Name: semiconductor sequencing for preimplantation genetic testing for aneuploidy
Uploaded: 2019-08-25T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Semiconductor Sequencing for Preimplantation Genetic Testing for Aneuploidy at JoVE.com

Denne studien ble støttet av General Research Fund (Ref nr. 14162417) fra Hong Kong, National Natural Science Foundation i Kina (Ref nr. 81860272), den store forsknings plan av Provincial Science and Technology Foundation of Guangxi (Ref nr. AB16380219), og Kina postdoktor Science Foundation Grant (Ref nr. 2018M630993) fra Kina.

Etisk godkjenning ble gitt av Joint Chinese University of Hong Kong-nye territorier East Cluster Clinical Research etikk Committee (referansenummer: 2010,432). Forsknings lisens ble godkjent av rådet for Human reproduktiv teknologi i Hong Kong (Number R3004).
1. hele Genova forsterkning
<ol><li>Før start, sjekk volumet av magnetiske perler (tabell av materialer) for å sikre at det ikke er mindre enn 135 μL (med 20% overflødig) for hver prøve. Hold de magnetiske perlene...

<ol>
	<li>Balaban, B., Urman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+oocyte+morphology+on+embryo+development+and+implantation.">Effect of oocyte morphology on embryo development and implantation.</a> Reproductive BioMedicine Online. 12 (5), 608-615 (2006).</li><li>Capalbo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlation+between+standard+blastocyst+morphology,+euploidy+and+implantation:+An+observational+study+in+two+centers+involving+956+screened+blastocysts.">Correlation between standard blastocyst morphology, euploidy and implantation: An observational study in two centers involving 956 screened blastocysts.</a> Human Reproduction. 29 (6), 1173-1181 (2014).</li><li>Magli, M. C., Gianaroli, L., Ferraretti, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosomal+abnormalities+in+embryos.">Chromosomal abnormalities in embryos.</a> Molecular and Cellular Endocrinology. 183, 29-34 (2001).</li><li>Trussler, J. L., Pickering, S. J., Ogilvie, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigation+of+chromosomal+imbalance+in+human+embryos+using+comparative+genomic+hybridization.">Investigation of chromosomal imbalance in human embryos using comparative genomic hybridization.</a> Reproductive BioMedicine Online. 8 (6), 701-711 (2004).</li><li>Fragouli, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytogenetic+analysis+of+human+blastocysts+with+the+use+of+FISH,+CGH+and+aCGH:+Scientific+data+and+technical+evaluation.">Cytogenetic analysis of human blastocysts with the use of FISH, CGH and aCGH: Scientific data and technical evaluation.</a> Human Reproduction. 26 (2), 480-490 (2011).</li><li>Calhaz-Jorge, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assisted+reproductive+technology+in+Europe,+2013:+Results+generated+from+European+registers+by+ESHRE.">Assisted reproductive technology in Europe, 2013: Results generated from European registers by ESHRE.</a> Human Reproduction. 32 (10), 1957-1973 (2017).</li><li>Dyer, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=International+committee+for+monitoring+assisted+reproductive+technologies+world+report:+Assisted+reproductive+technology+2008,+2009+and+2010.">International committee for monitoring assisted reproductive technologies world report: Assisted reproductive technology 2008, 2009 and 2010.</a> Human Reproduction. 31 (7), 1588-1609 (2008).</li><li>Dahdouh, E. M., Balayla, J., Garc&#237;a-Velasco, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+chromosome+screening+improves+embryo+selection:+A+meta-analysis.">Comprehensive chromosome screening improves embryo selection: A meta-analysis.</a> Fertility and Sterility. 104 (6), 1503-1512 (2015).</li><li>Chen, M., Wei, S., Hu, J., Quan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Can+Comprehensive+Chromosome+Screening+Technology+Improve+IVF/ICSI+Outcomes?+A+Meta-Analysis.">Can Comprehensive Chromosome Screening Technology Improve IVF/ICSI Outcomes? A Meta-Analysis.</a> PloS One. 10 (10), e0140779 (2015).</li><li>Northrop, L. E., Treff, N. R., Levy, B., Scott, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SNP+microarray-based+24+chromosome+aneuploidy+screening+demonstrates+that+cleavage-stage+FISH+poorly+predicts+aneuploidy+in+embryos+that+develop+to+morphologically+normal+blastocysts.">SNP microarray-based 24 chromosome aneuploidy screening demonstrates that cleavage-stage FISH poorly predicts aneuploidy in embryos that develop to morphologically normal blastocysts.</a> Molecular Human Reproduction. 16 (8), 590-600 (2010).</li><li>Barbash-Hazan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preimplantation+aneuploid+embryos+undergo+self-correction+in+correlation+with+their+developmental+potential.">Preimplantation aneuploid embryos undergo self-correction in correlation with their developmental potential.</a> Fertility and Sterility. 92 (3), 890-896 (2009).</li><li>Fragouli, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+cytogenetic+analysis+of+the+human+blastocyst+stage.">Comprehensive cytogenetic analysis of the human blastocyst stage.</a> Fertility and Sterility. 90 (11), S36 (2008).</li><li>Fiorentino, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+validation+of+a+next-generation+sequencing-based+protocol+for+24-chromosome+aneuploidy+screening+of+embryos.">Development and validation of a next-generation sequencing-based protocol for 24-chromosome aneuploidy screening of embryos.