Name: semiconductor sequencing for preimplantation genetic testing for aneuploidy
Uploaded: 2019-08-25T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Semiconductor Sequencing for Preimplantation Genetic Testing for Aneuploidy at JoVE.com

Questo studio è stato sostenuto dal Fondo generale di ricerca (Ref n. 14162417) di Hong Kong, dalla National Natural Science Foundation of China (Ref. n. 81860272), il principale piano di ricerca della Provincial Science and Technology Foundation of Guangxi (Ref No. AB16380219) e il China Postdoctoral Science Foundation Grant (Ref. 2018M630993) dalla Cina.

L'approvazione etica è stata concessa dalla Joint Chinese University of Hong Kong - Comitato etico per la ricerca clinica dei nuovi territori (numero di riferimento: 2010.432). La licenza di ricerca è stata approvata dal Council on Human Reproductive Technology di Hong Kong (Numero R3004).
1. Amplificazione dell'intero genoma
<ol><li>Prima di iniziare, controllare il volume delle perline magnetiche (Tabella dei materiali) per assicurarsi che ci sia non meno di 135 l (con u...

<ol>
	<li>Balaban, B., Urman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+oocyte+morphology+on+embryo+development+and+implantation.">Effect of oocyte morphology on embryo development and implantation.</a> Reproductive BioMedicine Online. 12 (5), 608-615 (2006).</li><li>Capalbo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlation+between+standard+blastocyst+morphology,+euploidy+and+implantation:+An+observational+study+in+two+centers+involving+956+screened+blastocysts.">Correlation between standard blastocyst morphology, euploidy and implantation: An observational study in two centers involving 956 screened blastocysts.</a> Human Reproduction. 29 (6), 1173-1181 (2014).</li><li>Magli, M. C., Gianaroli, L., Ferraretti, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosomal+abnormalities+in+embryos.">Chromosomal abnormalities in embryos.</a> Molecular and Cellular Endocrinology. 183, 29-34 (2001).</li><li>Trussler, J. L., Pickering, S. J., Ogilvie, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigation+of+chromosomal+imbalance+in+human+embryos+using+comparative+genomic+hybridization.">Investigation of chromosomal imbalance in human embryos using comparative genomic hybridization.</a> Reproductive BioMedicine Online. 8 (6), 701-711 (2004).</li><li>Fragouli, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytogenetic+analysis+of+human+blastocysts+with+the+use+of+FISH,+CGH+and+aCGH:+Scientific+data+and+technical+evaluation.">Cytogenetic analysis of human blastocysts with the use of FISH, CGH and aCGH: Scientific data and technical evaluation.</a> Human Reproduction. 26 (2), 480-490 (2011).</li><li>Calhaz-Jorge, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assisted+reproductive+technology+in+Europe,+2013:+Results+generated+from+European+registers+by+ESHRE.">Assisted reproductive technology in Europe, 2013: Results generated from European registers by ESHRE.</a> Human Reproduction. 32 (10), 1957-1973 (2017).</li><li>Dyer, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=International+committee+for+monitoring+assisted+reproductive+technologies+world+report:+Assisted+reproductive+technology+2008,+2009+and+2010.">International committee for monitoring assisted reproductive technologies world report: Assisted reproductive technology 2008, 2009 and 2010.</a> Human Reproduction. 31 (7), 1588-1609 (2008).</li><li>Dahdouh, E. M., Balayla, J., Garc&#237;a-Velasco, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+chromosome+screening+improves+embryo+selection:+A+meta-analysis.">Comprehensive chromosome screening improves embryo selection: A meta-analysis.</a> Fertility and Sterility. 104 (6), 1503-1512 (2015).</li><li>Chen, M., Wei, S., Hu, J., Quan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Can+Comprehensive+Chromosome+Screening+Technology+Improve+IVF/ICSI+Outcomes?+A+Meta-Analysis.">Can Comprehensive Chromosome Screening Technology Improve IVF/ICSI Outcomes? A Meta-Analysis.</a> PloS One. 10 (10), e0140779 (2015).</li><li>Northrop, L. E., Treff, N. R., Levy, B., Scott, J. 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A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+tale+of+three+next+generation+sequencingplatforms:+comparison+of+Ion+Torrent,+PacificBiosciences+and+Illumina+MiSeq+sequencers.">A tale of three next generation sequencingplatforms: comparison of Ion Torrent, PacificBiosciences and Illumina MiSeq sequencers.</a> BMC Genomics. 