Name: in vitro tumor cell rechallenge for predictive evaluation of chimeric antigen receptor t cell antitumor function
Uploaded: 2019-02-27T15:00:00
Duration: 8 min 4 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Tumor Cell Rechallenge For Predictive Evaluation of Chimeric Antigen Receptor T Cell Antitumor Function at JoVE.com

Dette arbejde blev støttet af tilskud fra California Institute for regenerativ medicin (CIRM) grant TR3-05641 og NIH tilskud P30 CA33572 (kerner). DW er støttet af NCI stipendium 1F99CA234923-01.

Vores IRB kræver ikke revision af denne protokol. Vi modtager kasserede frisk glioblastom tumor prøver fra den by af håb patologi afdeling, der er kodet, og vores laboratorium kan ikke få adgang til nøglen. Vi modtager prøver med data kun på forudgående behandling og sygdom tilstand på tidspunktet for biopsi/resektion, uden identificerende data.
1. medier forberedelse
<ol><li>Forberede neurale stamceller medie til dyrkning af primære GBM cellelinjer: DMEM:F12, 1:50 B27, 5 µg/mL heparin og 2 mmol/L L-glutamin; suppleret med 20 ng/mL epidermal vækstfaktor (EGF) og 20 ng/mL basic fibroblast vækstfaktor (FGF) to gange om ugen (Se Tabel af materialer).</li>
	<li>Forberede T-celle medier: X-VIVO 15 indeholder 10% føtalt kalveserum (FCS); suppleret med 70 IU/mL rhIL-2 og 0,5 ng/mL rhIL-15 hver 48 h (Se Tabel af materialer).</li>
	<li>Forberede fælles Kulturmedier: tage neurale stamceller medier uden EGF og FGF supplement, og tilføje 10% FCS.</li>
	<li>Forberede FACS farvning løsning (FSS): HBSS, 2% FCS, NaN3 (0,5 g/500 mL).</li>
</ol>2. forberedelse af GBM tumorceller
<ol><li>Høste lav-passage GBM tumor kugler (TSs) ved centrifugering ved 300 x g i 4 min og kassér supernatanten. Bemærk: GBM tumor kugler (TSs) er genereret fra resektion tumorer som tidligere beskrevet22,23,24, og vedligeholdt i neurale stamceller media, i væksthuse med 5% CO2 ved 37 ° C.</li>
	<li>Pre varme Co Kulturmedier i et 37 ° C vandbad.</li>
	<li>Der tilsættes 1 mL af kolde accutase til GBM TSs, adskille TSs af pipettering for 30-60 s, og stoppe dissociation ved tilsætning af 5 mL varm Co kultur medier. Bemærk: GBM TSs bør ikke holdes på accutase for mere end 5 min.</li>
	<li>Høste GBM celler ved centrifugering ved 300 x g i 4 min og kassér supernatanten resuspend celler i 2 mL af co dyrkningsmedier.</li>
	<li>Bestemmelse af celle koncentration ved hjælp af en celle levedygtighed counter. Bemærk: Cellernes levedygtighed skal være > 70%.</li>
</ol>3. forberedelse af bil T celler
<ol><li>Mindre end 24 timer før analysen, tage 100 µL af kulturperler bil T celler ind i et flow flowcytometri rør og der tilsættes 2 mL af FSS. Bemærk: BIL T celler blev genereret som tidligere beskrevet11,21 og kulturperler i T-celle medier.</li>
	<li>Centrifugering ved 300 x g i 4 min og Fjern supernatanten.</li>
	<li>Der tilsættes 2 mL af FSS at vaske cellerne, der centrifugeres ved 300 x g i 4 min, og kassér supernatanten.</li>
	<li>Pletten celler med passende antistof til at angive bilen udtryk ved 4 ° C i 30 min. Bemærk: For eksempel, hvis en IL13Rα2-målrettet bil beskrevet tidligere25 bruges, derefter pletten med anti-IL13 antistoffer.</li>
	<li>Vaskes to gange med 2 mL af FSS og analysere bil exn ved hjælp af en flow Flowcytometret.</li>
	<li>Bestemme, bil % på T celler ved hjælp af gating strategien vist i figur 1B.</li>
	<li>På dagen for fælles kultur, høste alle bil T celler ved centrifugering ved 300 x g i 4 min, kassere supernatanten og resuspend celler i 2 mL af co dyrkningsmedier.</li>