</a> Fertility and Sterility. 101 (5), 1375-1382 (2014).</li><li>Fiorentino, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+next-generation+sequencing+technology+for+comprehensive+aneuploidy+screening+of+blastocysts+in+clinical+preimplantation+genetic+screening+cycles.">Application of next-generation sequencing technology for comprehensive aneuploidy screening of blastocysts in clinical preimplantation genetic screening cycles.</a> Human Reproduction. 29 (12), 2802-2813 (2014).</li><li>Wells, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+utilisation+of+a+rapid+low-pass+whole+genome+sequencing+technique+for+the+diagnosis+of+aneuploidy+in+human+embryos+prior+to+implantation.">Clinical utilisation of a rapid low-pass whole genome sequencing technique for the diagnosis of aneuploidy in human embryos prior to implantation.</a> Journal of Medical Genetics. 51 (8), 553-562 (2014).</li><li>Quail, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+tale+of+three+next+generation+sequencingplatforms:+comparison+of+Ion+Torrent,+PacificBiosciences+and+Illumina+MiSeq+sequencers.">A tale of three next generation sequencingplatforms: comparison of Ion Torrent, PacificBiosciences and Illumina MiSeq sequencers.</a> BMC Genomics. 13 (1), 1-13 (2012).</li><li>Goodwin, S., McPherson, J. D., McCombie, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coming+of+age:+ten+years+of+next-generation+sequencing+technologies.">Coming of age: ten years of next-generation sequencing technologies.</a> Nature Reviews Genetics. 17 (6), 333-351 (2016).</li><li>Bono, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+of+a+semiconductor+next-generation+sequencing-based+protocol+for+preimplantation+genetic+diagnosis+of+reciprocal+translocations.">Validation of a semiconductor next-generation sequencing-based protocol for preimplantation genetic diagnosis of reciprocal translocations.</a> Prenatal Diagnosis. 35 (10), 938-944 (2015).</li><li>Harton, G. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ESHRE+PGD+Consortium/Embryology+Special+Interest+Groupbest+practice+guidelines+for+polar+body+and+embryo+biopsy+for+preimplantation+genetic+diagnosis/screening+(PGD/PGS).">ESHRE PGD Consortium/Embryology Special Interest Groupbest practice guidelines for polar body and embryo biopsy for preimplantation genetic diagnosis/screening (PGD/PGS).</a> Human Reproduction. 26 (1), 41-46 (2011).</li><li>Liu, W. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+performance+of+MALBAC+and+MDA+methods+in+the+identification+of+concurrent+mutations+and+aneuploidy+screening+to+diagnose+beta-thalassaemia+disorders+at+the+single-+and+multiple-cell+levels.">The performance of MALBAC and MDA methods in the identification of concurrent mutations and aneuploidy screening to diagnose beta-thalassaemia disorders at the single- and multiple-cell levels.</a> Journal of Clinical Laboratory Analysis. 32 (2), 1-8 (2018).</li><li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+comparison+of+the+performance+of+four+whole+genome+amplification+kits+on+ion+proton+platform+in+copy+number+variation+detection.">The comparison of the performance of four whole genome amplification kits on ion proton platform in copy number variation detection.</a> Bioscience Reports. 37 (4), BSR20170252 (2017).</li><li>Munn&#233;, S., Grifo, J., Wells, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mosaicism:+&#8220;survival+of+the+fittest&#8221;+versus+&#8220;no+embryo+left+behind&#8221;.">Mosaicism: &#8220;survival of the fittest&#8221; versus &#8220;no embryo left behind&#8221;.</a> Fertility and Sterility. 105 (5), 1146-1149 (2016).</li><li>Del Carmen Nogales, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Type+of+chromosome+abnormality+affects+embryo+morphology+dynamics.">Type of chromosome abnormality affects embryo morphology dynamics.</a> Fertility and Sterility. 107 (1), 229-235 (2017).</li><li>Harton, G. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ESHRE+PGD+consortium+best+practice+guidelines+for+amplification-based+PGD.">ESHRE PGD consortium best practice guidelines for amplification-based PGD.</a> Human Reproduction. 26 (1), 33-40 (2011).</li><li>Deleye, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shallow+whole+genome+sequencing+is+well+suited+for+the+detection+of+chromosomal+aberrations+in+human+blastocysts.">Shallow whole genome sequencing is well suited for the detection of chromosomal aberrations in human blastocysts.</a> Fertility and Sterility. 104 (5), 1276-1285 (2015).</li><li>Bielanska, M., Tan, S. L., Ao, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosomal+mosaicism+throughout+human+preimplantation+development+in+vitro:+incidence,+type,+and+relevance+to+embryo+outcome.">Chromosomal mosaicism throughout human preimplantation development in vitro: incidence, type, and relevance to embryo outcome.</a> Human Reproduction. 17 (2), 413-419 (2002).</li><li>Treff, N. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+targeted+next-generation+sequencing-based+preimplantation+genetic+diagnosis+of+monogenic+disease.">Evaluation of targeted next-generation sequencing-based preimplantation genetic diagnosis of monogenic disease.</a> Fertility and Sterility. 99 (5), 1377-1384 (2013).</li></ol>

