Name: semiconductor sequencing for preimplantation genetic testing for aneuploidy
Uploaded: 2019-08-25T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Semiconductor Sequencing for Preimplantation Genetic Testing for Aneuploidy at JoVE.com

Este estudo foi apoiado pelo fundo de investigação geral (ref n º 14162417) de Hong Kong, a Fundação Nacional de ciências naturais da China (ref n º 81860272), o principal plano de investigação da Fundação provincial de ciência e tecnologia de Guangxi (ref no. AB16380219), e a concessão da Fundação da ciência de Postdoutorado de China (ref no. 2018M630993) de China.

A aprovação ética foi concedida pela Universidade conjunta chinesa de Hong Kong ― Comitê de ética em pesquisa clínica do grupo de novos territórios do leste (número de referência: 2010,432). A licença de pesquisa foi aprovada pelo Conselho de tecnologia reprodutiva humana de Hong Kong (número R3004).
1. amplificação do genoma inteiro
<ol><li>Antes de começar, verifique o volume de grânulos magnéticos (tabela de materiais) para garantir que não haja menos d...

<ol>
	<li>Balaban, B., Urman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+oocyte+morphology+on+embryo+development+and+implantation.">Effect of oocyte morphology on embryo development and implantation.</a> Reproductive BioMedicine Online. 12 (5), 608-615 (2006).</li><li>Capalbo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlation+between+standard+blastocyst+morphology,+euploidy+and+implantation:+An+observational+study+in+two+centers+involving+956+screened+blastocysts.">Correlation between standard blastocyst morphology, euploidy and implantation: An observational study in two centers involving 956 screened blastocysts.</a> Human Reproduction. 29 (6), 1173-1181 (2014).</li><li>Magli, M. C., Gianaroli, L., Ferraretti, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosomal+abnormalities+in+embryos.">Chromosomal abnormalities in embryos.</a> Molecular and Cellular Endocrinology. 183, 29-34 (2001).</li><li>Trussler, J. L., Pickering, S. J., Ogilvie, C. 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A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+tale+of+three+next+generation+sequencingplatforms:+comparison+of+Ion+Torrent,+PacificBiosciences+and+Illumina+MiSeq+sequencers.">A tale of three next generation sequencingplatforms: comparison of Ion Torrent, PacificBiosciences and Illumina MiSeq sequencers.</a> BMC Genomics. 13 (1), 1-13 (2012).</li><li>Goodwin, S., McPherson, J. D., McCombie, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coming+of+age:+ten+years+of+next-generation+sequencing+technologies.">Coming of age: ten years of next-generation sequencing technologies.</a> Nature Reviews Genetics. 17 (6), 333-351 (2016).</li><li>Bono, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+of+a+semiconductor+next-generation+sequencing-based+protocol+for+preimplantation+genetic+diagnosis+of+reciprocal+translocations.">Validation of a semiconductor next-generation sequencing-based protocol for preimplantation genetic diagnosis of reciprocal translocations.</a> Prenatal Diagnosis. 35 (10), 938-944 (2015).</li><li>Harton, G. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ESHRE+PGD+Consortium/Embryology+Special+Interest+Groupbest+practice+guidelines+for+polar+body+and+embryo+biopsy+for+preimplantation+genetic+diagnosis/screening+(PGD/PGS).">ESHRE PGD Consortium/Embryology Special Interest Groupbest practice guidelines for polar body and embryo biopsy for preimplantation genetic diagnosis/screening (PGD/PGS).</a> Human Reproduction. 26 (1), 41-46 (2011).</li><li>Liu, W. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+performance+of+MALBAC+and+MDA+methods+in+the+identification+of+concurrent+mutations+and+aneuploidy+screening+to+diagnose+beta-thalassaemia+disorders+at+the+single-+and+multiple-cell+levels.">The performance of MALBAC and MDA methods in the identification of concurrent mutations and aneuploidy screening to diagnose beta-thalassaemia disorders at the single- and multiple-cell levels.</a> Journal of Clinical Laboratory Analysis. 32 (2), 1-8 (2018).</li><li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+comparison+of+the+performance+of+four+whole+genome+amplification+kits+on+ion+proton+platform+in+copy+number+variation+detection.">The comparison of the performance of four whole genome amplification kits on ion proton platform in copy number variation detection.</a> Bioscience Reports. 37 (4), BSR20170252 (2017).</li><li>Munn&#233;, S., Grifo, J., Wells, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mosaicism:+&#8220;survival+of+the+fittest&#8221;+versus+&#8220;no+embryo+left+behind&#8221;.">Mosaicism: &#8220;survival of the fittest&#8221; versus &#8220;no embryo left behind&#8221;.</a> Fertility and Sterility. 105 (5), 1146-1149 (2016).</li><li>Del Carmen Nogales, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Type+of+chromosome+abnormality+affects+embryo+morphology+dynamics.">Type of chromosome abnormality affects embryo morphology dynamics.</a> Fertility and Sterility. 107 (1), 229-235 (2017).</li><li>Harton, G. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ESHRE+PGD+consortium+best+practice+guidelines+for+amplification-based+PGD.">ESHRE PGD consortium best practice guidelines for amplification-based PGD.</a> Human Reproduction. 26 (1), 33-40 (2011).</li><li>Deleye, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shallow+whole+genome+sequencing+is+well+suited+for+the+detection+of+chromosomal+aberrations+in+human+blastocysts.">Shallow whole genome sequencing is well suited for the detection of chromosomal aberrations in human blastocysts.</a> Fertility and Sterility. 104 (5), 1276-1285 (2015).</li><li>Bielanska, M., Tan, S. L., Ao, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosomal+mosaicism+throughout+human+preimplantation+development+in+vitro:+incidence,+type,+and+relevance+to+embryo+outcome.">Chromosomal mosaicism throughout human preimplantation development in vitro: incidence, type, and relevance to embryo outcome.</a> Human Reproduction. 17 (2), 413-419 (2002).</li><li>Treff, N. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+targeted+next-generation+sequencing-based+preimplantation+genetic+diagnosis+of+monogenic+disease.">Evaluation of targeted next-generation sequencing-based preimplantation genetic diagnosis of monogenic disease.</a> Fertility and Sterility. 99 (5), 1377-1384 (2013).</li></ol>