13 (1), 1-13 (2012).</li><li>Goodwin, S., McPherson, J. D., McCombie, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coming+of+age:+ten+years+of+next-generation+sequencing+technologies.">Coming of age: ten years of next-generation sequencing technologies.</a> Nature Reviews Genetics. 17 (6), 333-351 (2016).</li><li>Bono, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+of+a+semiconductor+next-generation+sequencing-based+protocol+for+preimplantation+genetic+diagnosis+of+reciprocal+translocations.">Validation of a semiconductor next-generation sequencing-based protocol for preimplantation genetic diagnosis of reciprocal translocations.</a> Prenatal Diagnosis. 35 (10), 938-944 (2015).</li><li>Harton, G. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ESHRE+PGD+Consortium/Embryology+Special+Interest+Groupbest+practice+guidelines+for+polar+body+and+embryo+biopsy+for+preimplantation+genetic+diagnosis/screening+(PGD/PGS).">ESHRE PGD Consortium/Embryology Special Interest Groupbest practice guidelines for polar body and embryo biopsy for preimplantation genetic diagnosis/screening (PGD/PGS).</a> Human Reproduction. 26 (1), 41-46 (2011).</li><li>Liu, W. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+performance+of+MALBAC+and+MDA+methods+in+the+identification+of+concurrent+mutations+and+aneuploidy+screening+to+diagnose+beta-thalassaemia+disorders+at+the+single-+and+multiple-cell+levels.">The performance of MALBAC and MDA methods in the identification of concurrent mutations and aneuploidy screening to diagnose beta-thalassaemia disorders at the single- and multiple-cell levels.</a> Journal of Clinical Laboratory Analysis. 32 (2), 1-8 (2018).</li><li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+comparison+of+the+performance+of+four+whole+genome+amplification+kits+on+ion+proton+platform+in+copy+number+variation+detection.">The comparison of the performance of four whole genome amplification kits on ion proton platform in copy number variation detection.</a> Bioscience Reports. 37 (4), BSR20170252 (2017).</li><li>Munn&#233;, S., Grifo, J., Wells, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mosaicism:+&#8220;survival+of+the+fittest&#8221;+versus+&#8220;no+embryo+left+behind&#8221;.">Mosaicism: &#8220;survival of the fittest&#8221; versus &#8220;no embryo left behind&#8221;.</a> Fertility and Sterility. 105 (5), 1146-1149 (2016).</li><li>Del Carmen Nogales, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Type+of+chromosome+abnormality+affects+embryo+morphology+dynamics.">Type of chromosome abnormality affects embryo morphology dynamics.</a> Fertility and Sterility. 107 (1), 229-235 (2017).</li><li>Harton, G. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ESHRE+PGD+consortium+best+practice+guidelines+for+amplification-based+PGD.">ESHRE PGD consortium best practice guidelines for amplification-based PGD.</a> Human Reproduction. 26 (1), 33-40 (2011).</li><li>Deleye, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shallow+whole+genome+sequencing+is+well+suited+for+the+detection+of+chromosomal+aberrations+in+human+blastocysts.">Shallow whole genome sequencing is well suited for the detection of chromosomal aberrations in human blastocysts.</a> Fertility and Sterility. 104 (5), 1276-1285 (2015).</li><li>Bielanska, M., Tan, S. L., Ao, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosomal+mosaicism+throughout+human+preimplantation+development+in+vitro:+incidence,+type,+and+relevance+to+embryo+outcome.">Chromosomal mosaicism throughout human preimplantation development in vitro: incidence, type, and relevance to embryo outcome.</a> Human Reproduction. 17 (2), 413-419 (2002).</li><li>Treff, N. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+targeted+next-generation+sequencing-based+preimplantation+genetic+diagnosis+of+monogenic+disease.">Evaluation of targeted next-generation sequencing-based preimplantation genetic diagnosis of monogenic disease.</a> Fertility and Sterility. 99 (5), 1377-1384 (2013).</li></ol>

Diverso da altre chimiche di sequenziamento, il sequencer qui descritto usa il semiconduttore per il rilevamento dei nucleotidi. Il chip stesso è un dispositivo elettronico che rileva gli ionidi idrogeno mediante l'incorporazione di base 17, basata sulla polimerasi, che consente il tempo di sequenziamento di 2,4 h del programma Proton. Inoltre, il chip è un chip di microwell che permette la localizzazione di una molecola bersaglio, che è diversa dalla chimica di sequenziamento delle celle di fl...