Forskjellig fra andre sekvensering kjemikalier, den Sequencer beskrevet her bruker halvledere for påvisning av nukleotider. Brikken i seg selv er en elektronisk enhet som oppdager hydrogen ioner av polymerase-drevet base innlemmelse17, som gjør at 2-4 h sekvensering tid av Proton programmet. Dessuten er chip en mikrotiterplateleser chip som gjør at lokalisering av ett mål molekyl, som er forskjellig fra flyten cellen sekvensering kjemi av andre Sequencer tilbydere. Denne protokollen er en modi...

Velge god kvalitet levedyktig embryo med normal kromosom kopi tall (euploid) for overføring i assistert reproduksjon bidrar til å forbedre graviditets utfall. Tradisjonelt er det godt etablerte morfologiske vurderingssystemet mye brukt for embryo evaluering på grunn av sin enkle tilgjengelighet og ikke-invasiv natur. Det har imidlertid vist seg at morfologiske vurderingen bare kan gi begrenset informasjon om embryo kvalitet1 og implantation potensial2. En fundamental grunn er dens manglende evne til å evaluere den kromosom sammensetningen av embryo.
Kromosomavvik (unormal kopi antall kromosomer) er en av de viktigste årsakene som fører til embryonale utviklingen arrest, implantation svikt eller graviditet tap. Forekomsten av avvik har blitt godt dokumentert i menneskets embryo, og sto for 60% − 70% i en kløft-fase embryo3,4 og 50% − 60% i blastocysts5. Dette har til en viss grad bidratt til flaskehalsen for å forbedre graviditets raten på in-vitro befruktning (IVF) behandling, som har opprettholdt på rundt 35% − 40%6,7. Derfor, velge euploid embryo for overføring antas å være gunstig for å forbedre graviditets utfall. For dette formål har Preimplantation genetisk testing for avvik (PGT-A) blitt videreutviklet for å undersøke embryo levedyktighet ved hjelp av genetiske tilnærminger. Det er økende antall randomiserte kontrollerte studier og Kohortstudier som støtter den avgjørende rollen til PGT-A. Det har blitt bevist at anvendelsen av PGT-A reduserer spontanabort rate og øker klinisk graviditet rate og implantation rate8, pågående graviditet rate og live fødselsrate9.
Historisk sett har ulike metoder blitt anvendt i PGT-A, slik som fluorescens in situ hybridisering (fisk), komparativ genomisk hybridisering (CGH), array-CGH, og singel nukleotid polymorfisme (SNP)-Microarray. Tidligere studier har indikert at PGT-A for kløft-scenen embryo av FISH gir resultater som er dårlig i samsvar med de som oppnås ved omfattende kromosom screening (CCS) av tilsvarende blastocysts ved hjelp av 59273array-CGH eller SNP-microarray5927310. Disse avvikene kan tilskrives kromosom mosaikk, fisk tekniske gjenstander, eller embryonale selv-korreksjon av kromosom segregering feil under utvikling11. Det har blitt allment anerkjent at bruk av blastocyst trophectoderm (te) biopsier for array-baserte pgt-A som Array-CGH eller SNP-Microarray er effektivt for å identifisere kromosom ubalanse i embryo10,12. Nylig, én celle neste generasjons sekvensering (NGS) gir en høy-gjennomstrømning og kostnadseffektiv tilnærming for genetisk analyse og har vist klinisk anvendelse i pgt-en13,14,15, som gjør det til en lovende alternativ til tiden tilgjengelige metoder.
Her presenterer vi en rask, robust, og lavprisalternativ halvleder sekvensering-basert NGS metode for screening av avvik i menneskelig embryo. Det for det første steg av arbeidsflyten er hele Genova forsterkning (WGA) av det biopsied embryo eksemplar, benytter en enkelt-cellen WGA utstyr, føle etter av bygging av sekvensering bibliotek, og etterfølgende sekvensering på halvleder sekvensering system.
Gjennom å oppdage H+ ioner som er gitt ut fra hver deoxyribonucleoside trifosfat INNLEMMELSE under DNA strand syntese, overfører systemet de kjemiske signalene (pH endring) tatt av halvleder elementer til direkte digitale data , som ytterligere tolkes i DNA-sekvens informasjon. Eliminerer kravet til dyre optisk deteksjon og komplekse sekvensering reaksjoner, denne enkle sekvensering kjemi reduserer totale reagens kostnader og forkorter sekvensering kjører tid i 2 − 4 timer16. Enda viktigere, basert på produsentens ytelsesspesifikasjoner, kan den halvleder sekvensering plattformen generere opptil 15 GB sekvensering data (avhengig av kvaliteten på biblioteket) per Run, som er betydelig høyere enn noen av de andre sequencere produserer bare rundt 3 − 4 GB data (med 2 x 75 BP lese lengde)17. I kliniske anvendelser av PGT-A, kan denne plattformen oppnå 24 prøver per chip genererer opp til 80 000 000 leser17 og minst 1 000 000 unike leser av hver prøve. Lese dybden kan sikre at hvert utvalg har minst 0,05 x hele Genova dekning. De ovennevnte fordelene med denne plattformen gjør det til en ideell screening metode og dermed tilrettelegge sine brede applikasjoner i PGT-A18.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>PCR tubes, 0.2 mL</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>PCR-02D-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.0</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15575020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS, pH 7.4, Ca2+ and Mg2+ free</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.0 M NaOH (1.0N) solution</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>S2567</td>
			<td>For Melt-off solution. Molecular grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf LoBind Tubes, 1.5 mL</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-698-791</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ion Plus Fragment Library Kit</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>4471252</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ELGA PURELAB Flex 3 Water Purification System or 
