Name: semiconductor sequencing for preimplantation genetic testing for aneuploidy
Uploaded: 2019-08-25T13:00:00
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この研究は、広西省科学技術財団の主要研究計画である中国国家自然科学財団(Ref No.81860272)である香港の一般研究基金(Ref No.14162417)の支援を受けた。AB16380219)、および中国から中国ポストドクター科学財団助成金(Ref No. 2018M630993)。

香港合同中国大学-新地域東部クラスター臨床研究倫理委員会(参考文献:2010.432)により倫理的承認を受けました。研究ライセンスは、香港の人間生殖技術評議会(番号R3004)によって承認されました。
1. 全ゲノム増幅
<ol><li>開始前に、磁気ビーズ(材料の表)の体積を確認して、各サンプルに135μL(20%の過剰)がないことを確認してください。磁気ビーズを室温(RT)で?...

<ol>
	<li>Balaban, B., Urman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+oocyte+morphology+on+embryo+development+and+implantation.">Effect of oocyte morphology on embryo development and implantation.</a> Reproductive BioMedicine Online. 12 (5), 608-615 (2006).</li><li>Capalbo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlation+between+standard+blastocyst+morphology,+euploidy+and+implantation:+An+observational+study+in+two+centers+involving+956+screened+blastocysts.">Correlation between standard blastocyst morphology, euploidy and implantation: An observational study in two centers involving 956 screened blastocysts.</a> Human Reproduction. 29 (6), 1173-1181 (2014).</li><li>Magli, M. C., Gianaroli, L., Ferraretti, A. 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A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+tale+of+three+next+generation+sequencingplatforms:+comparison+of+Ion+Torrent,+PacificBiosciences+and+Illumina+MiSeq+sequencers.">A tale of three next generation sequencingplatforms: comparison of Ion Torrent, PacificBiosciences and Illumina MiSeq sequencers.</a> BMC Genomics. 13 (1), 1-13 (2012).</li><li>Goodwin, S., McPherson, J. D., McCombie, W. 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L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ESHRE+PGD+Consortium/Embryology+Special+Interest+Groupbest+practice+guidelines+for+polar+body+and+embryo+biopsy+for+preimplantation+genetic+diagnosis/screening+(PGD/PGS).">ESHRE PGD Consortium/Embryology Special Interest Groupbest practice guidelines for polar body and embryo biopsy for preimplantation genetic diagnosis/screening (PGD/PGS).</a> Human Reproduction. 26 (1), 41-46 (2011).</li><li>Liu, W. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+performance+of+MALBAC+and+MDA+methods+in+the+identification+of+concurrent+mutations+and+aneuploidy+screening+to+diagnose+beta-thalassaemia+disorders+at+the+single-+and+multiple-cell+levels.">The performance of MALBAC and MDA methods in the identification of concurrent mutations and aneuploidy screening to diagnose beta-thalassaemia disorders at the single- and multiple-cell levels.</a> Journal of Clinical Laboratory Analysis. 32 (2), 1-8 (2018).</li><li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+comparison+of+the+performance+of+four+whole+genome+amplification+kits+on+ion+proton+platform+in+copy+number+variation+detection.">The comparison of the performance of four whole genome amplification kits on ion proton platform in copy number variation detection.</a> Bioscience Reports. 37 (4), BSR20170252 (2017).</li><li>Munn&#233;, S., Grifo, J., Wells, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mosaicism:+&#8220;survival+of+the+fittest&#8221;+versus+&#8220;no+embryo+left+behind&#8221;.">Mosaicism: &#8220;survival of the fittest&#8221; versus &#8220;no embryo left behind&#8221;.</a> Fertility and Sterility. 105 (5), 1146-1149 (2016).</li><li>Del Carmen Nogales, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Type+of+chromosome+abnormality+affects+embryo+morphology+dynamics.">Type of chromosome abnormality affects embryo morphology dynamics.</a> Fertility and Sterility. 107 (1), 229-235 (2017).</li><li>Harton, G. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ESHRE+PGD+consortium+best+practice+guidelines+for+amplification-based+PGD.">ESHRE PGD consortium best practice guidelines for amplification-based PGD.</a> Human Reproduction. 26 (1), 33-40 (2011).</li><li>Deleye, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shallow+whole+genome+sequencing+is+well+suited+for+the+detection+of+chromosomal+aberrations+in+human+blastocysts.">Shallow whole genome sequencing is well suited for the detection of chromosomal aberrations in human blastocysts.</a> Fertility and Sterility. 104 (5), 1276-1285 (2015).</li><li>Bielanska, M., Tan, S. L., Ao, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosomal+mosaicism+throughout+human+preimplantation+development+in+vitro:+incidence,+type,+and+relevance+to+embryo+outcome.">Chromosomal mosaicism throughout human preimplantation development in vitro: incidence, type, and relevance to embryo outcome.</a> Human Reproduction. 17 (2), 413-419 (2002).</li><li>Treff, N. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+targeted+next-generation+sequencing-based+preimplantation+genetic+diagnosis+of+monogenic+disease.">Evaluation of targeted next-generation sequencing-based preimplantation genetic diagnosis of monogenic disease.</a> Fertility and Sterility. 99 (5), 1377-1384 (2013).</li></ol>

