Name: three-dimensional bone extracellular matrix model for osteosarcoma
Uploaded: 2019-04-12T14:30:00
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Los autores valoran el apoyo del Liuying Chen por su asistencia y Zhao largo por su excelente asistencia técnica durante la construcción de andamios de matriz extracelular del hueso. Este estudio es apoyado por becas de la Fundación Nacional de Ciencias naturales de China (31871413).

Uso y cuidado de los animales se llevan a cabo según los institutos nacionales de salud guía para el cuidado y uso de animales de laboratorio (publicación de NIH NO.80-23, revisada en 1996) después de la aprobación de la Animal ética Comité de Sun Yat-sen la Universidad.
1. preparación de hueso
<ol><li>Obtener 4 a ratones BALB/c de 6 semanas de edad (sin el requisito del sexo). Eutanasia a un ratón asépticamente por dislocación cervical y corte fresco del peroné, la tibia y el f?...

<ol>
	<li>Longhi, A., Errani, C., De Paolis, M., Mercuri, M., Bacci, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+bone+osteosarcoma+in+the+pediatric+age:+State+of+the+art.">Primary bone osteosarcoma in the pediatric age: State of the art.</a> Cancer Treatment Reviews. 32, 423-436 (2006).</li><li>Mohseny, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteosarcoma+originates+from+mesenchymal+stem+cells+in+consequence+of+aneuploidization+and+genomic+loss+of+Cdkn2.">Osteosarcoma originates from mesenchymal stem cells in consequence of aneuploidization and genomic loss of Cdkn2.</a> Journal of Pathology. 219, 294-305 (2009).</li><li>Mutsaers, A. J., Walkley, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cells+of+origin+in+osteosarcoma:+mesenchymal+stem+cells+or+osteoblast+committed+cells.">Cells of origin in osteosarcoma: mesenchymal stem cells or osteoblast committed cells.</a> Bone. 62, 56-63 (2014).</li><li>Sato, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+tumors+can+derive+from+Ng2/Cspg4-Expressing+pericytes+with+&#946;-Catenin+modulating+the+neoplastic+phenotype.">Mesenchymal tumors can derive from Ng2/Cspg4-Expressing pericytes with &#946;-Catenin modulating the neoplastic phenotype.</a> Cell Reports. 16, 917-927 (2016).</li><li>Patane, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MET+overexpression+turns+human+primary+osteoblasts+into+osteosarcomas.">MET overexpression turns human primary osteoblasts into osteosarcomas.</a> Cancer Research. 66, 4750-4757 (2006).</li><li>Poos, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomic+heterogeneity+of+osteosarcoma+-+shift+from+single+candidates+to+functional+modules.">Genomic heterogeneity of osteosarcoma - shift from single candidates to functional modules.</a> PLoS One. 10, 123082 (2015).</li><li>Martin, J. 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P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteosarcoma:+anatomic+and+histologic+variants.">Osteosarcoma: anatomic and histologic variants.</a> American Journal of Clinical Pathology. 125, 555-581 (2006).</li><li>Lipinski, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+evolution+and+the+limits+of+predictability+in+precision+cancer+medicine.">Cancer evolution and the limits of predictability in precision cancer medicine.</a> Trends in Cancer. 2, 49-63 (2016).</li><li>McGranahan, N., Swanton, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonal+heterogeneity+and+tumor+evolution:+past,+present,+and+the+future.">Clonal heterogeneity and tumor evolution: past, present, and the future.</a> Cell. 168, 613-628 (2017).</li><li>Brown, H. 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J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aerosol+gemcitabine:+preclinical+safety+and+in+vivo+antitumor+activity+in+osteosarcoma-bearing+dogs.">Aerosol gemcitabine: preclinical safety and in vivo antitumor activity in osteosarcoma-bearing dogs.</a> Journal of Aerosol Medicine and Pulmonary Drug Delivery. 23, 197-206 (2010).</li><li>Rodriguez, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+canine+osteosarcoma+as+a+model+to+assess+efficacy+of+novel+therapies:+Can+old+dogs+teach+us+new+tricks.">Using canine osteosarcoma as a model to assess efficacy of novel therapies: Can old dogs teach us new tricks.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 804, 237-256 (2014).</li><li>Mohseny, A. 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E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+matrix+scaffolds+for+cartilage+and+bone+regeneration.">Extracellular matrix scaffolds for cartilage and bone regeneration.</a> Trends in Biotechnology. 31, 169-176 (2013).</li><li>Grayson, W. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+initial+seeding+density+and+fluid+perfusion+rate+on+formation+of+tissue-engineered+bone.">Effects of initial seeding density and fluid perfusion rate on formation of tissue-engineered bone.</a> Tissue Engineering Part A. 14, 1809-1820 (2008).</li><li>Mikulic, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+angiogenesis+and+outcome+in+osteosarcoma.">Tumor angiogenesis and outcome in osteosarcoma.</a> Pediatric Hematology and Oncology. 21, 611-619 (2004).</li><li>Ren, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vasculogenic+mimicry:+a+new+prognostic+sign+of+human+osteosarcoma.">Vasculogenic mimicry: a new prognostic sign of human osteosarcoma.</a> Human Pathology. 45, 2120-2129 (2014).</li><li>Bonuccelli, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+mesenchymal+stem+cells+in+osteosarcoma+and+metabolic+reprogramming+of+tumor+cells.">Role of mesenchymal stem cells in osteosarcoma and metabolic reprogramming of tumor cells.</a> Oncotarget. 5, 7575-7588 (2014).</li></ol>