Diferente de outras químicas de sequenciamento, o sequenciador descrito aqui usa semicondutores para a detecção de nucleotídeos. A microplaqueta própria é um dispositivo eletrônico que detecte íons de hidrogênio pela incorporação base polymerase-conduzida17, que permite o tempo de sequenciamento de 2 − 4 h do programa do Proton. Além disso, a microplaqueta é uma microplaqueta do micropoço que permita a localização de uma molécula do alvo, que seja diferente da química de sequen...

A escolha de embriões viáveis de boa qualidade com números normais de cópia cromossômica (euploid) para transferência na reprodução assistida ajuda a melhorar os resultados da gravidez. Tradicionalmente, o sistema de nivelamento morfológico bem estabelecido é amplamente utilizado para a avaliação embrionária devido à sua fácil disponibilidade e natureza não invasiva. No entanto, demonstrou-se que a avaliação morfológica só pode fornecer informações limitadas sobre a qualidade do embrião1 e o potencial de implantação2. Uma razão fundamental é a sua incapacidade na avaliação da composição cromossômica dos embriões.
O aneuploidia cromossomático (número anormal da cópia dos cromossomas) é uma das causas principais que conduzem à apreensão embrionária do desenvolvimento, à falha da implantação ou à perda da gravidez. A ocorrência de aneuploidia tem sido bem documentada em embriões humanos, representando 60% − 70% em embriões de fase de clivagem3,4 e 50% − 60% em blastocistos5. Isso, em certa medida, contribuiu para o gargalo na melhoria da taxa de gestação do tratamento de fertilização in vitro (FIV), que tem mantido em torno de 35% − 40%6,7. Portanto, a seleção de embriões ADN para transferência é acreditado para ser benéfico para melhorar os resultados da gravidez. Para isso, o teste genético pré-implante para aneuploidia (PGT-A) tem sido desenvolvido para investigar a viabilidade embrionária utilizando abordagens genéticas. Há um número crescente de ensaios controlados randomizados e estudos de coorte que apoiam o papel crucial da PGT-A. Provou-se que a aplicação de PGT-A diminui a taxa de aborto espontâneo e aumenta a taxa de gravidez clínica e taxa de implantação8, taxa de gravidez em curso e taxa de natalidade ao vivo9.
Historicamente, os métodos diferentes foram aplicados em PGT-A, tal como A hibridação in situ da fluorescência (peixes), A hibridação genomic comparativa (CGH), o array-CGH, e o polimorfismo único do nucleotide (SNP)-microarray. Estudos prévios indicaram que a PGT-A para embriões em fase de clivagem por FISH produz resultados que são pouco consistentes com aqueles obtidos por triagem cromossômica abrangente (CCS) de blastocistos correspondentes usando 59273array-CGH ou SNP-microarray5927310. Estas discrepâncias podem ser atribuídas ao mosaicism cromossomático, aos artefatos técnicos dos peixes, ou à Self-correção embrionário de erros cromossomáticos da segregação durante o desenvolvimento11. Tem sido amplamente reconhecido que o uso de biópsias de blastocist trofectoderma (te) para PGT-A baseado em array, como array-CGH ou SNP-microarray, é eficaz para identificar o desequilíbrio cromossômico em embriões10,12. Recentemente, o sequenciamento de célula única de última geração (NGS) fornece uma abordagem de alta taxa de transferência e custo-benefício para análise genética e demonstrou aplicabilidade clínica no PGT-a13,14,15, o que o torna um alternativa promissora aos métodos atualmente disponíveis.
Aqui, apresentamos um método NGS baseado em sequenciamento de semicondutores rápido, robusto e de baixo custo para a triagem de aneuploidia em embriões humanos. A primeira etapa do fluxo de trabalho é a amplificação do genoma inteiro (WGA) do espécime biópsia do embrião, usando um jogo de WGA da único-pilha, seguido pela construção da biblioteca de sequenciação, e seqüenciamento subseqüente no sistema de sequenciamento do semicondutor.
Através da detecção dos íons H+ que são liberados de cada incorporação de trifosfato de deoxyribonucleosside durante a síntese da costa do ADN, o sistema transfere os sinais químicos (mudança do pH) capturados pelos elementos do semicondutor para dirigir dados digitais , que são interpretados mais na informação da seqüência do ADN. Eliminando a exigência para a deteção ótica cara e as reações de sequenciação complexas, esta química de sequenciação simples reduz o custo total do reagente e encurta o tempo running de sequenciamento em 2 − 4 horas16. Mais importante, com base nas especificações de desempenho do fabricante, a plataforma de sequenciamento de semicondutores pode gerar até 15 GB de dados de sequenciamento (depende da qualidade da biblioteca) por execução, que é significativamente maior do que alguns dos outros sequenciadores produzindo somente em torno de 3 − 4 dados do GB (com 2 x 75 BP leu o comprimento)17. Em aplicações clínicas de PGT-A, esta plataforma pode conseguir 24 amostras por a microplaqueta que gera até 80 milhões leituras17 e pelo menos 1 milhão leituras originais de cada amostra. A profundidade de leitura pode garantir que cada amostra tenha pelo menos 0,05 x de cobertura total do genoma. As vantagens acima desta plataforma fazem-lhe um método ideal da seleção e assim, facilitam suas aplicações largas em PGT-A18.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>PCR tubes, 0.2 mL</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>PCR-02D-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.0</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15575020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS, pH 7.4, Ca2+ and Mg2+ free</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.0 M NaOH (1.0N) solution</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>S2567</td>