La scelta di embrioni vitali di buona qualità con numeri di copia cromosomica normale (euploide) per il trasferimento nella riproduzione assistita aiuta a migliorare gli esiti della gravidanza. Tradizionalmente, il sistema di classificazione morfologica ben consolidato è ampiamente utilizzato per la valutazione degli embrioni a causa della sua facile disponibilità e della natura non invasiva. Tuttavia, è stato dimostrato che la valutazione morfologica può fornire solo informazioni limitate sulla qualità dell'embrione1 e sul potenziale di impianto2. Una ragione fondamentale è la sua incapacità di valutare la composizione cromosomica degli embrioni.
L'aneuploidia cromosomica (numero di copie anomale di cromosomi) è una delle principali cause che portano all'arresto dello sviluppo embrionale, al fallimento dell'impianto o alla perdita della gravidanza. L'insorgenza di aneuploidia è stata ben documentata negli embrioni umani, che rappresentail 60%,70% negli embrioni in fase di scissione 3,4 e 50%-60% nelle blastocisti5. Questo, in una certa misura, ha contribuito al collo di bottiglia nel miglioramento del tasso di gravidanza del trattamento di fecondazione in vitro (IVF), che ha mantenuto a circa il 35%,40%6,7. Pertanto, la selezione di embrioni euploidi per il trasferimento è creduta per essere utile per migliorare gli esiti della gravidanza. A tal fine, sono stati ulteriormente sviluppati test genetici preimpianto per l'aneuploidia (PGT-A) per studiare la vitalità degli embrioni utilizzando approcci genetici. Ci sono un numero crescente di studi controllati randomizzati e studi di coorte che supportano il ruolo cruciale di PGT-A. È stato dimostrato che l'applicazione di PGT-A riduce il tasso di aborto spontaneo e aumenta il tasso di gravidanza clinica e il tasso di impianto8, tasso di gravidanza in corso e tasso di natalità vivo9.
Storicamente, diversi metodi sono stati applicati in PGT-A, come la fluorescenza nell'ibridazione situ (FISH), l'ibridazione genomica comparativa (CGH), l'ibridazione genomica comparativa (CGH), la cGH di array e il polimorfismo a singolo nucleotide (SNP)-microarray. Studi precedenti hanno indicato che PGT-A per gli embrioni in fase di scissione di FISH produce risultati scarsamente coerenti con quelli ottenuti dallo screening cromosomico completo (CCS) delle blastocisti corrispondenti utilizzando 59273array-CGH o SNP-microarray5927310. Queste discrepanze possono essere attribuite al mosaicismo cromosomico, ai manufatti tecnici FISH o all'autocorrezione embrionale degli errori di segregazione cromosomica durante lo sviluppo11. È stato ampiamente riconosciuto che l'utilizzo di biopsie del trophectoderm blastocistico (TE) per PGT-A basati su array come array-CGH o SNP-microarray è efficace per identificare lo squilibrio cromosomico negli embrioni10,12. Recentemente, il sequenziamento di nuova generazione a cella singola (NGS) fornisce un approccio ad alta produttività ed economico per l'analisi genetica e ha dimostrato l'applicabilità clinica in PGT-A13,14,15, che lo rendono un approccio promettente alternativa ai metodi attualmente disponibili.
Qui, presentiamo un metodo NGS basato su semiconduttori veloce, robusto e a basso costo per lo screening dell'aneuploidia negli embrioni umani. Il primo passo del flusso di lavoro è l'amplificazione dell'intero genoma (WGA) del campione di embrioni biopsied, utilizzando un kit WGA a cella singola, seguito dalla costruzione della libreria di sequenziamento e dal successivo sequenziamento sul sistema di sequenziamento dei semiconduttori.
Attraverso il rilevamento degliioni H che vengono rilasciati da ogni incorporazione di triplofosfato deossiribonucleoside durante la sintesi del filamento di DNA, il sistema trasferisce i segnali chimici (pH change) catturati dagli elementi semiconduttori ai dati digitali diretti , che vengono ulteriormente interpretati nelle informazioni sulla sequenza del DNA. Eliminando la necessità di costosi rilevamenti ottici e reazioni di sequenziamento complesse, questa semplice chimica di sequenziamento riduce il costo totale del reagente e riduce il tempo di esecuzione del sequenziamento in 2 o 4 ore16. Ancora più importante, in base alle specifiche delle prestazioni del produttore, la piattaforma di sequenziamento dei semiconduttori può generare fino a 15 GB di dati di sequenziamento (dipende dalla qualità della libreria) per corsa, che è significativamente superiore rispetto ad alcuni degli altri sequencer producendo solo circa 3-4 GB di dati (con 2 x 75 bp di lunghezza di lettura)17. Nelle applicazioni cliniche di PGT-A, questa piattaforma può ottenere 24 campioni per chip generando fino a 80 milioni di letture17 e almeno un milione di letture univoche di ogni campione. La profondità di lettura può garantire che ogni campione abbia una copertura dell'intero genoma di 0,05x. I vantaggi di cui sopra di questa piattaforma lo rendono un metodo di screening ideale e quindi, facilitare le sue ampie applicazioni in PGT-A18.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>PCR tubes, 0.2 mL</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>PCR-02D-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.0</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15575020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS, pH 7.4, Ca2+ and Mg2+ free</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.0 M NaOH (1.0N) solution</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>S2567</td>
			<td>For Melt-off solution. Molecular grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf LoBind Tubes, 1.5 mL</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-698-791</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ion Plus Fragment Library Kit</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>4471252</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ELGA PURELAB Flex 3 Water Purification System or 