	<li>Bestemmelse af celle koncentration ved hjælp af en celle levedygtighed counter. Bemærk: Cellernes levedygtighed skal være > 70%.</li>
</ol>4. sæt op tumor — T-celle Co kultur
<ol><li>Fortynd tumorceller til en koncentration på 0,16 mio/mL med fælles Kulturmedier.</li>
	<li>Baseret på bil %, fortyndes bil T celler til en koncentration på 0,04 mio bil+ celler/mL med fælles Kulturmedier. Bemærk: For eksempel, hvis bilen er 50% og T-celle koncentration er 0,4 mio/mL, derefter foretage en 1:5 fortynding til at få den endelige koncentration af 0,04 mio bil+ celler/mL.</li>
	<li>Der afpipetteres 100 µL fortyndede tumor celler i hver brønd med en 96-godt flad bund vævskultur plade.</li>
	<li>Der afpipetteres 100 µL fortyndede bil T celler i hver brønd, der indeholder tumorceller og bland godt. Bemærk: Hver tumor-T celle Co kultur vil blive analyseret ved 4 tiden point. 4-6 gentagelser kan være påkrævet ved hver gang punkt baseret på forskellige analyse, men < 3 gentagelser pr. tidspunkt anbefales ikke; Se tabel 1 for en repræsentativ platemap.</li>
	<li>Fastholde pladen i et 37 ° C, 5% CO2 inkubator.</li>
</ol>5. tumor celle Rechallenge
Bemærk: Rechallenge finder sted på 2, 4 og 6 dage post den første fælles kultur setup (figur 1A).
<ol><li>Høst og adskille GBM TSs, som beskrevet ovenfor (trin 2.1-2.6).</li>
	<li>Resuspend GBM celler i en koncentration på 0,64 mio/mL.</li>
	<li>Bestemme fælles kultur brønde, der har brug for rechallenge (Se tabel 1), og fjern forsigtigt 50 µL medier fra toppen af hver brønd.</li>
	<li>Tilsæt 50 µL af GBM cellesuspension i hver brønd og bland godt, og derefter sætte pladen tilbage i et 37 ° C, 5% CO2 inkubator.</li>
</ol>6. høst prøver og Flow Cytometric analyse
Bemærk: Prøver vil blive høstet på 1, 3, 5 og 7 dage post den første fælles kultur setup, med 1, 2, 3 og 4 runder af tumor udfordring, henholdsvis.
<ol><li>Pre varm 0,05% trypsin-EDTA-oploesning i 37 ° C vandbad.</li>
	<li>Bestemme de brønde, der har brug for høst og overføre medier ind i en ny runde 96-brønd bundplade.</li>
	<li>Tilsæt 50 µL af trypsin-EDTA i brønd til at fordøje resterende tumorceller ved 37 ° C i 5 min.</li>
	<li>Under et mikroskop, bekræfte cellerne har løsrevet fra bunden.</li>
	<li>Der afpipetteres rundt i nå bunden til resuspend fritliggende celler og derefter overføre trypsin-EDTA fritliggende celler til de tilsvarende huller i 96-brønd runde-bundplade.</li>
	<li>Centrifuge runde-96-brønd bundpladen på 300 x g, 4 ° C i 4 min, så kassér supernatanten.</li>
	<li>Tilføje 200 µL/brønd af FSS at vaske cellerne, centrifuge på 300 x g, 4 ° C i 4 min, så kassér supernatanten.</li>
	<li>Resuspend celler i 100 µL/brønd FSS indeholder antistoffer (Se Tabel af materialer), og pletten celler ved 4 ° C i 30 min.</li>
	<li>Tilsæt 100 µL/brønd FSS til celler, centrifugeres ved 300 x g, 4 ° C i 4 min, så Fjern supernatanten.</li>
	<li>Tilføje 200 µL/brønd af FSS at vaske cellerne, centrifuge på 300 x g, 4 ° C i 4 min, så kassér supernatanten.</li>
	<li>Resuspend celler med 100-200 µL/brønd af FSS med 500 ng/mL DAPI, derefter analysere prøver ved flowcytometri.</li>
</ol>7. funktionelle og Phen Otypic analyse af bil T celler
<ol><li>Hente datafiler fra flow forskellige og gate alle live (DAPI-) celler (figur 1C).</li>
	<li>Kvantificere tumorceller af gating CD45- befolkning og bil T celler ved gating CD45+, bil + befolkning (figur 1C). Bemærk: Hvis tumorcellerne udtrykker CD45 (fx Raji lymfom celler), anti-CD3 farvning kan bruges til at differentiere T celler fra tumorceller.</li>