			<td>For Melt-off solution. Molecular grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf LoBind Tubes, 1.5 mL</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-698-791</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ion Plus Fragment Library Kit</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>4471252</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ELGA PURELAB Flex 3 Water Purification System or 
			Equivalent 18 M&#937; water system</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>4474524</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ion Plus Fragment Library Kit</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>4471252</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PicoPLEX WGA Amplification buffer</td>
			<td>Rubicon Genomics</td>
			<td>R30050</td>
			<td>This can be replaced by SurePlex DNA Amplification System,catalog number: PR-40-415101-03.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PicoPLEX WGA Amplification enzyme</td>
			<td>Rubicon Genomics</td>
			<td>R30050</td>
			<td>This can be replaced by SurePlex DNA Amplification System,catalog number: PR-40-415101-03.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ion OneTouch Amplification Plate</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>In kit: Ion OneTouch 2 Supplies (Part No. A26367). Extended kit component in Sheet 5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ion PI Annealing Buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MyOne Beads Capture Solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent 2100 Bioanalyzer instrument</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G2939AA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ion OneTouch Breaking Solution (black cap)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>In kit: Ion PI Hi&#8209;Q OT2 Solutions 200 (Part No. A26429). Extended kit component in Sheet 5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynabeads MyOne Streptavidin C1</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>65001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PicoPLEX WGA Cell extraction buffer</td>
			<td>Rubicon Genomics</td>
			<td>R30050</td>
			<td>This can be replaced by SurePlex DNA Amplification System,catalog number: PR-40-415101-00.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PicoPLEX WGA Cell extraction enzyme</td>
			<td>Rubicon Genomics</td>
			<td>R30050</td>
			<td>This can be replaced by SurePlex DNA Amplification System,catalog number: PR-40-415101-03.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ion PI Chip Kit v3</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A26771</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ion Chip Minifuge, 230 V</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>4479673</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ion PI dATP</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A26772</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ion PI dCTP</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A26772</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ion PI dGTP</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A26772</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ion Plus Fragment Library Kit</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>4471252</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ion Plus Fragment Library Kit</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>4471252</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ThermoQ&#8211;Temperature Dry Bath</td>
			<td>TAMAR</td>
			<td>HB-T2-A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBNext dsDNA Fragmentase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0348L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBNext dsDNA Fragmentase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0348L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ion PI dTTP</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A26772</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ion OneTouch 2 Instrument</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>INS1005527</td>
			<td>ThermoFisher Catalog number: 4474778.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ion Plus Fragment Library Kit</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>4471252</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ion One Touch ES</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>8441-22</td>
			<td>ThermoFisher Catalog number: 4469495. Extended kit component in Sheet 5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>51976</td>
			<td>This can be replaced by any brand&#39;s molecular grade absolute ethanol.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PicoPLEX WGA Extraction enzyme dilution buffer</td>
			<td>Rubicon Genomics</td>
			<td>R30050</td>
			<td>This can be replaced by SurePlex DNA Amplification System,catalog number: PR-40-415101-01.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PicoPLEX WGA Extraction enzyme dilution buffer</td>
			<td>Rubicon Genomics</td>
			<td>R30050</td>
			<td>This can be replaced by SurePlex DNA Amplification System,catalog number: PR-40-415101-02.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit 3.0 Fluorometer</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>Q33216</td>
			<td>This model has been replaced by Qubit 4 Fluorometer, Catalog number: Q33226.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit ds DNA HS Assay kit</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>M2002-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit Assay Tubes</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>Q32856</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ion PI Foaming Solution</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A26772</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Index for barcoding of libraries</td>