En general, OS pueden clasificarse como osteoblástico, condroblástico y ﬁbroblastic subtipos dependiendo de su componente histológico dominante. Su pronóstico es dependiente no sólo de parámetros histologic sino también en su sitio anatómico. Puede ocurrir dentro de los huesos (en los intramedulares o compartimiento intracortical), en las superficies de los huesos y en sitios extraosseous19. La aparición y la heterogeneidad del sistema operativo pueden ser aclados como una conjugación ...

Osteosarcoma (OS) ocurre generalmente en áreas, la metáfisis de huesos largos, en pleno crecimiento durante la adolescencia. Más del 80% de los sitios afectados OS tienen preferencia por la metáfisis de la tibia proximal y húmero proximal como distal y proximal de fémur, correspondiente a la ubicación de la placa de crecimiento1. Sistema operativo consta de varios subtipos de células con propiedades mesenquimales y una considerable diversidad en las características histológicas y grado. Evidencias apoyan las células madre mesenquimales (MSCs), compromiso de precursores de osteoblastos y pericitos como las células de origen2,3,4,5. Estas células pueden acumularse alteraciones genéticas o epigenéticas y dar lugar a OS bajo la influencia de ciertas señales microambiental de hueso. Mecanismos intrínsecos y extrínsecos como resultado la inestabilidad genómica y heterogeneidad del sistema operativo, con múltiples fenotipos morfológicos y clínicos6,7. Terapias individualizadas o screening de nuevas drogas, nuevos modelos tiene que generarse a contra heterogeneidad u otros trastornos clínicos.
OS es un tumor sólido maligno intra óseo. La complejidad y la actividad de alrededor de elementos del microambiente confieren diferencias fenotípicas y funcionales en las células de sistema operativo en diferentes lugares de un tumor. Matriz extracelular del hueso (BEM) proporciona un andamiaje estructural y bioquímico para la deposición mineral y remodelado óseo. La porción orgánica de matriz extracelular (ECM) consiste en principalmente de tipo I colágeno secretada por las células de linaje osteoblástico, mientras que su porción mineralizada está compuesta de fosfato de calcio en forma de hidroxiapatita8. El papel dinámico de las redes de ECM es regular la adhesión celular, la diferenciación, la diafonía y tejido función mantenimiento9.
Desmineralizada hidrogeles BEM y ECM se han utilizado con éxito en cultivo de células y pueden mejorar la célula proliferación10,11. ECM como hueso sintetizado puede regular el tamaño, las decisiones del destino y progresión de linaje de MSCs12,13,14. Por otra parte, resultados prueba de su importancia clínica para proporcionar actividad osteogénica por estimulantes procesos celulares durante hueso formación y regeneración de15,16,17.
En este artículo, nuestro grupo establece una alternativa favorable para el cultivo a largo plazo tridimensional y modelo modificado. OS las células inyectadas en el tejido derivado de BEM presentan un fenotipo heterogéneo mesenquimal fácilmente en comparación con el plástico bidimensionales culturas. BEM deriva de mostrar tejido homólogo específica su ventaja dramática como siendo un nicho nativo para el sistema operativo en vitro de las células y tiene un gran potencial en investigación clínica y teórica de OS. Esta plataforma BEM caracterizada es simple pero eficaz para la investigación en vitro y podrá ampliarse en modelado a cánceres múltiples.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1049px;" width="1049">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21">15 mL centrifuge tube</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>188271</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21">50 mL centrifuge tube</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>227270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21">6 cm cell culture dish</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>628160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21">6-well plate</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>657160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21">Ampicillin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9393</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42">C57-BL/6J mouse</td>