	<li>Plot tumor celle og bil T celle nummer gennem tid kurset.</li>
	<li>Identificere T-celle aktivering af fælles udtryk for 4-1BB og CD69. Bemærk: Disse celleoverflademarkører kan bruges til at analysere T-celle aktivering 6-24 h indlæg oprindelige fælles kultur.</li>
	<li>Identificere T-celle udmattelse ved ekspression af PD-1, LAG-3 og TIM-3.</li>
	<li>Identificere T-celle Hukommelsesstatus af udtryk for CD45RO og CD62L.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Porter, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chimeric+antigen+receptor+T+cells+persist+and+induce+sustained+remissions+in+relapsed+refractory+chronic+lymphocytic+leukemia.">Chimeric antigen receptor T cells persist and induce sustained remissions in relapsed refractory chronic lymphocytic leukemia.</a> Science Translational Medicine. 7 (303), (2015).</li><li>Brentjens, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD19-targeted+T+cells+rapidly+induce+molecular+remissions+in+adults+with+chemotherapy-refractory+acute+lymphoblastic+leukemia.">CD19-targeted T cells rapidly induce molecular remissions in adults with chemotherapy-refractory acute lymphoblastic leukemia.</a> Science Translational Medicine. 5 (177), (2013).</li><li>Grupp, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chimeric+antigen+receptor-modified+T+cells+for+acute+lymphoid+leukemia.">Chimeric antigen receptor-modified T cells for acute lymphoid leukemia.</a> The New England Journal of Medicine. 368 (16), 1509-1518 (2013).</li><li>Lee, D. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cells+expressing+CD19+chimeric+antigen+receptors+for+acute+lymphoblastic+leukaemia+in+children+and+young+adults:+a+phase+1+dose-escalation+trial.">T cells expressing CD19 chimeric antigen receptors for acute lymphoblastic leukaemia in children and young adults: a phase 1 dose-escalation trial.</a> The Lancet. 385 (9967), 517-528 (2015).</li><li>Yong, C. S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CAR+T-cell+therapy+of+solid+tumors.">CAR T-cell therapy of solid tumors.</a> Immunology and Cell Biology. 95 (4), 356-363 (2017).</li><li>Barrett, D. M., Singh, N., Porter, D. L., Grupp, S. A., June, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chimeric+antigen+receptor+therapy+for+cancer.">Chimeric antigen receptor therapy for cancer.</a> Annual Review of Medicine. 65, 333-347 (2014).</li><li>Priceman, S. J., Forman, S. J., Brown, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Smart+CARs+engineered+for+cancer+immunotherapy.">Smart CARs engineered for cancer immunotherapy.</a> Current Opinion in Oncology. 27 (6), 466-474 (2015).</li><li>Fesnak, A. D., June, C. H., Levine, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineered+T+cells:+the+promise+and+challenges+of+cancer+immunotherapy.">Engineered T cells: the promise and challenges of cancer immunotherapy.</a> Nature Reviews Cancer. 16 (9), 566-581 (2016).</li><li>Esensten, J. H., Bluestone, J. A., Lim, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+Therapeutic+T+Cells:+From+Synthetic+Biology+to+Clinical+Trials.">Engineering Therapeutic T Cells: From Synthetic Biology to Clinical Trials.</a> Annual Review of Pathology. 12, 305-330 (2017).</li><li>Lim, W. A., June, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Principles+of+Engineering+Immune+Cells+to+Treat+Cancer.">The Principles of Engineering Immune Cells to Treat Cancer.</a> Cell. 168 (4), 724-740 (2017).