他のシーケンシング化学品とは異なり、ここで説明するシーケンサーは、ヌクレオチドの検出に半導体を使用します。チップ自体は、ポリメラーゼ駆動ベース組み込み17により水素イオンを検出する電子デバイスであり、プロトンプログラムの2〜4時間シーケンシング時間を可能にする。また、このチップは、他のシーケンサープロバイダーによるフローセルシーケンシング...

補助生殖における転移のための正常な染色体コピー番号(ユーロイド)を持つ良好な生存胚を選択することは、妊娠の結果を改善するのに役立ちます。伝統的に、確立された形態グレーディングシステムは、その容易な可用性と非侵襲的な性質のために胚の評価のために広く使用されています。しかし、形態学的評価は、胚の質1および移植電位2に関する限られた情報しか提供できることが示されている。根本的な理由の一つは、胚の染色体組成を評価できないことである。
染色体異性体(染色体の異常コピー数)は、胚発生停止、移植不全または妊娠喪失につながる主な原因の一つである。無気腫の発生はヒト胚において十分に文書化されており、胚盤胞5では切断段階胚3、4および50%−60%で60%−70%を占めている。これは、ある程度、体外受精(IVF)治療の妊娠率の改善におけるボトルネックに寄与しており、これは約35%−40%6、7で維持されている。したがって、移植のためのユーロイド胚を選択することは、妊娠の結果を改善するために有益であると考えられている。この目的のために、移植前遺伝子検査(PGT-A)は、遺伝的アプローチを用いて胚の生存率を調べるためにさらに開発された。PGT-Aの重要な役割をサポートする無作為化対照試験およびコホート研究の数が増加している。PGT-Aの適用は流産率を減少させ、臨床妊娠率および移植率8、進行中の妊娠率および出生率9を増加させることを証明した。
歴史的に、PGT-Aには、その場所ハイブリダイゼーション(FISH)、比較ゲノムハイブリダイゼーション(CGH)、アレイ-CGH、単一ヌクレオチド多型(SNP)マイクロアレイなどの異なる方法が適用されてきました。これまでの研究では、FISHによる切断段階胚に対するPGT-Aは、59273array-CGHまたは59273array-CGHを用いた対応する胚盤胞の包括的な染色体スクリーニング(CCS)によって得られたものと一致しない結果を得るSNP-マイクロアレイ5927310.これらの不一致は、染色体モザイク、FISH技術アーティファクト、または開発11の間に染色体分離エラーの胚自己補正に起因しうる。アレイCGHやSNPマイクロアレイなどのアレイベースのPGT-Aに胚盤胞性栄養細胞(TE)生検を用いることは、胚10、12における染色体不均衡の同定に有効であると広く認識されている。近年、単細胞次世代シーケンシング(NGS)は、遺伝子解析のための高スループットと費用対効果の高いアプローチを提供し、PGT-A 13,14,15の臨床的応用性を示しています。現在利用可能な方法に代わる有望な方法です。
ここでは、ヒト胚における無気球体のスクリーニングのための高速、堅牢、低コストの半導体シーケンシングベースのNGS法を提示する。ワークフローの最初のステップは、生検胚標本の全ゲノム増幅(WGA)であり、単一細胞WGAキットを使用して、シーケンシングライブラリの構築、および半導体シーケンシングシステム上でのその後のシーケンシングを行います。
DNA鎖合成時に各デオキシリボヌクレオシド三リン酸から放出されるH+イオンを検出することにより、半導体元素によって捕捉された化学信号(pH変化)を転送し、デジタルデータを導くDNA配列情報にさらに解釈されます。高価な光学検出および複雑なシーケンシング反応のための条件を除去し、この簡単なシーケンシング化学は総試薬の費用を削減し、2-4時間16にシーケンシングの実行時間を短縮する。さらに重要なのは、製造元のパフォーマンス仕様に基づいて、半導体シーケンシングプラットフォームは、実行あたり最大15 GBのシーケンスデータ(ライブラリの品質に依存)を生成でき、他のシーケンサーよりも大幅に高い約 3−4 GBのデータ(2 x 75 bpの読み取り長)17を生成します。PGT-Aの臨床応用では、このプラットフォームは、最大8,000万回の読み取り17回、各サンプルの少なくとも100万回のユニークな読み取り値を生成するチップあたり24サンプルを達成することができます。読み取り深さは各サンプルが少なくとも0.05x全体のゲノムカバレッジを有することを保障できる。このプラットフォームの上記の利点は、理想的なスクリーニング方法を作り、したがって、PGT-A18でその広いアプリケーションを容易にします。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>PCR tubes, 0.2 mL</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>PCR-02D-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.0</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15575020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS, pH 7.4, Ca2+ and Mg2+ free</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.0 M NaOH (1.0N) solution</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>S2567</td>
			<td>For Melt-off solution. Molecular grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf LoBind Tubes, 1.5 mL</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-698-791</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ion Plus Fragment Library Kit</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>4471252</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ELGA PURELAB Flex 3 Water Purification System or 
			Equivalent 18 M&#937; water system</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>4474524</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ion Plus Fragment Library Kit</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>4471252</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PicoPLEX WGA Amplification buffer</td>
			<td>Rubicon Genomics</td>
			<td>R30050</td>
			<td>This can be replaced by SurePlex DNA Amplification System,catalog number: PR-40-415101-03.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PicoPLEX WGA Amplification enzyme</td>
			<td>Rubicon Genomics</td>
			<td>R30050</td>
			<td>This can be replaced by SurePlex DNA Amplification System,catalog number: PR-40-415101-03.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ion OneTouch Amplification Plate</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>In kit: Ion OneTouch 2 Supplies (Part No. A26367). Extended kit component in Sheet 5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ion PI Annealing Buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MyOne Beads Capture Solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent 2100 Bioanalyzer instrument</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G2939AA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ion OneTouch Breaking Solution (black cap)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>In kit: Ion PI Hi&#8209;Q OT2 Solutions 200 (Part No. A26429). Extended kit component in Sheet 5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynabeads MyOne Streptavidin C1</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>65001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PicoPLEX WGA Cell extraction buffer</td>
			<td>Rubicon Genomics</td>
			<td>R30050</td>