			<td>BaseCare</td>
			<td></td>
			<td>this is a in-house prepared index. Users can buy commercial product from ThermoFisher Ion Xpress Barcode Adapters Kits (Cat. No. 4474517)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ion PI Loading Buffer</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A26772</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solid(TM) Buffer Kit-1X Low TE Buffer</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>4389764</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agencour AMPure XP Kit</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A63880</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DynaMag-2 magnet (magnetic rack)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>12321D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ion PI Master Mix PCR buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall Legend Micro 17 Microcentrifuge</td>
			<td>Micro 17</td>
			<td>75002430</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ion Plus Fragment Library Kit</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>4471252</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-free water</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td><a href="https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/AM9922">AM9922</a></td>
			<td>This can be replaced by other brand.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PicoPLEX WGA Nuclease-free water</td>
			<td>Rubicon Genomics</td>
			<td>R30050</td>
			<td>This can be replaced by SurePlex DNA Amplification System,catalog number: PR-40-415101-03.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ion OneTouch Oil bottle</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Ion PI Hi&#8209;Q OT2 Solutions 200 (Part No. A26429). Extended kit component in Sheet 5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ion Plus Fragment Library Kit</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>4471252</td>
			<td>Extended kit component in Sheet 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>double-strand DNA standard</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>This is a in-house prepared DNA standard for calibration of Qubit before quantification of library.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PicoPLEX WGA Preamplification buffer</td>
			<td>Rubicon Genomics</td>
			<td>R30050</td>
			<td>This can be replaced by SurePlex DNA Amplification System,catalog number: PR-40-415101-03.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PicoPLEX WGA Preamplification enzyme</td>
			<td>Rubicon Genomics</td>
			<td>R30050</td>
			<td>This can be replaced by SurePlex DNA Amplification System,catalog number: PR-40-415101-03.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Library Amplification Primer Mix</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>4471252</td>
			<td>Extended kit component in Sheet 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ion OneTouch Reaction Filter</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Extended kit component in Sheet 5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recovery Router</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Extended kit component in Sheet 5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recovery Tubes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Extended kit component in Sheet 5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ISP Resuspension Solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ion Proton</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>DA8600</td>
			<td>This model is imported by Da An Gene Co.,LTD. of Sun Yat-Sen University from ThermoFisher and has been certified by China Food and Drug Administration for clinical application. The catalog number in ThermoFisher is 4476610.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ion PI Hi&#8209;Q Sequencing Polymerase</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A26772</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ion PI Sequencing Primer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>server for sequencer</td>
			<td>Lenovo</td>
			<td>T260</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ion PI Sphere Particles</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platinum PCR SuperMix High Fidelity</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>4471252</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nalgene 25mm Syringe Filters</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>724-2045</td>
			<td>Pore size: 0.45&#956;m. Specifically for aqueous fluids.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ion PI Hi&#8209;Q W2 Solution</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A26772</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ion PI 1X W3 Solution</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A26772</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ion OneTouch Wash Solution C1</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>The Ion PGM Hi&#8209;Q View Sequencing Kit</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A30044</td>
			<td>Extended kit component in Sheet 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ion Plus Fragment Library Kit</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>4471252</td>
			<td>Extended kit component in Sheet 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ion PI Hi-Q Sequencing 200 Kit (1 sequencing run per initialization)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A26772</td>
			<td>Extended kit component in Sheet 4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ion PI Hi&#8209;Q OT2 200 Kit</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A26434</td>
			<td>Extended kit component in Sheet 5</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