</li><li>Brown, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+IL13Ralpha2-Targeted+Chimeric+Antigen+Receptor+T+Cells+for+Improved+Anti-tumor+Efficacy+against+Glioblastoma.">Optimization of IL13Ralpha2-Targeted Chimeric Antigen Receptor T Cells for Improved Anti-tumor Efficacy against Glioblastoma.</a> Molecular Therapy. , (2017).</li><li>Long, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=4-1BB+costimulation+ameliorates+T+cell+exhaustion+induced+by+tonic+signaling+of+chimeric+antigen+receptors.">4-1BB costimulation ameliorates T cell exhaustion induced by tonic signaling of chimeric antigen receptors.</a> Nature Medicine. 21 (6), 581-590 (2015).</li><li>Cherkassky, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+CAR+T+cells+with+cell-intrinsic+PD-1+checkpoint+blockade+resist+tumor-mediated+inhibition.">Human CAR T cells with cell-intrinsic PD-1 checkpoint blockade resist tumor-mediated inhibition.</a> The Journal of Clinical Investigation. 126 (8), 3130-3144 (2016).</li><li>Priceman, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Co-stimulatory+signaling+determines+tumor+antigen+sensitivity+and+persistence+of+CAR+T+cells+targeting+PSCA++metastatic+prostate+cancer.">Co-stimulatory signaling determines tumor antigen sensitivity and persistence of CAR T cells targeting PSCA+ metastatic prostate cancer.</a> Oncoimmunology. 7 (2), 1380764 (2018).</li><li>Eyquem, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+a+CAR+to+the+TRAC+locus+with+CRISPR/Cas9+enhances+tumour+rejection.">Targeting a CAR to the TRAC locus with CRISPR/Cas9 enhances tumour rejection.</a> Nature. 543 (7643), 113-117 (2017).</li><li>Gattinoni, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acquisition+of+full+effector+function+in+vitro+paradoxically+impairs+the+in+vivo+antitumor+efficacy+of+adoptively+transferred+CD8++T+cells.">Acquisition of full effector function in vitro paradoxically impairs the in vivo antitumor efficacy of adoptively transferred CD8+ T cells.</a> The Journal of Clinical Investigation. 115 (6), 1616-1626 (2005).</li><li>Malandro, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonal+Abundance+of+Tumor-Specific+CD4(+)+T+Cells+Potentiates+Efficacy+and+Alters+Susceptibility+to+Exhaustion.">Clonal Abundance of Tumor-Specific CD4(+) T Cells Potentiates Efficacy and Alters Susceptibility to Exhaustion.</a> Immunity. 44 (1), 179-193 (2016).</li><li>Gattinoni, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt+signaling+arrests+effector+T+cell+differentiation+and+generates+CD8++memory+stem+cells.">Wnt signaling arrests effector T cell differentiation and generates CD8+ memory stem cells.</a> Nature Medicine. 15 (7), 808-813 (2009).</li><li>Klebanoff, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Central+memory+self/tumor-reactive+CD8++T+cells+confer+superior+antitumor+immunity+compared+with+effector+memory+T+cells.">Central memory self/tumor-reactive CD8+ T cells confer superior antitumor immunity compared with effector memory T cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (27), 9571-9576 (2005).</li><li>Gattinoni, L., Klebanoff, C. A., Restifo, N. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paths+to+stemness:+building+the+ultimate+antitumour+T+cell.">Paths to stemness: building the ultimate antitumour T cell.</a> Nature Reviews Cancer. 12 (10), 671-684 (2012).</li><li>Wang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glioblastoma-targeted+CD4++CAR+T+cells+mediate+superior+antitumor+activity.">Glioblastoma-targeted CD4+ CAR T cells mediate superior antitumor activity.</a> JCI Insight. 3 (10), (2018).