			<td>This can be replaced by SurePlex DNA Amplification System,catalog number: PR-40-415101-00.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PicoPLEX WGA Cell extraction enzyme</td>
			<td>Rubicon Genomics</td>
			<td>R30050</td>
			<td>This can be replaced by SurePlex DNA Amplification System,catalog number: PR-40-415101-03.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ion PI Chip Kit v3</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A26771</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ion Chip Minifuge, 230 V</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>4479673</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ion PI dATP</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A26772</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ion PI dCTP</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A26772</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ion PI dGTP</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A26772</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ion Plus Fragment Library Kit</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>4471252</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ion Plus Fragment Library Kit</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>4471252</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ThermoQ&#8211;Temperature Dry Bath</td>
			<td>TAMAR</td>
			<td>HB-T2-A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBNext dsDNA Fragmentase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0348L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBNext dsDNA Fragmentase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0348L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ion PI dTTP</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A26772</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ion OneTouch 2 Instrument</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>INS1005527</td>
			<td>ThermoFisher Catalog number: 4474778.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ion Plus Fragment Library Kit</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>4471252</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ion One Touch ES</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>8441-22</td>
			<td>ThermoFisher Catalog number: 4469495. Extended kit component in Sheet 5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>51976</td>
			<td>This can be replaced by any brand&#39;s molecular grade absolute ethanol.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PicoPLEX WGA Extraction enzyme dilution buffer</td>
			<td>Rubicon Genomics</td>
			<td>R30050</td>
			<td>This can be replaced by SurePlex DNA Amplification System,catalog number: PR-40-415101-01.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PicoPLEX WGA Extraction enzyme dilution buffer</td>
			<td>Rubicon Genomics</td>
			<td>R30050</td>
			<td>This can be replaced by SurePlex DNA Amplification System,catalog number: PR-40-415101-02.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit 3.0 Fluorometer</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>Q33216</td>
			<td>This model has been replaced by Qubit 4 Fluorometer, Catalog number: Q33226.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit ds DNA HS Assay kit</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>M2002-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit Assay Tubes</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>Q32856</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ion PI Foaming Solution</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A26772</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Index for barcoding of libraries</td>
			<td>BaseCare</td>
			<td></td>
			<td>this is a in-house prepared index. Users can buy commercial product from ThermoFisher Ion Xpress Barcode Adapters Kits (Cat. No. 4474517)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ion PI Loading Buffer</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A26772</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solid(TM) Buffer Kit-1X Low TE Buffer</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>4389764</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agencour AMPure XP Kit</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A63880</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DynaMag-2 magnet (magnetic rack)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>12321D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ion PI Master Mix PCR buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall Legend Micro 17 Microcentrifuge</td>
			<td>Micro 17</td>