			<td>Sun Yat-sen University Laboratory Animal Center</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25">CO2 incubator</td>
			<td>SHEL LAB</td>
			<td>SCO5A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42">Dibasic sodium phosphate</td>
			<td>Guangzhou Chemical Reagent Factory</td>
			<td>BE14-GR-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21">DMEM/F12</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D0547</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21">Fetal bovine serum</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30084.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21">Hemocytometer</td>
			<td>BLAU</td>
			<td>717805</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21">Kanamycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>PHR1487</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42">MG-63</td>
			<td>Chinese Academy of Science, Shanghai Cell Bank</td>
			<td></td>
			<td>Human osteosarcoma cell line</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42">MNNG/HOS</td>
			<td>Chinese Academy of Science, Shanghai Cell Bank</td>
			<td></td>
			<td>Human osteosarcoma cell line</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42">Phenol red</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4633</td>
			<td>A solution of phenol red is used as a pH indicator: its color exhibits a gradual transition from yellow to red over the pH range 6.6 to 8.0.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21">Potassium chloride</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A100395</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21">Potassium Phosphate Monobasic</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A501211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21">Sodium chloride</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A501218</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

three-dimensional bone extracellular matrix model for osteosarcoma

Osteosarcoma (OS) es el más común y un tumor óseo primario altamente agresivos. Se caracteriza con variaciones anatómicas e histologic junto con dificultades en el diagnóstico o pronósticas. OS compone de las células cancerosas genotípicamente y fenotípicamente heterogéneas. Elementos del microambiente de hueso se han demostrado a cuenta de la heterogeneidad y la enfermedad la progresión del tumor. Matriz extracelular del hueso (BEM) conserva el microestructurales matrices y componentes bioquímicos de la matriz extracelular nativa. Este nicho específico de tejido proporciona un andamiaje favorable y a largo plazo para la proliferación y células OS siembra. Este artículo proporciona un protocolo para la preparación del modelo BEM y su aplicación experimental. OS células pueden crecer y diferenciarse en múltiples fenotipos compatibles con la complejidad histopatológica de los especímenes clínicos OS. El modelo también permite la visualización de diversas morfologías y su asociación con alteraciones genéticas y mecanismos subyacentes. Como homólogo a OS humanos, este modelo de BEM OS puede ser desarrollado y aplicado a la patología y la investigación clínica de OS.

Después de la desmineralización y descelularización, BEM parece ser translúcido con mayor resistencia y tenacidad en comparación con el hueso nativo del ratón. Un pequeño residuo de músculo y el espacio de la cavidad medular pueden observarse claramente (figura 1A, B). Para determinar la efectiva descelularización de BEM, BEM es embebido en parafina después de la fijación y luego cortado en secciones de 3 – 5 μm para coloración hematoxilina-eosina (H & E). La ...

