される。さらに、コラーゲンIおよびコラーゲンIVの免疫ヒストリカル染色は、細胞外マトリックスの主成分が脱細胞化後にマウス脛動物に保存されていることを示す。14日間の培養中、骨膜とエンドステウムの両方がOS細胞の増殖によって浸透する。細胞化されたBEM上のOS細胞は、OSセクションの細胞病理学的特徴と同様に、非常に異種の形態を示す。14日間のBEMモデルで培養した後の免疫学的分析は、長期培養において大きな利点を示す。また、OS細胞およびBEM培養は、骨マトリックス糖タンパク質を高度に発現し、これは、骨マトリクスに特異的である。このin vitroの3次元モデルは、表現型の異質性と骨肉腫脱分化の調節メカニズムを実証するために使用されています。

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Moving Upwards: A Simple and Flexible In Vitro Three-dimensional Invasion Assay Protocol

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上に移動: シンプルかつ柔軟なIn Vitro三次元侵略試金のプロトコル

Although 3D invasion assays have been developed, the challenge remains to study cells without affecting the integrity of their microenvironment. ...

Analyzing the Communication Between Monocytes and Primary Breast Cancer Cells in an Extracellular Matrix Extract (ECME)-based Three-dimensional System

Analyzing the Communication Between Monocytes and Primary Breast Cancer Cells in an Extracellular Matrix Extract ECME-based Three-dimensional System

単球と細胞外マトリックスの主要な乳癌細胞間コミュニケーションを分析抽出 (ECME)-ベースの三次元システム

Embedded in the extracellular matrix (ECM), normal and neoplastic epithelial cells intimately communicate with hematopoietic and non-hematopoietic cells, ...

A Preclinical Mouse Model of Osteosarcoma to Define the Extracellular Vesicle-mediated Communication Between Tumor and Mesenchymal Stem Cells

腫瘍と間葉系幹細胞の間細胞小胞を介した通信を定義する骨肉腫のマウスの前臨床モデル

Within the tumor microenvironment, resident or recruited mesenchymal stem cells (MSCs) contribute to malignant progression in multiple cancer types. Under ...

Generation of High-Throughput Three-Dimensional Tumor Spheroids for Drug Screening

創薬スクリーニングの高スループット三次元腫瘍回転楕円体の生成

Cancer cells have routinely been cultured in two dimensions (2D) on a plastic surface. This technique, however, lacks the true environment a tumor mass is ...

Longitudinal Morphological and Physiological Monitoring of Three-dimensional Tumor Spheroids Using Optical Coherence Tomography

光コヒーレンストモグラフィーを用いた三次元腫瘍回転楕円体の縦断的形態学的および生理学的監視

Tumor spheroids have been developed as a three-dimensional (3D) cell culture model in cancer research and anti-cancer drug discovery. However, currently, ...

Studying Normal Tissue Radiation Effects using Extracellular Matrix Hydrogels

細胞外マトリックスヒドロゲルを用いた正常組織放射線効果の研究

Radiation is a therapy for patients with triple negative breast cancer. The effect of radiation on the extracellular matrix (ECM) of healthy breast tissue ...

Fully Human Tumor-based Matrix in Three-dimensional Spheroid Invasion Assay

三次元スフェロイド浸潤アッセイにおける完全ヒト腫瘍ベースマトリクス

Two-dimensional cell culture-based assays are commonly used in in vitro cancer research. However, they lack several basic elements that form the tumor ...

Establishment and Analysis of Three-Dimensional (3D) Organoids Derived from Patient Prostate Cancer Bone Metastasis Specimens and their Xenografts

Establishment and Analysis of Three-Dimensional 3D Organoids Derived from Patient Prostate Cancer Bone Metastasis Specimens and their Xenografts

患者前立腺癌骨転移標本及びその異種移植片に由来する3次元(3D)オルガノイドの確立と解析

Three-dimensional (3D) culture of organoids from tumor specimens of human patients and patient-derived xenograft (PDX) models of prostate cancer, referred ...

A Three-dimensional Model of Spheroids to Study Colon Cancer Stem Cells

大腸癌幹細胞を研究するスフェロイドの3次元モデル

Colorectal cancers are characterized by heterogeneity and a hierarchical organization comprising a population of cancer stem cells (CSCs) responsible for ...

Three-Dimensional In Vitro Biomimetic Model of Neuroblastoma Using Collagen-Based Scaffolds

Three-Dimensional In Vitro Biomimetic Model of Neuroblastoma Using Collagen-Based Scaffolds

コラーゲンベースの足場を用いた神経芽細胞腫の3次元 in vitro 生体模倣モデル

Neuroblastoma is the most common extracranial solid tumor in children, accounting for 15% of overall pediatric cancer deaths. The native tumor tissue is a ...

骨肉腫に対する三次元骨細胞外マトリックス モデル

骨肉腫に対する三次元骨細胞外マトリックスモデル