			<td>75002430</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ion Plus Fragment Library Kit</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>4471252</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-free water</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td><a href="https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/AM9922">AM9922</a></td>
			<td>This can be replaced by other brand.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PicoPLEX WGA Nuclease-free water</td>
			<td>Rubicon Genomics</td>
			<td>R30050</td>
			<td>This can be replaced by SurePlex DNA Amplification System,catalog number: PR-40-415101-03.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ion OneTouch Oil bottle</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Ion PI Hi&#8209;Q OT2 Solutions 200 (Part No. A26429). Extended kit component in Sheet 5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ion Plus Fragment Library Kit</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>4471252</td>
			<td>Extended kit component in Sheet 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>double-strand DNA standard</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>This is a in-house prepared DNA standard for calibration of Qubit before quantification of library.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PicoPLEX WGA Preamplification buffer</td>
			<td>Rubicon Genomics</td>
			<td>R30050</td>
			<td>This can be replaced by SurePlex DNA Amplification System,catalog number: PR-40-415101-03.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PicoPLEX WGA Preamplification enzyme</td>
			<td>Rubicon Genomics</td>
			<td>R30050</td>
			<td>This can be replaced by SurePlex DNA Amplification System,catalog number: PR-40-415101-03.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Library Amplification Primer Mix</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>4471252</td>
			<td>Extended kit component in Sheet 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ion OneTouch Reaction Filter</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Extended kit component in Sheet 5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recovery Router</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Extended kit component in Sheet 5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recovery Tubes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Extended kit component in Sheet 5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ISP Resuspension Solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ion Proton</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>DA8600</td>
			<td>This model is imported by Da An Gene Co.,LTD. of Sun Yat-Sen University from ThermoFisher and has been certified by China Food and Drug Administration for clinical application. The catalog number in ThermoFisher is 4476610.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ion PI Hi&#8209;Q Sequencing Polymerase</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A26772</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ion PI Sequencing Primer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>server for sequencer</td>
			<td>Lenovo</td>
			<td>T260</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ion PI Sphere Particles</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platinum PCR SuperMix High Fidelity</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>4471252</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nalgene 25mm Syringe Filters</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>724-2045</td>
			<td>Pore size: 0.45&#956;m. Specifically for aqueous fluids.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ion PI Hi&#8209;Q W2 Solution</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A26772</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ion PI 1X W3 Solution</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A26772</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ion OneTouch Wash Solution C1</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>The Ion PGM Hi&#8209;Q View Sequencing Kit</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A30044</td>
			<td>Extended kit component in Sheet 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ion Plus Fragment Library Kit</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>4471252</td>
			<td>Extended kit component in Sheet 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ion PI Hi-Q Sequencing 200 Kit (1 sequencing run per initialization)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A26772</td>
			<td>Extended kit component in Sheet 4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ion PI Hi&#8209;Q OT2 200 Kit</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A26434</td>
			<td>Extended kit component in Sheet 5</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