			Equivalent 18 M&#937; water system</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>4474524</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ion Plus Fragment Library Kit</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>4471252</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PicoPLEX WGA Amplification buffer</td>
			<td>Rubicon Genomics</td>
			<td>R30050</td>
			<td>This can be replaced by SurePlex DNA Amplification System,catalog number: PR-40-415101-03.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PicoPLEX WGA Amplification enzyme</td>
			<td>Rubicon Genomics</td>
			<td>R30050</td>
			<td>This can be replaced by SurePlex DNA Amplification System,catalog number: PR-40-415101-03.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ion OneTouch Amplification Plate</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>In kit: Ion OneTouch 2 Supplies (Part No. A26367). Extended kit component in Sheet 5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ion PI Annealing Buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MyOne Beads Capture Solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent 2100 Bioanalyzer instrument</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G2939AA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ion OneTouch Breaking Solution (black cap)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>In kit: Ion PI Hi&#8209;Q OT2 Solutions 200 (Part No. A26429). Extended kit component in Sheet 5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynabeads MyOne Streptavidin C1</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>65001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PicoPLEX WGA Cell extraction buffer</td>
			<td>Rubicon Genomics</td>
			<td>R30050</td>
			<td>This can be replaced by SurePlex DNA Amplification System,catalog number: PR-40-415101-00.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PicoPLEX WGA Cell extraction enzyme</td>
			<td>Rubicon Genomics</td>
			<td>R30050</td>
			<td>This can be replaced by SurePlex DNA Amplification System,catalog number: PR-40-415101-03.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ion PI Chip Kit v3</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A26771</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ion Chip Minifuge, 230 V</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>4479673</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ion PI dATP</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A26772</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ion PI dCTP</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A26772</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ion PI dGTP</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A26772</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ion Plus Fragment Library Kit</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>4471252</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ion Plus Fragment Library Kit</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>4471252</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ThermoQ&#8211;Temperature Dry Bath</td>
			<td>TAMAR</td>
			<td>HB-T2-A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBNext dsDNA Fragmentase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0348L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBNext dsDNA Fragmentase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0348L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ion PI dTTP</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A26772</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ion OneTouch 2 Instrument</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>INS1005527</td>
			<td>ThermoFisher Catalog number: 4474778.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ion Plus Fragment Library Kit</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>4471252</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ion One Touch ES</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>8441-22</td>
			<td>ThermoFisher Catalog number: 4469495. Extended kit component in Sheet 5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>51976</td>
			<td>This can be replaced by any brand&#39;s molecular grade absolute ethanol.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PicoPLEX WGA Extraction enzyme dilution buffer</td>
			<td>Rubicon Genomics</td>
			<td>R30050</td>
			<td>This can be replaced by SurePlex DNA Amplification System,catalog number: PR-40-415101-01.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PicoPLEX WGA Extraction enzyme dilution buffer</td>
			<td>Rubicon Genomics</td>
			<td>R30050</td>
			<td>This can be replaced by SurePlex DNA Amplification System,catalog number: PR-40-415101-02.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit 3.0 Fluorometer</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>Q33216</td>
			<td>This model has been replaced by Qubit 4 Fluorometer, Catalog number: Q33226.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit ds DNA HS Assay kit</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>M2002-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit Assay Tubes</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>Q32856</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ion PI Foaming Solution</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A26772</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Index for barcoding of libraries</td>
			<td>BaseCare</td>
			<td></td>