			Equivalent 18 M&#937; water system</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>4474524</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ion Plus Fragment Library Kit</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>4471252</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PicoPLEX WGA Amplification buffer</td>
			<td>Rubicon Genomics</td>
			<td>R30050</td>
			<td>This can be replaced by SurePlex DNA Amplification System,catalog number: PR-40-415101-03.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PicoPLEX WGA Amplification enzyme</td>
			<td>Rubicon Genomics</td>
			<td>R30050</td>
			<td>This can be replaced by SurePlex DNA Amplification System,catalog number: PR-40-415101-03.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ion OneTouch Amplification Plate</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>In kit: Ion OneTouch 2 Supplies (Part No. A26367). Extended kit component in Sheet 5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ion PI Annealing Buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MyOne Beads Capture Solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent 2100 Bioanalyzer instrument</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G2939AA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ion OneTouch Breaking Solution (black cap)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>In kit: Ion PI Hi&#8209;Q OT2 Solutions 200 (Part No. A26429). Extended kit component in Sheet 5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynabeads MyOne Streptavidin C1</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>65001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PicoPLEX WGA Cell extraction buffer</td>
			<td>Rubicon Genomics</td>
			<td>R30050</td>
			<td>This can be replaced by SurePlex DNA Amplification System,catalog number: PR-40-415101-00.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PicoPLEX WGA Cell extraction enzyme</td>
			<td>Rubicon Genomics</td>
			<td>R30050</td>
			<td>This can be replaced by SurePlex DNA Amplification System,catalog number: PR-40-415101-03.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ion PI Chip Kit v3</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A26771</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ion Chip Minifuge, 230 V</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>4479673</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ion PI dATP</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A26772</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ion PI dCTP</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A26772</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ion PI dGTP</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A26772</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ion Plus Fragment Library Kit</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>4471252</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ion Plus Fragment Library Kit</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>4471252</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ThermoQ&#8211;Temperature Dry Bath</td>
			<td>TAMAR</td>
			<td>HB-T2-A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBNext dsDNA Fragmentase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0348L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBNext dsDNA Fragmentase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0348L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ion PI dTTP</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A26772</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ion OneTouch 2 Instrument</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>INS1005527</td>
			<td>ThermoFisher Catalog number: 4474778.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ion Plus Fragment Library Kit</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>4471252</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ion One Touch ES</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>8441-22</td>
			<td>ThermoFisher Catalog number: 4469495. Extended kit component in Sheet 5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>51976</td>
			<td>This can be replaced by any brand&#39;s molecular grade absolute ethanol.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PicoPLEX WGA Extraction enzyme dilution buffer</td>
			<td>Rubicon Genomics</td>
			<td>R30050</td>
			<td>This can be replaced by SurePlex DNA Amplification System,catalog number: PR-40-415101-01.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PicoPLEX WGA Extraction enzyme dilution buffer</td>
			<td>Rubicon Genomics</td>
			<td>R30050</td>
			<td>This can be replaced by SurePlex DNA Amplification System,catalog number: PR-40-415101-02.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit 3.0 Fluorometer</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>Q33216</td>
			<td>This model has been replaced by Qubit 4 Fluorometer, Catalog number: Q33226.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit ds DNA HS Assay kit</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>M2002-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit Assay Tubes</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>Q32856</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ion PI Foaming Solution</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A26772</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Index for barcoding of libraries</td>
			<td>BaseCare</td>
			<td></td>