</li><li>Kahlon, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+recognition+and+killing+of+glioblastoma+multiforme+by+interleukin+13-zetakine+redirected+cytolytic+T+cells.">Specific recognition and killing of glioblastoma multiforme by interleukin 13-zetakine redirected cytolytic T cells.</a> Cancer Research. 64 (24), 9160-9166 (2004).</li><li>Brown, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recognition+and+killing+of+brain+tumor+stem-like+initiating+cells+by+CD8++cytolytic+T+cells.">Recognition and killing of brain tumor stem-like initiating cells by CD8+ cytolytic T cells.</a> Cancer Research. 69 (23), 8886-8893 (2009).</li><li>Lee, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+stem+cells+derived+from+glioblastomas+cultured+in+bFGF+and+EGF+more+closely+mirror+the+phenotype+and+genotype+of+primary+tumors+than+do+serum-cultured+cell+lines.">Tumor stem cells derived from glioblastomas cultured in bFGF and EGF more closely mirror the phenotype and genotype of primary tumors than do serum-cultured cell lines.</a> Cancer Cell. 9 (5), 391-403 (2006).</li><li>Brown, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regression+of+Glioblastoma+after+Chimeric+Antigen+Receptor+T-Cell+Therapy.">Regression of Glioblastoma after Chimeric Antigen Receptor T-Cell Therapy.</a> The New England Journal of Medicine. 375 (26), 2561-2569 (2016).</li><li>Salter, A. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphoproteomic+analysis+of+chimeric+antigen+receptor+signaling+reveals+kinetic+and+quantitative+differences+that+affect+cell+function.">Phosphoproteomic analysis of chimeric antigen receptor signaling reveals kinetic and quantitative differences that affect cell function.</a> Science Signaling. 11 (544), (2018).</li><li>Rossi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preinfusion+polyfunctional+anti-CD19+chimeric+antigen+receptor+T+cells+are+associated+with+clinical+outcomes+in+NHL.">Preinfusion polyfunctional anti-CD19 chimeric antigen receptor T cells are associated with clinical outcomes in NHL.</a> Blood. 132 (8), 804-814 (2018).</li><li>Garcia-Diaz, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interferon+Receptor+Signaling+Pathways+Regulating+PD-L1+and+PD-L2+Expression.">Interferon Receptor Signaling Pathways Regulating PD-L1 and PD-L2 Expression.</a> Cell Reports. 19 (6), 1189-1201 (2017).</li><li>Walker, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+Antigen+and+Receptor+Densities+Regulate+Efficacy+of+a+Chimeric+Antigen+Receptor+Targeting+Anaplastic+Lymphoma+Kinase.">Tumor Antigen and Receptor Densities Regulate Efficacy of a Chimeric Antigen Receptor Targeting Anaplastic Lymphoma Kinase.</a> Molecular Therapy. 25 (9), 2189-2201 (2017).</li><li>Fraietta, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determinants+of+response+and+resistance+to+CD19+chimeric+antigen+receptor+(CAR)+T+cell+therapy+of+chronic+lymphocytic+leukemia.">Determinants of response and resistance to CD19 chimeric antigen receptor (CAR) T cell therapy of chronic lymphocytic leukemia.</a> Nature Medicine. 24 (5), 563-571 (2018).</li><li>Fraietta, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disruption+of+TET2+promotes+the+therapeutic+efficacy+of+CD19-targeted+T+cells.">Disruption of TET2 promotes the therapeutic efficacy of CD19-targeted T cells.</a> Nature. 558 (7709), 307-312 (2018).</li></ol>

BIL konstruktion beskrevet i dette arbejde har fået licens af Mustang Bio., Inc., som S.J.F. og C.E.B. modtage royalty-betalinger. Alle andre forfattere erklære ingen potentielle interessekonflikter.