semiconductor sequencing for preimplantation genetic testing for aneuploidy

O aneuploidy cromossomático, uma das causas principais que conduzem à apreensão embrionária do desenvolvimento, à falha da implantação, ou à perda da gravidez, foi poço-documentado em embriões humanos. O teste genético pré-implante para aneuploidia (PGT-A) é um teste genético que melhora significativamente os desfechos reprodutivos detectando anormalidades cromossômicas de embriões. O sequenciamento de próxima geração (NGS) fornece uma abordagem de alta taxa de transferência e custo-benefício para análise genética e demonstrou aplicabilidade clínica na PGT-A. Aqui, apresentamos um método de NGS baseado em sequenciamento de semicondutores rápido e de baixo custo para a triagem de aneuploidia em embriões. A primeira etapa do fluxo de trabalho é a amplificação total do genoma (WGA) do espécime biópsia do embrião, seguida pela construção da biblioteca de sequenciamento, e seqüenciamento subseqüente no sistema de sequenciamento de semicondutores. Geralmente, para um aplicativo PGT-A, 24 amostras podem ser carregadas e sequenciadas em cada chip gerando 60 − 80 milhões de leituras em um comprimento médio de leitura de 150 pares de base. O método fornece um protocolo refinado para executar a amplificação do modelo e o enriquecimento da biblioteca de sequenciamento, tornando a detecção de PGT-A reprodutível, alta taxa de transferência, econômica e timesaving. O tempo de funcionamento deste sequenciador de semicondutores é de apenas 2 − 4 horas, encurtando o tempo de resposta de receber amostras para emitir relatórios em 5 dias. Todas estas vantagens fazem deste ensaio um método ideal para detectar aneuploidias cromossomáticos de embriões e, assim, facilitar a sua ampla aplicação em PGT-A.