			<td>this is a in-house prepared index. Users can buy commercial product from ThermoFisher Ion Xpress Barcode Adapters Kits (Cat. No. 4474517)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ion PI Loading Buffer</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A26772</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solid(TM) Buffer Kit-1X Low TE Buffer</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>4389764</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agencour AMPure XP Kit</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A63880</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DynaMag-2 magnet (magnetic rack)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>12321D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ion PI Master Mix PCR buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall Legend Micro 17 Microcentrifuge</td>
			<td>Micro 17</td>
			<td>75002430</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ion Plus Fragment Library Kit</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>4471252</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-free water</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td><a href="https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/AM9922">AM9922</a></td>
			<td>This can be replaced by other brand.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PicoPLEX WGA Nuclease-free water</td>
			<td>Rubicon Genomics</td>
			<td>R30050</td>
			<td>This can be replaced by SurePlex DNA Amplification System,catalog number: PR-40-415101-03.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ion OneTouch Oil bottle</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Ion PI Hi&#8209;Q OT2 Solutions 200 (Part No. A26429). Extended kit component in Sheet 5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ion Plus Fragment Library Kit</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>4471252</td>
			<td>Extended kit component in Sheet 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>double-strand DNA standard</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>This is a in-house prepared DNA standard for calibration of Qubit before quantification of library.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PicoPLEX WGA Preamplification buffer</td>
			<td>Rubicon Genomics</td>
			<td>R30050</td>
			<td>This can be replaced by SurePlex DNA Amplification System,catalog number: PR-40-415101-03.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PicoPLEX WGA Preamplification enzyme</td>
			<td>Rubicon Genomics</td>
			<td>R30050</td>
			<td>This can be replaced by SurePlex DNA Amplification System,catalog number: PR-40-415101-03.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Library Amplification Primer Mix</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>4471252</td>
			<td>Extended kit component in Sheet 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ion OneTouch Reaction Filter</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Extended kit component in Sheet 5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recovery Router</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Extended kit component in Sheet 5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recovery Tubes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Extended kit component in Sheet 5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ISP Resuspension Solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ion Proton</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>DA8600</td>
			<td>This model is imported by Da An Gene Co.,LTD. of Sun Yat-Sen University from ThermoFisher and has been certified by China Food and Drug Administration for clinical application. The catalog number in ThermoFisher is 4476610.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ion PI Hi&#8209;Q Sequencing Polymerase</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A26772</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ion PI Sequencing Primer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>server for sequencer</td>
			<td>Lenovo</td>
			<td>T260</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ion PI Sphere Particles</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platinum PCR SuperMix High Fidelity</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>4471252</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nalgene 25mm Syringe Filters</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>724-2045</td>
			<td>Pore size: 0.45&#956;m. Specifically for aqueous fluids.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ion PI Hi&#8209;Q W2 Solution</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A26772</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ion PI 1X W3 Solution</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A26772</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ion OneTouch Wash Solution C1</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>The Ion PGM Hi&#8209;Q View Sequencing Kit</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A30044</td>
			<td>Extended kit component in Sheet 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ion Plus Fragment Library Kit</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>4471252</td>
			<td>Extended kit component in Sheet 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ion PI Hi-Q Sequencing 200 Kit (1 sequencing run per initialization)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A26772</td>
			<td>Extended kit component in Sheet 4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ion PI Hi&#8209;Q OT2 200 Kit</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A26434</td>
			<td>Extended kit component in Sheet 5</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