			<td>this is a in-house prepared index. Users can buy commercial product from ThermoFisher Ion Xpress Barcode Adapters Kits (Cat. No. 4474517)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ion PI Loading Buffer</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A26772</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solid(TM) Buffer Kit-1X Low TE Buffer</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>4389764</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agencour AMPure XP Kit</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A63880</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DynaMag-2 magnet (magnetic rack)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>12321D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ion PI Master Mix PCR buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall Legend Micro 17 Microcentrifuge</td>
			<td>Micro 17</td>
			<td>75002430</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ion Plus Fragment Library Kit</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>4471252</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-free water</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td><a href="https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/AM9922">AM9922</a></td>
			<td>This can be replaced by other brand.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PicoPLEX WGA Nuclease-free water</td>
			<td>Rubicon Genomics</td>
			<td>R30050</td>
			<td>This can be replaced by SurePlex DNA Amplification System,catalog number: PR-40-415101-03.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ion OneTouch Oil bottle</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Ion PI Hi&#8209;Q OT2 Solutions 200 (Part No. A26429). Extended kit component in Sheet 5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ion Plus Fragment Library Kit</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>4471252</td>
			<td>Extended kit component in Sheet 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>double-strand DNA standard</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>This is a in-house prepared DNA standard for calibration of Qubit before quantification of library.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PicoPLEX WGA Preamplification buffer</td>
			<td>Rubicon Genomics</td>
			<td>R30050</td>
			<td>This can be replaced by SurePlex DNA Amplification System,catalog number: PR-40-415101-03.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PicoPLEX WGA Preamplification enzyme</td>
			<td>Rubicon Genomics</td>
			<td>R30050</td>
			<td>This can be replaced by SurePlex DNA Amplification System,catalog number: PR-40-415101-03.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Library Amplification Primer Mix</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>4471252</td>
			<td>Extended kit component in Sheet 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ion OneTouch Reaction Filter</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Extended kit component in Sheet 5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recovery Router</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Extended kit component in Sheet 5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recovery Tubes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Extended kit component in Sheet 5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ISP Resuspension Solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ion Proton</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>DA8600</td>
			<td>This model is imported by Da An Gene Co.,LTD. of Sun Yat-Sen University from ThermoFisher and has been certified by China Food and Drug Administration for clinical application. The catalog number in ThermoFisher is 4476610.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ion PI Hi&#8209;Q Sequencing Polymerase</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A26772</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ion PI Sequencing Primer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>server for sequencer</td>
			<td>Lenovo</td>
			<td>T260</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ion PI Sphere Particles</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platinum PCR SuperMix High Fidelity</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>4471252</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nalgene 25mm Syringe Filters</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>724-2045</td>
			<td>Pore size: 0.45&#956;m. Specifically for aqueous fluids.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ion PI Hi&#8209;Q W2 Solution</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A26772</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ion PI 1X W3 Solution</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A26772</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ion OneTouch Wash Solution C1</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>The Ion PGM Hi&#8209;Q View Sequencing Kit</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A30044</td>
			<td>Extended kit component in Sheet 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ion Plus Fragment Library Kit</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>4471252</td>
			<td>Extended kit component in Sheet 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ion PI Hi-Q Sequencing 200 Kit (1 sequencing run per initialization)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A26772</td>
			<td>Extended kit component in Sheet 4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ion PI Hi&#8209;Q OT2 200 Kit</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A26434</td>
			<td>Extended kit component in Sheet 5</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