Com base neste protocolo modificado, a plataforma de sequenciamento de semicondutores foi pela primeira vez, aplicada para PGT-A. Nós testamos em biópsias dos blastômeros da clivagem-fase e dos embriões do Blastocyst-estágio. Sugere-se que as pilhas biópsia submetem-se a WGA o mais cedo possível para impedir toda a degradação do ADN. Um estudo precedente comparou o desempenho de métodos diferentes de WGA e indicou que o método que nós descrevemos aqui teve a melhor uniformidad...

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Semiconductor Sequencing for Preimplantation Genetic Testing for Aneuploidy

Aqui, apresentamos um método de sequenciamento de semicondutores para teste genético pré-implante para aneuploidia (PGT-A) com as vantagens de tempo de resposta curto, baixo custo e alta taxa de transferência.

Sequenciamento de semicondutores para teste genético pré-implante para aneuploidia

Chromosomal aneuploidy, one of the main causes leading to embryonic development arrest, implantation failure, or pregnancy loss, has been well documented ...

O protocolo que apresentamos aqui é um semicondutor rápido e de baixo custo, métodos baseados em sequenciamento para triagem de aneuploidia em embriões. O protocolo refinado para a realização da amplificação do modelo e os arranjos da biblioteca de sequenciamento torna a detecção PGTA reproduzível, de alto rendimento, econômica e de economia de tempo. O tempo de execução deste sequenciador semi-condutor é de apenas duas a quatro horas.Encurtando o tempo de retorno do recebimento de amostras para a emissão de relatórios em cinco dias. Este método fornece sequenciamento de genoma para triagem de aneuploide, variação de número de cópia e chamadas de polimorfismo de nucleotídeos únicos. Devido a diferentes químicas de sequenciamento, a biblioteca preparada por este protocolo não pode ser sequenciada diretamente em outros sistemas de sequenciamento.Mas o mesmo sequenciador, mas diferente preparação da biblioteca, é capaz de fazer triagem pré-natal não invasiva. Demonstrando o procedimento será Xiangchun Guo, um técnico do nosso laboratório. Para começar o sequenciamento, vórtice cada biblioteca diluída e gire brevemente quatro vezes na mini centrífuga por três segundos cada vez.Em seguida, pegue cinco microliters de cada biblioteca, para se juntar ao tubo sem núcleo, um ponto cinco mililitros. Vórtice a biblioteca mista e gire brevemente em uma mini centrífuga por três segundos. Adicione 150 microliters da solução de quebra, a dois novos tubos de recuperação.Instale os novos tubos de recuperação, o roteador de recuperação e a placa de amplificação. Misture invertendo a garrafa de óleo três vezes. Certifique-se de que tanto a solução de óleo quanto a solução de recuperação estão pelo menos dois terços cheios.Vortex o buffer mestre mix PCR por 30 segundos e gire brevemente em uma mini centrífuga por três segundos. Vórtice as partículas da esfera e a biblioteca mista por um minuto e giro brevemente em uma mini centrífuga por três segundos. Em seguida, prepare uma mistura de ligadura de 2400 microlitres, adicionando 172 microliters de água sem nuclease, oito microliters da biblioteca mista, 120 microliters da mistura enzimática, e 100 microliters das partículas da esfera, ao tubo contendo 2000 microliters do buffer de mix principal PCR.Coloque uma pipeta em 800 microliters e carregue a mistura de ligadura ao filtro de reação através da porta da amostra. Inverta a garrafa de óleo três vezes e use uma pipeta P1000 para adicionar 200 microliters do óleo de reação ao filtro de reação. Selecione o proton do programa e selecione o botão assistido, para garantir que o dispositivo tenha sido configurado corretamente, seguindo as instruções no monitor.Em seguida, clique em "Em seguida, para iniciar o programa". Carregue 100 microliters da amostra do produto PCR emulsion, 130 microliters das contas lavadas, 300 microliters da solução de lavagem ES e 300 microliters da solução de derretimento na tira de oito tubos. Coloque a tira de oito tubos no sistema de enriquecimento.Instale uma ponta de pipeta e um novo tubo zero ponto dois mililitros e inicie o programa. Centrifugar o tubo zero ponto