semiconductor sequencing for preimplantation genetic testing for aneuploidy

Kromosomavvik, en av de viktigste årsakene som fører til embryonale utvikling arrest, implantat svikt, eller graviditet tap, har vært godt dokumentert i menneskelig embryo. Preimplantation genetisk testing for avvik (PGT-A) er en genetisk test som i betydelig grad forbedrer reproduktive utfall ved å påvise kromosom unormalt av embryo. Neste generasjons sekvensering (NGS) gir en høy gjennomstrømming og kostnadseffektiv tilnærming for genetisk analyse og har vist klinisk anvendelse i PGT-A. Her presenterer vi en rask og lav pris halvleder sekvensering-basert NGS metode for screening av avvik i embryo. Det første trinnet i arbeidsflyten er hele Genova forsterkning (WGA) av biopsied embryo prøven, etterfulgt av byggingen av sekvensering biblioteket, og etterfølgende sekvensering på halvleder sekvensering systemet. Vanligvis, for en PGT-A-applikasjon, kan 24 prøver lastes inn og sekvensert på hver chip genererer 60 − 80 millioner leser på en gjennomsnittlig lese lengde på 150 base parene. Metoden gir en raffinert protokoll for å utføre mal forsterkning og berikelse av sekvensering biblioteket, noe som gjør PGT-A deteksjon reproduserbar, høy gjennomstrømming, kostnadseffektiv, og tidsbesparende. Kjøretiden for denne halvleder Sequencer er bare 2 − 4 timer, forkorte behandlingstiden fra å motta prøver å utstede rapporter i 5 dager. Alle disse fordelene gjør denne analysen en ideell metode for å oppdage kromosom aneuploidies fra embryo og dermed tilrettelegge sitt brede program i PGT-A.

Basert på denne endrede protokollen var plattformen for halvleder sekvensering for første gang, søkt om PGT-A. Vi testet på biopsier fra blastomeres og blastocyst embryo. Det er en foreslo det det biopsied celler gjennomgå WGA snarest å forhindre alle nedbrytning av DNA. En tidligere studie sammenlignet resultatene av ulike WGA metoder og indikerte at metoden vi beskrev her hadde den beste ensartethet på bin størrelsen på 100 KB20. Betenke det gjennomføre...

Watch this Scientific Journal Video about Semiconductor Sequencing for Preimplantation Genetic Testing for Aneuploidy at JoVE.com

Semiconductor Sequencing for Preimplantation Genetic Testing for Aneuploidy

Her presenterer vi en halvleder sekvensering metode for Preimplantation genetisk testing for avvik (PGT-A) med fordelene av kort behandlingstid, lave kostnader, og høy gjennomstrømming.

Semiconductor sekvensering for Preimplantation genetisk testing for avvik

Chromosomal aneuploidy, one of the main causes leading to embryonic development arrest, implantation failure, or pregnancy loss, has been well documented ...