semiconductor sequencing for preimplantation genetic testing for aneuploidy

L'aneuploidia cromosomica, una delle principali cause che portano all'arresto dello sviluppo embrionale, al fallimento dell'impianto o alla perdita della gravidanza, è stata ben documentata negli embrioni umani. Il test genetico preimpianto per l'aneuploidia (PGT-A) è un test genetico che migliora significativamente i risultati riproduttivi rilevando anomalie cromosomiche degli embrioni. Il sequenziamento di nuova generazione (NGS) fornisce un approccio ad alto valore avanzato ed economico per l'analisi genetica e ha dimostrato l'applicabilità clinica in PGT-A. Qui, presentiamo un metodo NGS a base di semiconduttori rapido e a basso costo per lo screening dell'aneeuploidia negli embrioni. Il primo passo del flusso di lavoro è l'amplificazione dell'intero genoma (WGA) del campione di embrioni biopsied, seguita dalla costruzione della libreria di sequenziamento e dal successivo sequenziamento sul sistema di sequenziamento dei semiconduttori. Generalmente, per un'applicazione PGT-A, 24 campioni possono essere caricati e sequenziati su ogni chip generando 60-80 milioni di letture ad una lunghezza di lettura media di 150 coppie di base. Il metodo fornisce un protocollo raffinato per l'esecuzione di amplificazione del modello e l'arricchimento della libreria di sequenziamento, rendendo il rilevamento PGT-A riproducibile, ad alta produttività, conveniente e risparmio di tempo. Il tempo di esecuzione di questo sequencer a semiconduttore è di sole 2 o 4 ore, riducendo il tempo di consegna dalla ricezione di campioni all'emissione di rapporti in 5 giorni. Tutti questi vantaggi rendono questo saggio un metodo ideale per rilevare aneuploidi cromosomici da embrioni e quindi facilitare la sua ampia applicazione in PGT-A.

Sulla base di questo protocollo modificato, la piattaforma di sequenziamento dei semiconduttori è stata per la prima volta, applicata per PGT-A. Abbiamo testato sulle biopsie sia da blastomeri in fase di scissione che da embrioni dello stadio di blastocisti. Si suggerisce che le cellule biopsied subiscono WGA il più presto possibile per prevenire qualsiasi degradazione del DNA. Uno studio precedente ha confrontato le prestazioni di diversi metodi WGA e ha indicato che il metodo che abbi...

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Semiconductor Sequencing for Preimplantation Genetic Testing for Aneuploidy

Qui, introduciamo un metodo di sequenziamento dei semiconduttori per il test genetico preimpianto per l'aneeuploidy (PGT-A) con i vantaggi di tempi di consegna brevi, bassi costi e alta produttività.

Sequenziamento dei semiconduttori per il test genetico preimpianto per l'aneuplodia

Chromosomal aneuploidy, one of the main causes leading to embryonic development arrest, implantation failure, or pregnancy loss, has been well documented ...