dois mililitros a 15.500 vezes G durante cinco minutos. Descarte o supernatante e mantenha dez microliters do produto de enriquecimento.Adicione 200 microliters de água sem nuclease ao tubo e misture por vórtice. Centrifugar o tubo zero ponto dois mililitro novamente. Descarte o supernatante e mantenha 10 microliters do produto de enriquecimento.Adicione 90 microliters de água sem nuclease ao tubo e misture por vórtice. Para preparar o modelo, vórtice o controle positivo e girar brevemente. Adicione cinco microliters do controle positivo a 100 microliters do produto de enriquecimento.Vórtice e centrífuga a 15.500 vezes G por cinco minutos. Descarte o supernatante e mantenha 10 microliters do modelo. Em seguida, adicione 20 microliters do primer de sequenciamento e 15 microliters do tampão de ressarcimento ao tubo de modelo.Vórtice do tubo e gire brevemente em uma mini centrífuga por três segundos. Incubar o tubo em um cicloviário térmico com uma tampa aquecida. Em seguida, adicione 10 microliters do tampão de carga ao tubo.Misture por pipetting para cima e para baixo. Misture os 55 microliters da amostra por tubulação para cima e para baixo e carregue a amostra para o poço de carregamento do chip. Mantenha a ponta de pipeta usada e o tubo PCR de dois mililitros de ponto zero.Coloque o chip na mini centrífuga do chip quando alguma amostra entrar no chip. Verifique a posição e centrifufique o chip por 10 minutos. Prepare 50% de tampão de enraizamento adicionando 500 microliters de tampão de ressarcimento e 500 microliters de água sem nuclease em um tubo de um ponto cinco mililitros.Prepare a solução de descarga, adicionando 500 microliters de tampão de ressarcimento e 500 microliters de 100%2-propanol em um tubo de um ponto e cinco mililitros. Em seguida, prepare a mistura de espuma, adicionando 49 microlitadores do buffer de 50% de enraizamento e um microliter da solução de espuma para dois novos tubos de um ponto cinco mililitros. Pipeta ar em uma das misturas de espuma, e carregar 120 microliters das bolhas no poço de carregamento.Transfira o líquido expelido excessivo da saída bem para o poço de carregamento, e centrifugar o chip por 30 segundos na mini centrífuga do chip. Repita o processo para a segunda mistura de espuma. Adicione 55 microliters do buffer de 50% de ressarcimento ao tubo mantido em ponto zero dois mililitros.Use a ponta de pipeta mantida para pipeta para cima e para baixo. Carregue todos os 55 microliters do tampão de ressarcimento até o poço de carregamento. Centrifugar o chip por 30 segundos na mini centrífuga de chip designada.Carregue 100 microliters da solução de descarga no poço de carregamento do chip e descarte o líquido expelido do poço de saída. Repita esta etapa de carregamento uma vez. Carregue 100 microliters do buffer de 50%, no poço de carregamento do chip.Repita esta etapa de carregamento para um total de três vezes. Adicione 60 microliters do buffer de 50% de enraizamento e seis microliters da enzima sequenciamento em um novo tubo de cinco mililitros de um ponto. Misture por pipetting para cima e para baixo.Pipeta lentamente 65 microliters desta solução mista no poço de carregamento do chip, evitando bolhas. Mantenha o chip longe da luz e incubar em temperatura ambiente por cinco minutos. Finalmente, após a incubação, carregue imediatamente o chip no sequenciador e clique em Iniciar a Sequência de Execução na tela para iniciar o sequenciamento.Uma análise estatística retrospectiva em 186 estágio de decote e 1135 embriões de estágio blastocisto resultou em taxas de sucesso de mais de 95% de WGA em ambos os tipos de amostras. As taxas de falha de controle de qualidade de sequenciamento foram de 3,4% no grupo de estágio de decote e apenas 1,9% no grupo de estágio blastocisto. Além da aneuploidia, os dados de sequenciamento podem ser usados para outras análises.Por exemplo, copiam variações numénicas com um tamanho inferior a cinco megabase, ou análise de DNA mycondrial, dependendo da profundidade e qualidade do sequenciamento. Com a melhoria na chamada do número de cópias, os pesquisadores podem investigar ainda mais o futuro do mosaico cromossômico em embriões em estágio inicial humano.