semiconductor sequencing for preimplantation genetic testing for aneuploidy

染色体異性体は、胚発生停止、移植不全、または妊娠喪失につながる主な原因の1つであり、ヒト胚において十分に文書化されている。移植前遺伝子検査(PGT-A)は、胚の染色体異常を検出することによって生殖結果を有意に改善する遺伝子検査である。次世代シーケンシング(NGS)は、遺伝子解析のための高スループットと費用対効果の高いアプローチを提供し、PGT-Aの臨床的応用性を示しています。ここでは、胚における無気不変のスクリーニングのための迅速かつ低コストの半導体シーケンシングベースのNGS法を提示する。ワークフローの最初のステップは、生検胚標本の全ゲノム増幅(WGA)、続いてシーケンシングライブラリの構築、および半導体シーケンシングシステム上のシーケンシングです。一般に、PGT-A アプリケーションの場合、各チップに 24 個のサンプルをロードし、150 塩基対の平均読み取り長で 60-8000 万の読み取りを生成します。この方法は、テンプレートの増幅とシーケンシング ライブラリの強化を行うための洗練されたプロトコルを提供し、PGT-A検出を再現可能、高スループット、コスト効率、および時間節約にします。この半導体シーケンサーの稼働時間はわずか2~4時間で、サンプルの受け取りからレポートの発行までの所要時間を5日間に短縮します。これらすべての利点は、このアッセイを胚から染色体異性体を検出し、したがって、PGT-Aでの広い適用を容易にする理想的な方法を作る。

この改変プロトコルに基づき、半導体シーケンシングプラットフォームは初めてPGT-Aに適用されました。切断段階の胚盤胞と胚盤胞期胚の両方からの生検について試験した。生検細胞は、DNAの分解を防ぐために、できるだけ早くWGAを受けることが示唆される。以前の研究では、異なるWGAメソッドの性能を比較し、ここで説明した方法は、100 KB20のビン...

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Semiconductor Sequencing for Preimplantation Genetic Testing for Aneuploidy

ここでは、短い所要時間、低コスト、高スループットの利点を有する、異性化症(PGT-A)の移植前遺伝子検査用半導体シーケンシング法を紹介する。

無呼吸性遺伝子検査用半導体シーケンシング

Chromosomal aneuploidy, one of the main causes leading to embryonic development arrest, implantation failure, or pregnancy loss, has been well documented ...