Protokollen vi presenterer her er en rask og rimelig halvleder, sekvenseringsbaserte metoder for screening av aneuploidy i embryoer. Den raffinerte protokollen for å utføre malforsterkning, og arrangementene for sekvenseringsbibliotek gjør PGTA-deteksjonen reproduserbar, høy gjennomstrømming, kostnadseffektiv og tidsbesparende. Kjøretiden til denne halvledersekvensøren er bare to til fire timer.Forkorte behandlingstiden fra å motta prøver til å utstede rapporter til fem dager. Denne metoden gir genomsekvensering for aneuploidy screening, kopi nummervariasjon og enkelt nukleotid polymorfisme kall. På grunn av forskjellig sekvenseringskjemi kan ikke biblioteket som er utarbeidet av denne protokollen, sekvenseres direkte på andre sekvenseringssystemer.Men den samme sequenceren, men forskjellige bibliotekforberedelser, er det i stand til å gjøre ikke-invasiv prenatal screening. Demonstrere prosedyren vil være Xiangchun Guo, en tekniker fra vårt laboratorium. For å begynne sekvensering, vortex hvert fortynnet bibliotek og kort spinn fire ganger på mini sentrifuge i tre sekunder hver gang.Deretter tar du fem mikroliter av hvert bibliotek, for å basseng i kjernen-fri, ett punkt fem milliliter tube. Vortex blandet bibliotek og kort spinn på en mini sentrifuge i tre sekunder. Legg til 150 mikroliter av bryteløsningen, til to nye gjenopprettingsrør.Installer de nye gjenopprettingsrørene, gjenopprettingsruteren og forsterkningsplaten. Bland ved å invertere oljeflasken tre ganger. Sørg for at både olje- og gjenvinningsløsningen er minst to tredjedeler full.Vortex master mix PCR buffer i 30 sekunder og kort spinn på en mini sentrifuge i tre sekunder. Vortex sfærepartiklene og det blandede biblioteket i ett minutt og kort spinn på en mini sentrifuge i tre sekunder. Deretter forbereder du en 2400 mikroliter ligation blanding, ved å legge til 172 mikroliter kjerner av kjernefritt vann, åtte mikroliter av det blandede biblioteket, 120 mikroliter av enzymet blanding, og 100 mikroliter av sfærepartikler, til røret som inneholder 2000 mikroliter av master mix PCR buffer.Sett en pipette til 800 mikroliter og last ligationblandingen til reaksjonsfilteret gjennom prøveporten. Inverter oljeflasken tre ganger og bruk en P1000 pipette til å tilsette 200 mikroliter av reaksjonsoljen til reaksjonsfilteret. Velg programmet Proton, og velg deretter den assisterte knappen for å sikre at enheten er riktig konfigurert, ved å følge instruksjonene på skjermen.Klikk deretter Neste for å starte programmet. Last 100 mikroliter av emulsjons-PCR-produktprøven, 130 mikroliter av de vasket perlene, 300 mikroliter av ES-vaskeoppløsningen og 300 mikroliter av smelteløsningen inn i den åtte rørstripen. Plasser den åtte rørstripen på berikelsessystemet.Installer en pipettespiss og et nytt nullpunkt to milliliter rør og start programmet. Sentrifuger nullpunktet to milliliter rør på 15, 500 ganger G i fem minutter. Kast det overnaturlige, og hold ti mikroliter av berikelsesproduktet.Tilsett 200 mikroliter kjernefritt vann til røret og bland ved å virvle. Sentrifuger nullpunktet to milliliter rør igjen. Kast det overnaturlige og hold 10 mikroliter av berikelsesproduktet.Tilsett 90 mikroliter kjernefritt vann til røret og bland ved å virvle. For å forberede malen, virvle den positive kontrollen og spinn kort. Tilsett fem mikroliter av den positive kontrollen til 100 mikroliter av berikelsesproduktet.Vortex og sentrifuge ved 15, 500 ganger G i fem minutter. Kast det overnaturlige og hold 10 mikroliter av malen. Deretter legger du til 20 mikroliter av sekvenserings primeren, og 15 mikroliter av glødebufferen til malrøret.Vortex røret og kort spinn på en mini sentrifuge i tre sekunder. Inkuber røret i en termisk cycler med oppvarmet lokk. Tilsett deretter 10 mikroliter av lastebufferen til røret.Bland ved å pipetter opp og ned. Bland de 55 mikroliter av prøven ved å pipetter opp og ned og laste prøven til lastebrønnen på brikken. Hold den brukte pipettespissen og nullpunktet to milliliter PCR-rør.Plasser brikken på chip mini sentrifuge når noen prøve inn i brikken. Kontroller posisjonen og sentrifuger brikken i 10 minutter. Forbered 50 % glødebuffer ved å tilsette 500 mikroliter glødebuffer og 500 mikroliter kjernefritt vann i et ett punkt fem milliliter rør.Forbered spyleløsningen ved å legge til 500 mikroliter glødebuffer og 500 mikroliter på 100% 2-propanol i et ett punkt fem milliliter rør. Deretter klargjør skummende blanding, ved å legge til 49 mikroliter av 50% glødebuffer og en mikroliter av skummende løsning til to nye ett punkt fem milliliter rør. Pipette luft i en av skummende blandinger, og laste 120 mikroliter av boblene inn i lastebrønnen.Overfør den overdrevne væsken fra utgangsbrønnen til lastebrønnen, og sentrifuge brikken i 30 sekunder på chip mini sentrifuge. Gjenta prosessen for den andre skummende blandingen. Tilsett 55 mikroliter av 50% glødebufferen til holdt på null punkt to milliliter rør.Bruk den holdte pipettespissen til pipetten opp og ned. Legg alle de 55 mikroliter av glødebufferen til lastebrønnen. Sentrifuge brikken i 30 sekunder på den utpekte chip mini sentrifuge.Legg 100 mikroliter av spyleoppløsningen inn i sponlastebrønnen og kast den utviste væsken fra utgangsbrønnen. Gjenta dette innlastingstrinnet én gang. Legg 100 mikroliter av 50% glødebuffer, inn i brikken lasting godt.Gjenta dette innlastingstrinnet totalt tre ganger. Tilsett 60 mikroliter av 50% glødebuffer og seks mikroliter av sekvenseringsenzymet i et nytt ett punkt fem milliliter rør. Bland ved å pipetter opp og ned.Pipette 65 mikroliter langsomt av denne blandede løsningen inn i brikken som lastes godt, og unngår bobler. Hold brikken unna lys og inkuber ved romtemperatur i fem minutter. Til slutt, etter inkubasjonen, laster du umiddelbart brikken på sequenceren og klikker Start sekvenseringskjøringen på skjermen for å starte sekvensering.En retrospektiv statistisk analyse på 186 cleavage stadium og 1135 blastocyst stadium embryoer resulterte i over 95% WGA suksessrater i begge typer prøver. Sekvensering av kvalitetskontrollfeil var 3,4% i cleavage stadium gruppen og bare 1,9% i blastocyst stadium gruppe. Ved siden av aneuploidy kan sekvenseringsdataene brukes til annen analyse.Kopier for eksempel tallvariasjoner med en størrelse som er mindre enn fem megabase, eller mycondrial DNA-analyse, avhengig av sekvenseringsdybden og kvaliteten. Med forbedringen i kopinummer kall, forskere kan videre undersøke fremtiden for kromosomal mosaikk i menneskelige tidlig stadium embryoer.