Research

JoVE Journal

Genetics

Methyl-binding DNA capture Sequencing for Patient Tissues

Sequenciamento de captura de DNA de ligação de metilo em tecidos de pacientes

Methylation is one of the essential epigenetic modifications to the DNA, which is responsible for the precise regulation of genes required for stable ...

Genética

Detection of Copy Number Alterations Using Single Cell Sequencing

Detecção de Copy Number Alterações Usando Sequencing única célula

Detection of genomic changes at single cell resolution is important for characterizing genetic heterogeneity and evolution in normal tissues, cancers, and ...

Generation of Native Chromatin Immunoprecipitation Sequencing Libraries for Nucleosome Density Analysis

Geração de imunoprecipitação da cromatina nativa sequenciamento de bibliotecas para análise da densidade nucleossoma

We present a modified native chromatin immunoprecipitation sequencing (ChIP-seq) experimental protocol compatible with a Gaussian mixture distribution ...

Targeted Next-generation Sequencing and Bioinformatics Pipeline to Evaluate Genetic Determinants of Constitutional Disease

Sequenciamento de nova geração direcionado e fluxo de análises de bioinformática para avaliar determinantes genéticos de doenças constitucionais

Next-generation sequencing (NGS) is quickly revolutionizing how research into the genetic determinants of constitutional disease is performed. The ...

Rare Event Detection Using Error-corrected DNA and RNA Sequencing

Deteção de evento raro usando o DNA de correção de erro e a sequenciação do ARN

Conventional next-generation sequencing techniques (NGS) have allowed for immense genomic characterization for over a decade. Specifically, NGS has been ...

Ultralow Input Genome Sequencing Library Preparation from a Single Tardigrade Specimen

Ultralow genoma entrada biblioteca preparação de um único espécime Tardigrade de sequenciamento

Tardigrades are microscopic animals that enter an ametabolic state called anhydrobiosis when facing desiccation and can return to their original state ...

Amplification of Near Full-length HIV-1 Proviruses for Next-Generation Sequencing

Amplificação de perto completos provírus HIV-1 para a próxima geração de sequenciamento

The Full-Length Individual Proviral Sequencing (FLIPS) assay is an efficient and high-throughput method designed to amplify and sequence single, near ...

A Deep-sequencing-assisted, Spontaneous Suppressor Screen in the Fission Yeast Schizosaccharomyces pombe

A Deep-sequencing-assisted, Spontaneous Suppressor Screen in the Fission Yeast Schizosaccharomyces pombe

Uma tela de supressor de Deep-sequenciamento-assistida, espontânea na fissão levedura Schizosaccharomyces pombe

A genetic screen for mutant alleles that suppress phenotypic defects caused by a mutation is a powerful approach to identify genes that belong to closely ...

Pooled CRISPR-Based Genetic Screens in Mammalian Cells

Telas genéticas com base em CRISPR agrupadas em células de mamíferos

Genome editing using the CRISPR-Cas system has vastly advanced the ability to precisely edit the genomes of various organisms. In the context of mammalian ...

Universal and Efficient Electroporation Protocol for Genetic Engineering of Gastrointestinal Organoids

Protocolo universal e eficiente de eletroporação para Engenharia Genética de Organoides Gastrointestinais

Electroporation is a common method for transfection with different kinds of molecules by electrical permeabilization of the plasma membrane. With the ...