私たちがここに提示するプロトコルは、胚の無数性をスクリーニングするための迅速かつ低コストのセミコンダクター、シーケンシングベースの方法です。テンプレートの増幅を行うための洗練されたプロトコルとシーケンシングライブラリの配置により、PGTA検出は再現性、高スループット、コスト効率と時間の節約になります。この半導体シーケンサーの実行時間はわずか2〜4時間です。サンプルの受信からレポートの発行までの所要時間を 5 日間短縮します。この方法は、異数化スクリーニング、コピー数変動、および一塩基多型呼び出しのためのゲノムシーケンシングを提供する。異なるシーケンシング化学のために、このプロトコルによって準備されたライブラリは、他のシーケンスシステム上で直接配列することはできません。しかし、同じシーケンサーは、異なるライブラリ調製物であるが、非侵襲的な出生前スクリーニングを行うことができる。この手順のデモンストレーションは、当研究室の技術者であるシャンチュン・グオです。シーケンシングを開始するには、各希釈されたライブラリを渦巻き、毎回3秒間ミニ遠心分離機で4回短時間回転します。次いで、各ライブラリーの5マイクロリットルを取り、核を含まない、5ミリリットルチューブを1点にプールする。混合ライブラリを渦巻き、3秒間ミニ遠心分離機で短時間回転します。2つの新しい回収管に、壊れた溶液の150マイクロリットルを加えます。新しい回復管、回復用ルータおよび増幅版を取付けなさい。オイルボトルを3回反転して混ぜます。オイルと回収液の両方が少なくとも3分の2満杯であることを確認してください。30秒間、マスターミックスPCRバッファーをボルテックスし、3秒間ミニ遠心分離機で短時間スピンします。球体粒子と混合ライブラリを1分間渦巻きし、ミニ遠心分離機で3秒間短時間回転します。次に、2400マイクロリットルのライゲーションミックスを調製し、172マイクロリットルのヌクレアーゼフリー水、8マイクロリットルの混合ライブラリー、120マイクロリットルの酵素ミックス、および100マイクロリットルの球体粒子を、マスターミックスPCRバッファーの2000マイクロリットルを含むチューブに加える。ピペットを800マイクロリットルにセットし、サンプルポートを通して反応フィルターにライゲーションミックスをロードします。オイルボトルを3回反転し、P1000ピペットを使用して反応フィルターに200マイクロリットルの反応油を加えます。プログラム Proton を選択し、モニターの指示に従ってデバイスが正しくセットアップされていることを確認するために、補助ボタンを選択します。次へをクリックしてプログラムを起動します。エマルジョンPCR製品サンプルの100マイクロリットル、洗浄ビーズの130マイクロリットル、ES洗浄液の300マイクロリットル、および300マイクロリットルの溶融溶液を8つのチューブストリップにロードします。8本のチューブストリップを濃縮システムに配置します。ピペットチップと新しいゼロポイント2ミリリットルチューブをインストールし、プログラムを開始します。遠心分離器は、ゼロ点2ミリリットルチューブを15で、500倍Gで5分間行う。上清を捨て、濃縮製品の10マイクロリットルを保管してください。200マイクロリットルのヌクレアーゼフリー水をチューブに加え、渦を混ぜて混ぜます。再びゼロ点2ミリリットルチューブを遠心分離する。上清を捨て、濃縮製品の10マイクロリットルを保管してください。ヌクレアーゼフリー水90マイクロリットルをチューブに加え、渦を混ぜて混ぜます。テンプレートを準備するには、ポジティブコントロールを渦を出して、短時間スピンします。濃縮製品の100マイクロリットルに正のコントロールの5マイクロリットルを追加します。ボルテックスと遠心分離機を15,500倍Gで5分間行う。上清を捨てて、テンプレートの10マイクロリットルを保管してください。次に、シーケンシングプライマーの20マイクロリットル、および15マイクロリットルのアニーリングバッファーをテンプレートチューブに加えます。チューブを渦巻きし、3秒間ミニ遠心分離機で短時間回転します。加熱された蓋を用いて、チューブをサーマルサイクラーにインキュベートします。次に、10マイクロリットルの荷重バッファーをチューブに加えます。上下にピペットを入れ、混ぜます。55マイクロリットルのサンプルを上下にピペットで混ぜ、サンプルをチップのローディングウェルにロードします。使用するピペットチップとゼロポイント2ミリリットルPCRチューブを保管してください。チップにサンプルが入ったら、チップをチップミニ遠心分離機に置きます。位置を確認し、チップを10分間遠心します。500マイクロリットルのアニーリングバッファーと500マイクロリットルのヌクレアーゼフリー水を1点5ミリリットルチューブに加えて50%アニールバッファーを調製します。洗浄液を調製し、500マイクロリットルのアニーリングバッファーと500マイクロリットルの100%2-プロパノールを1点5ミリリットルチューブに加えます。次いで、発泡混合物を調製し、50%焼鈍緩衝液の49マイクロリットル及び発泡液の1マイクロリットルを2つの新しい1点5ミリリットルチューブに加えた。ピペット空気を発泡混合物の1つに、そして120マイクロリットルの気泡を装填井戸に積み込む。過度に排出された液体を出口からローディングウェルに移し、チップミニ遠心分離機でチップを30秒間遠心します。2 番目の発泡混合物のプロセスを繰り返します。50%アニールバッファーの 55 マイクロリットルをゼロポイント 2 ミリリットルチューブに加えます。ピペットチップを使用して、ピペットを上下にします。アニーリングバッファーの 55 マイクロリットルをすべてロードウェルにロードします。指定されたチップミニ遠心分離機でチップを30秒間遠心分離します。100マイクロリットルのフラッシュ溶液をチップローディングウェルにロードし、排出された液体を出口井戸から捨てます。このロード手順を 1 回繰り返します。50%アニールバッファの100マイクロリットルをチップローディングウェルに積み込みます。このロード手順を合計 3 回繰り返します。50%アニールバッファーの 60 マイクロリットルとシーケンシング酵素の 6 マイクロリットルを新しい 1 ポイント 5 ミリリットルチューブに加えます。上下にピペットを入れ、混ぜます。この混合溶液の65マイクロリットルをチップローディングウェルにゆっくりとピペットし、気泡を避けます。チップを光から遠ざけ、室温で5分間インキュベートします。最後に、インキュベーションの後、すぐにシーケンサーにチップをロードし、シーケンス実行を開始をクリックしてシーケンスを開始します。186の切断段階および1135個の胚盤胞期胚に関する遡及的統計分析は、両方のタイプのサンプルにおいて95%以上のWGA成功率をもたらした。シーケンシング品質管理の失敗率は、切断段階群で3.4%、胚盤胞期群ではわずか1.9%であった。非効率法の他に、シーケンスデータを他の分析に使用できます。たとえば、サイズが 5 メガベース未満の数値のバリエーションや、シーケンスの深さと品質に応じて mycondrial DNA 分析をコピーします。コピー数の呼び出しの改善により、研究者はヒト初期胚における染色体モザイク化の将来をさらに調査することができます。