Research

JoVE Journal

Genetics

Methyl-binding DNA capture Sequencing for Patient Tissues

Metyl-binding DNA-fangst Sekvense for Pasientservietter

Methylation is one of the essential epigenetic modifications to the DNA, which is responsible for the precise regulation of genes required for stable ...

Detection of Copy Number Alterations Using Single Cell Sequencing

Påvisning av Kopier nummer Endringer Bruke enkelt celle Sequencing

Detection of genomic changes at single cell resolution is important for characterizing genetic heterogeneity and evolution in normal tissues, cancers, and ...

Generation of Native Chromatin Immunoprecipitation Sequencing Libraries for Nucleosome Density Analysis

Generasjon av innfødte Chromatin Immunoprecipitation sekvensering biblioteker til Nucleosome tetthet analyse

We present a modified native chromatin immunoprecipitation sequencing (ChIP-seq) experimental protocol compatible with a Gaussian mixture distribution ...

Targeted Next-generation Sequencing and Bioinformatics Pipeline to Evaluate Genetic Determinants of Constitutional Disease

Neste generasjons sekvensering og bioinformatikk rørledning for å evaluere genetisk determinanter av konstitusjonelle sykdom

Next-generation sequencing (NGS) is quickly revolutionizing how research into the genetic determinants of constitutional disease is performed. The ...

Rare Event Detection Using Error-corrected DNA and RNA Sequencing

Sjelden hendelse gjenkjenning feil-korrigert DNA og RNA sekvensering

Conventional next-generation sequencing techniques (NGS) have allowed for immense genomic characterization for over a decade. Specifically, NGS has been ...

Ultralow Input Genome Sequencing Library Preparation from a Single Tardigrade Specimen

Ultralow inngang genomet sekvensering biblioteket forberedelse fra en enkelt Tardigrade prøven

Tardigrades are microscopic animals that enter an ametabolic state called anhydrobiosis when facing desiccation and can return to their original state ...

Amplification of Near Full-length HIV-1 Proviruses for Next-Generation Sequencing

Forsterkning av nær full lengde HIV-1-Proviruses for neste generasjons sekvensering

The Full-Length Individual Proviral Sequencing (FLIPS) assay is an efficient and high-throughput method designed to amplify and sequence single, near ...

A Deep-sequencing-assisted, Spontaneous Suppressor Screen in the Fission Yeast Schizosaccharomyces pombe

A Deep-sequencing-assisted, Spontaneous Suppressor Screen in the Fission Yeast Schizosaccharomyces pombe

En dyp-sekvensering-assistert, spontane Suppressor skjerm i fisjon gjær Schizosaccharomyces pombe

A genetic screen for mutant alleles that suppress phenotypic defects caused by a mutation is a powerful approach to identify genes that belong to closely ...

Pooled CRISPR-Based Genetic Screens in Mammalian Cells

Samlede CRISPR-baserte genetiske skjermer i pattedyrceller

Genome editing using the CRISPR-Cas system has vastly advanced the ability to precisely edit the genomes of various organisms. In the context of mammalian ...

Universal and Efficient Electroporation Protocol for Genetic Engineering of Gastrointestinal Organoids

Universell og effektiv elektroporasjonsprotokoll for genteknologi av gastrointestinale organoider

Electroporation is a common method for transfection with different kinds of molecules by electrical permeabilization of the plasma membrane. With the ...