Il protocollo che presentiamo qui è un semiconduttore rapido e a basso costo, metodi basati sul sequenziamento per lo screening dell'aneuploidia negli embrioni. Il protocollo perfezionato per l'esecuzione dell'amplificazione dei modelli e le disposizioni della libreria di sequenziamento rendono il rilevamento PGTA riproducibile, ad alta velocità effettiva, economico e risparmio di tempo. Il runtime di questo sequenziatore semiconduttore è di solo due o quattro ore.Riduzione dei tempi di consegna dalla ricezione dei campioni all'emissione di report in cinque giorni. Questo metodo fornisce il sequenziamento del genoma per lo screening dell'aneuploidia, la variazione del numero di copia e le chiamate al polimorfismo mono nucleotidico. A causa della diversa chimica del sequenziamento, la libreria preparata da questo protocollo non può essere sequenziata direttamente su altri sistemi di sequenziamento.Ma lo stesso sequencer, ma diversa preparazione della libreria, è in grado di eseguire screening prenatali non invasivi. A dimostrare la procedura sarà Xiangchun Guo, un tecnico del nostro laboratorio. Per iniziare il sequenziamento, vortice ogni libreria diluita e girare brevemente quattro volte sulla mini centrifuga per tre secondi ogni volta.Quindi, prendi cinque microlitri di ogni libreria, per mettere in comune nel tubo senza nucleo, un punto cinque millilitri. Vortice la libreria mista e girare brevemente su una mini centrifuga per tre secondi. Aggiungere 150 microlitri della soluzione di rottura a due nuovi tubi di recupero.Installare i nuovi tubi di recupero, il router di recupero e la piastra di amplificazione. Mescolare invertendo la bottiglia d'olio tre volte. Assicurarsi che sia l'olio che la soluzione di recupero siano pieni di almeno due terzi.Vortice il buffer PCR master mix per 30 secondi e ruotare brevemente su una mini centrifuga per tre secondi. Vortice le particelle di sfera e la libreria mista per un minuto e girare brevemente su una mini centrifuga per tre secondi. Successivamente, preparare un mix di li legatura di 2400 microlitri, aggiungendo 172 microlitri di acqua priva di nucleasi, otto microlitri della libreria mista, 120 microlitri del mix enzimatico e 100 microlitri delle particelle di sfera, al tubo contenente 2000 microlitri del buffer PCR master mix.Impostare una pipetta su 800 microlitri e caricare la miscela di legatura sul filtro di reazione attraverso la porta del campione. Invertire la bottiglia d'olio tre volte e utilizzare una pipetta P1000 per aggiungere 200 microlitri dell'olio di reazione al filtro di reazione. Selezionare il programma Proton e quindi selezionare il pulsante assistito, per assicurarsi che il dispositivo sia stato impostato correttamente, seguendo le istruzioni sul monitor.Quindi fare clic su Avanti per avviare il programma. Caricare 100 microlitri del campione di prodotto PCR emulsione, 130 microlitri delle perline lavate, 300 microlitri della soluzione di lavaggio ES e 300 microlitri della soluzione melt-off nella striscia a otto tubi. Posizionare la striscia a otto tubi sul sistema di arricchimento.Installare una punta di pipetta e un nuovo tubo a due millilitri a punto zero e avviare il programma. Centrifuga il tubo a due millilitri a zero punti a 15.500 volte G per cinque minuti. Scartare il supernatante e tenere dieci microlitri del prodotto di arricchimento.Aggiungere 200 microlitri di acqua priva di nucleasi al tubo e mescolare con il vortice. Centrifuga di nuovo il tubo a due millilitri a punto zero. Scartare il supernatante e conservare 10 microlitri del prodotto di arricchimento.Aggiungere 90 microlitri di acqua priva di nucleasi al tubo e mescolare con il vortice. Per preparare il modello, vortice il controllo positivo e girare brevemente. Aggiungere cinque microlitri del controllo positivo a 100 microlitri del prodotto di arricchimento.Vortice e centrifuga a 15.500 volte G per cinque minuti. Scartare il supernatante e conservare 10 microlitri del modello. Aggiungere quindi 20 microlitri del primer di sequenziamento e 15 microlitri del buffer di ricottura al tubo del modello.Vortice il tubo e girare brevemente su una mini centrifuga per tre secondi. Incubare il tubo in un ciclore termico con un coperchio riscaldato. Quindi aggiungere 10 microlitri del buffer di carico al tubo.Mescolare pipettando su e giù. Mescolare i 55 microlitri del campione tubazioni su e giù e caricare il campione sul pozzo di carico del chip. Mantenere la punta della pipetta usata e il tubo PCR a due millilitri a punto zero.Posizionare il chip sulla mini centrifuga del chip quando un campione entra nel chip. Controllare la posizione e centrifugare il truciolo per 10 minuti. Preparare il tampone di ricottura al 50% aggiungendo 500 microlitri di tampone di ricottura e 500 microlitri di acqua priva di nucleasi in un tubo di un punto cinque millilitro.Preparare la soluzione di lavaggio, aggiungendo 500 microlitri di tampone di ricottura e 500 microlitri di 100%2-propanolo in un tubo da un punto cinque millilitri. Quindi, preparare la miscela schiumografica, aggiungendo 49 microlitri del tampone di ricottura del 50% e un microlitro della soluzione schiumografica a due nuovi tubi da un punto cinque millilitri. Pipettare l'aria in una delle miscele schiumosi e caricare 120 microlitri delle bolle nel pozzo di carico.Trasferire il liquido espulso eccessivo dall'uscita al pozzo di carico e centrifugare il chip per 30 secondi sulla mini centrifuga del chip. Ripetere il processo per la seconda miscela schiumosa. Aggiungere 55 microlitri del tampone di ricottura del 50% al tubo di due millilitri mantenuto a zero punti.Utilizzare la punta della pipetta mantenuta per pipettare su e giù. Caricare tutti i 55 microlitri del tampone di ricottura sul pozzo di carico. Centrifugare il chip per 30 secondi sulla mini centrifuga del chip designata.Caricare 100 microlitri della soluzione di lavaggio nel pozzo di caricamento del truciolo e scartare il liquido espulso dal pozzo di uscita. Ripetere questa fase di caricamento una volta. Caricare 100 microlitri del buffer di ricottura del 50%, nel pozzo di caricamento del truciolo.Ripetere questo passaggio di caricamento per un totale di tre volte. Aggiungere 60 microlitri del tampone di ricottura del 50% e sei microlitri dell'enzima di sequenziamento in un nuovo tubo millilitro di un punto cinque. Mescolare pipettando su e giù.Pipettare lentamente 65 microlitri di questa soluzione mista nel pozzo di caricamento del truciolo, evitando bolle. Tenere il chip lontano dalla luce e incubare a temperatura ambiente per cinque minuti. Infine, dopo l'incubazione, caricare immediatamente il chip sul sequencer e fare clic su Avvia l'esecuzione del sequenziamento sullo schermo per iniziare a sequenziare.Un'analisi statistica retrospettiva su 186 fasi di scissione e 1135 embrioni in stadio di blastocista ha portato a tassi di successo del WGA di oltre il 95% in entrambi i tipi di campioni. I tassi di guasto del controllo di qualità di sequenziamento sono stati del 3,4% nel gruppo di fase di scissione e solo dell'1,9% nel gruppo di fase blastocista. Oltre all'aneuploidia, i dati di sequenziamento possono essere utilizzati per altre analisi.Ad esempio, copiare le variazioni di numero con una dimensione inferiore a cinque megabase, o analisi del DNA mycondrial, a seconda della profondità e della qualità del sequenziamento. Con il miglioramento della chiamata del numero di copie, i ricercatori possono indagare ulteriormente il futuro del mosaicismo cromosomico negli embrioni umani allo stadio iniziale.