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Three-Dimensional Bone Extracellular Matrix Model for Osteosarcoma

El modelo de la matriz extracelular (BEM) de hueso para el osteosarcoma (OS) está bien establecida y se muestra aquí. Puede utilizarse como un andamio adecuado para mímico el tumor primario crecimiento en vitro y proporcionando un modelo ideal para el estudio de la heterogeneidad histologic y cytogenic de OS.

Modelo de matriz extracelular ósea tridimensional para el Osteosarcoma

Osteosarcoma (OS) is the most common and a highly aggressive primary bone tumor. It is characterized with anatomic and histologic variations along with ...

Este método proporciona una estrategia eficiente para preparar andamios funcionales para la investigación de tumores óseos. Decelularizó la matriz extracelullar ósea, mostró serocompatibilidad variable para la supervivencia y actividades de las células osteosarcomas. La principal ventaja de esta técnica es que el cultivo de células de osteosarcoma en matriz ósea muestra morfología altamente heterogénea similar a una histopatología de osteosarcoma clínico.El método proporciona un modelo ideal para investigar el desarrollo, la progresión de las sensibilidades de los fármacos de los tumores óseos, como el osteosarcoma, el sarcoma de Ewing y la metástasis de otros tumores malignos hasta los huesos. Para empezar, obtener ratones BALB/c de cuatro a seis semanas de edad, después de eutanasiar un ratón usando tijeras quirúrgicas estériles, cortar el nébulo fresco, la tibia y el fémur de una extremidad posterior. Con la ayuda de pinzas, pelar el tejido epitelial, y luego eliminar la mayor cantidad de tejido blando como sea posible.Enjuague los huesos de las piernas con una solución estéril de PBS de 10 mM dos veces para extraer sangre en un plato de seis centímetros. Sumerja los huesos en un plato con 75% de etanol durante tres minutos y luego enjuague con PBS dos veces. Almacene los huesos limpios en un tubo centrífugo estéril de 50 mililitros con tubo PBS estéril a 80 grados Centígrados.Descongelar los huesos congelados a temperatura ambiente y luego congelar de nuevo a 80 grados Celsius durante una hora. Somete los huesos a más de dos ciclos de congelación y descongelación para la lisis celular y la descomposición del tejido. A continuación, coloque los huesos en un tubo de centrífuga estéril de 50 mililitros lleno de 0,5 HCl normales e incubar durante la noche a temperatura ambiente en un agitador orbital con agitación suave para asegurar una cobertura completa e uniforme de los huesos.Después de la descalcificación, decantar completamente la solución de ácido clorhídrico y enjuagar los huesos con agua corriente durante una hora. Luego, use agua destilada para lavar los huesos dos veces durante 15 minutos por lavado en un agitador orbital. Decantar completamente la solución.Para extraer los lípidos en huesos desmineralizados, coloque los huesos en un tubo centrífugo de 50 mililitros con una mezcla 1:1 de metanol y cloroformo. Envuelva el tubo con papel de estaño para evitar la luz para la prevención de la descomposición del cloroformo. Y pon el tubo en un agitador orbital durante una hora.Luego, usa pinzas para transferir los huesos a otro tubo de metanol con papel de estaño durante 30 minutos. Retire el metanol por completo y lave con agua destilada dos veces durante 15 minutos en un agitador orbital. Decantar el agua de lavado final y proceder bajo condición estéril.Enjuague los huesos en un plato de seis centímetros con PBS estéril durante tres minutos. Añadir 40 mililitros de solución estéril de 0,05%TE en un tubo centrífugo de 50 mililitros e incubar huesos durante 23 horas en una incubadora de dióxido de carbono a 37 grados centígrados. Deseche la solución TE y enjuague dos veces con PBS estéril suplementado con 90 g/ml de ampicilina y 90 g/ml de kanamicina durante 15 minutos cada una en el agitador orbital.Después de decantar el lavado final por completo, reponer de nuevo con 40 mililitros de PBS estéril con antibióticos. Lávese bien durante 24 horas a temperatura ambiente con un suave temblor para lograr