Research

JoVE Journal

Genetics

Methyl-binding DNA capture Sequencing for Patient Tissues

患者の組織のためのメチル結合DNA捕捉シーケンシング

Methylation is one of the essential epigenetic modifications to the DNA, which is responsible for the precise regulation of genes required for stable ...

Detection of Copy Number Alterations Using Single Cell Sequencing

単一細胞のシーケンシングを使用したコピー数変化の検出

Detection of genomic changes at single cell resolution is important for characterizing genetic heterogeneity and evolution in normal tissues, cancers, and ...

Generation of Native Chromatin Immunoprecipitation Sequencing Libraries for Nucleosome Density Analysis

ネイティブのクロマチン免疫沈降のヌクレオソーム密度解析ライブラリをシーケンスの生成

We present a modified native chromatin immunoprecipitation sequencing (ChIP-seq) experimental protocol compatible with a Gaussian mixture distribution ...

Targeted Next-generation Sequencing and Bioinformatics Pipeline to Evaluate Genetic Determinants of Constitutional Disease

対象に次世代シーケンサーとバイオインフォマティクス パイプライン体質性疾患の遺伝的決定因子を評価するには

Next-generation sequencing (NGS) is quickly revolutionizing how research into the genetic determinants of constitutional disease is performed. The ...

Rare Event Detection Using Error-corrected DNA and RNA Sequencing

エラー修正 DNA ・ RNA シーケンスを用いた珍しいイベント検出

Conventional next-generation sequencing techniques (NGS) have allowed for immense genomic characterization for over a decade. Specifically, NGS has been ...

Ultralow Input Genome Sequencing Library Preparation from a Single Tardigrade Specimen

超低入力ヒトゲノム単一 Tardigrade の標本からのライブラリの準備

Tardigrades are microscopic animals that enter an ametabolic state called anhydrobiosis when facing desiccation and can return to their original state ...

Amplification of Near Full-length HIV-1 Proviruses for Next-Generation Sequencing

次世代シーケンシングのフルレングスの HIV-1 Proviruses 近くの増幅

The Full-Length Individual Proviral Sequencing (FLIPS) assay is an efficient and high-throughput method designed to amplify and sequence single, near ...

A Deep-sequencing-assisted, Spontaneous Suppressor Screen in the Fission Yeast Schizosaccharomyces pombe

A Deep-sequencing-assisted, Spontaneous Suppressor Screen in the Fission Yeast Schizosaccharomyces pombe

分裂酵母分裂酵母のディープ シーケンス アシスト、自発的な抑制画面

A genetic screen for mutant alleles that suppress phenotypic defects caused by a mutation is a powerful approach to identify genes that belong to closely ...

Pooled CRISPR-Based Genetic Screens in Mammalian Cells

哺乳類細胞におけるCRISPRベースの遺伝子スクリーンのプール

Genome editing using the CRISPR-Cas system has vastly advanced the ability to precisely edit the genomes of various organisms. In the context of mammalian ...

Universal and Efficient Electroporation Protocol for Genetic Engineering of Gastrointestinal Organoids

消化管オルガノイドの遺伝子工学のための汎用的かつ効率的なエレクトロポレーションプロトコル

Electroporation is a common method for transfection with different kinds of molecules by electrical permeabilization of the plasma membrane. With the ...