Research

JoVE Journal

Genetics

Methyl-binding DNA capture Sequencing for Patient Tissues

Metil-binding cattura sequenziamento del DNA per tessuti del paziente

Methylation is one of the essential epigenetic modifications to the DNA, which is responsible for the precise regulation of genes required for stable ...

Ricerca

Genetica

Detection of Copy Number Alterations Using Single Cell Sequencing

Rilevamento di Copy Number Alterazioni Utilizzando Sequencing Single Cell

Detection of genomic changes at single cell resolution is important for characterizing genetic heterogeneity and evolution in normal tissues, cancers, and ...

Generation of Native Chromatin Immunoprecipitation Sequencing Libraries for Nucleosome Density Analysis

Generazione di immunoprecipitazione della cromatina nativo sequenziamento librerie per analisi di densità del nucleosoma

We present a modified native chromatin immunoprecipitation sequencing (ChIP-seq) experimental protocol compatible with a Gaussian mixture distribution ...

Targeted Next-generation Sequencing and Bioinformatics Pipeline to Evaluate Genetic Determinants of Constitutional Disease

Sequenziamento di nuova generazione e bioinformatica Pipeline per valutare fattori determinanti genetici della malattia costituzionale mirati

Next-generation sequencing (NGS) is quickly revolutionizing how research into the genetic determinants of constitutional disease is performed. The ...

Rare Event Detection Using Error-corrected DNA and RNA Sequencing

Rilevamento di eventi rari utilizzando la sequenza di RNA e DNA di correzione d'errore

Conventional next-generation sequencing techniques (NGS) have allowed for immense genomic characterization for over a decade. Specifically, NGS has been ...

Ultralow Input Genome Sequencing Library Preparation from a Single Tardigrade Specimen

Bassissimo ingresso il sequenziamento del genoma libreria preparazione da un singolo esemplare di Tardigrade

Tardigrades are microscopic animals that enter an ametabolic state called anhydrobiosis when facing desiccation and can return to their original state ...

Amplification of Near Full-length HIV-1 Proviruses for Next-Generation Sequencing

Amplificazione del vicino full-length provirus di HIV-1 per il sequenziamento di nuova generazione

The Full-Length Individual Proviral Sequencing (FLIPS) assay is an efficient and high-throughput method designed to amplify and sequence single, near ...

A Deep-sequencing-assisted, Spontaneous Suppressor Screen in the Fission Yeast Schizosaccharomyces pombe

A Deep-sequencing-assisted, Spontaneous Suppressor Screen in the Fission Yeast Schizosaccharomyces pombe

Una schermata di soppressore Deep-sequenziamento-assistita, spontanea nel lievito a fissione Schizosaccharomyces pombe

A genetic screen for mutant alleles that suppress phenotypic defects caused by a mutation is a powerful approach to identify genes that belong to closely ...

Pooled CRISPR-Based Genetic Screens in Mammalian Cells

Schermi genetici basati su CRISPR in cellule mammaliane

Genome editing using the CRISPR-Cas system has vastly advanced the ability to precisely edit the genomes of various organisms. In the context of mammalian ...

Universal and Efficient Electroporation Protocol for Genetic Engineering of Gastrointestinal Organoids

Protocollo di elettroporazione universale ed efficiente per l'ingegneria genetica degli organoidi gastrointestinali

Electroporation is a common method for transfection with different kinds of molecules by electrical permeabilization of the plasma membrane. With the ...