una esterilización eficaz de los espacios porosos. Luego, transfiera los huesos a un tubo centrífugo de 50 mililitros lleno de PBS estéril con antibióticos.La matriz extracelular ósea preparada se puede almacenar a cuatro grados centígrados durante dos meses. Sumerja BEM en 75% de etanol en un plato y agite suavemente el plato a mano durante 30 segundos. A continuación, enjuague con PBS durante 30 segundos, dos veces.Transfiera el BEM a una placa de cultivo celular limpia de seis pozos. Añadir dos mililitros de medio de cultivo completo a cada pozo. Incubar el BEM durante la noche en una incubadora de dióxido de carbono a 37 grados centígrados.Obtener líneas celulares de OS humanos en 100 microlitros de PBS precalejado que contienen el indicador de rojo fenol. Utilice una pipeta para suspender las células del sistema operativo con la concentración aproximada de 1 por 10 a la 5a. Después de que el BEM esté completamente empapado en el medio, desde epífisis proximal o distal, perfore la aguja hasta la cavidad medular de BEM e inyecte las células del sistema operativo en BEM.Incubar el modelo OS-BEM durante un mínimo de dos horas en una atmósfera humidificada de dióxido de carbono del 5% a 37 grados celsius para asegurar que las células inyectadas se adhieran firmemente a BEM. Luego, saca el plato de la incubadora. Añadir un medio de cultivo de mililitros en la placa, y mantenerlo en la incubadora durante la noche para recubrir completamente la superficie del cultivo BEM.Transfiera suavemente el modelo OS-BEM a un nuevo pozo de una placa de seis pozos con una pinza estéril, y realimente un medio de cultivo fresco de un mililitro. Cultivo del modelo durante 14 días en la incubadora. Durante la incubación de 14 días, siga monitoreando el color medio.Si el medio se convierte en naranja, o incluso amarillo, actualice inmediatamente el medio descartando la mitad del medio antiguo y añadiendo un nuevo medio para mantener un ambiente saludable para las células del sistema operativo. Mantenga el estado de la célula de monitoreo bajo el microscopio de fluorescencia invertido. Cuando las células del sistema operativo se expanden a la placa, transfiera suavemente el modelo OS-BEM a otro nuevo pozo con pinzas estériles.Después de 14 días de cultivo, enjuague suavemente el modelo OS-BEM con PBS para eliminar el medio de cultivo. A continuación, transfiera a un tubo centrífugo de 15 mililitros y agregue un 10% de formalina tamponada para fijar la identificación histológica. Después de la desmineralización y la descelularización, BEM parece ser translúcido con mayor resistencia y tenacidad en comparación con el hueso nativo del ratón.Se puede observar claramente un pequeño residuo muscular en el espacio de la cavidad medular. Las imágenes de campo brillante del hueso nativo y el BEM decelularizado, muestran la eliminación a fondo de los núcleos celulares. La estructura porosa natural en la disposición de la red de colágeno está bien mantenida en BEM decelularizado.Además, la tinción inmunohistoquímica para colágeno I y colágeno IV muestra que los principales componentes de la matriz extracelular se conservan en la tibia del ratón después de la descelularización. Durante el cultivo de 14 días, tanto periosteum como endosteum se infiltran por la expansión de las células del sistema operativo. Las células del sistema operativo en el BEM decelularizado muestran morfología altamente heterogénea similar a las características cicitopatológicas de una sección del sistema operativo.El análisis inmunohistoquímico después del cultivo en el modelo BEM durante 14 días muestra grandes ventajas en cultivos a largo plazo. Además, las células del sistema operativo y el cultivo de BEM, altamente expresan la glicoproteína de matriz ósea, que es específica para la matriz osteoide. El modelo tridimensional de este in vitro se ha utilizado para demostrar una heterogeneidad fenotípica y un mecanismo regulador de la desdiferenciación del osteosarcoma con éxito.

Research

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Cancer Research

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