Denne gentagne tumor celle udfordring assay giver en praktisk tilgang til at vurdere bil T celle funktionelle styrke, ved hjælp af en in vitro-installation, der sammenfatter den høje tumor byrde forbundet med in vivo tumor modeller. Under denne 7-dages assay, bil T celler gennemgå fire runder af tumor udfordring (indledende Co kultur og 3 x rechallenge), at skabe et miljø, hvor udmattet T celler kan miste deres evne til at imødegå tumor trods en potent indledende svar. Tumor celle eliminering og bil T celle ekspansion udgør to grundlæggende udlæsninger, der kan erhverves fra dette assay, mens fænotyper af bil T celler kan let analyseres ved farvning overflade eller intracellulære koderne, der angiver T-celle aktivering, udmattelse og/eller hukommelse. Denne analyse er også praktisk at kombinere med ikke-partisk analyse af bil T celler transkriptom, proteom eller fosfor-proteomet21,26, og T-celle polyfunctionality, som er blevet vedtaget for at forudsige kliniske svar27. Derudover kan tumorceller også blive testet for deres adaptiv respons mod T-celle immunitet som cytokin sekretion28. Da prøver er høstet på flere tidspunkter, giver dette assay mulighed for ikke blot statiske, men også dynamisk analyse af bil T celle adfærd, når at reagere på overskydende antal tumorceller.
Analysen er særligt stærke i sammenligning effektor styrken af bil T-celler rettet mod det samme antigen, men med forskellige designs og/eller fremstillingsprocesser. Vi har brugt denne analyse til at identificere denne CD4+ bil T celler var i stand til at mægle superior langsigtet effector funktion end CD8+ celler21. Det viste sig også at in vivo bil effekten var korreleret med cytotoksicitet på senere tidspunkter (D5-D7) under dette assay, yderligere fremhæve nødvendigheden af at bruge gentagne tumor udfordring for in vitro-bil T celle evaluering. Selvom GBM celler blev brugt som eksempel på target-cellerne her, kunne dette assay let vedtages en anden T-celle-tumor kombination. Navnlig, kan bil T celle adfærd også variere ved forskellige antigen tætheder og engineering kræftceller til at udtrykke forskellige niveauer af målrettede antigener leveres værktøjet at undersøge sekventielle molekylære begivenheder efter bil anerkendelse29. Denne analyse kan derfor også udnyttes til at undersøge aktivering mønster af visse bil T celler mod forskellige mål.
Da målet cellernes levedygtighed og bil T celle ekspansion er to upfront udlæsninger af denne analyse, er det afgørende, at alle Co kulturerne starter med levedygtige (> 70%) tumor og T-celler. Når du udfører rechallenge processerne, bør handlingen af sugning medier (trin 5.3) ikke forstyrre tumor og T-celler i bunden af brønde, for ikke at indføre unødvendige variationer af celler tæller. Når du udfører denne analyse på suspension target cellelinjer, anbefales det at høste resterende celler ved centrifugering før tumor celle rechallenge.
En begrænsning af denne analyse er at opsætningsparametre (E:T nøgletal for indledende Co kultur og rechallenge) skal justeres baseret på forskellige kombinationer af bil-tumor. For eksempel, hvis tumorcellerne udtrykker en betydelig grad af immuno-hæmmende molekyler (f.eks. PD-L1), en højere E:T ratio anbefales da samlet drab effektivitet er nedsat i forhold til PD-L1-lav tumorceller. Før du anvender analysen på ny bil-tumor kombinationer, en pilotundersøgelse er anbefalet til at bestemme de optimale betingelser, som normalt giver de mest potente bil T celler testet i analysen at fjerne > 80% af tumorceller ved slutpunktet. Da direkte celle-celle kontakt er nødvendig for bil T-celle-medieret drab, hvis tumorceller blev fluorescens-mærket, panelet af analysen af handelsstrømmen cytometric derefter skal justeres (f.eks. Hvis tumorceller var normal god landbrugspraksis-mærket, så alle FITC-konjugeret antistoffer bør ikke anvendes).
Den kliniske aktivitet af bil T celler mod B celle maligniteter har ført til to FDA-godkendt medicin. Svaret har imidlertid vist stor variation på tværs af forskellige patienter27,30,31, der blev belyst til at korrelere med bil produkter30fænotypiske egenskaber. Denne in vitro-gentagne tumor udfordring assay yderligere giver en tilgang til funktionelt teste bilen effektor potens fænotypiske beskrivelser og polyfunctionality cytokin produktion, og giver mulighed for højere overførselshastighed screening af kliniske produkter i forhold til in vivo tumor modeller samtidig bevare den prædiktive troskab. Samlet set kan denne analyse anvendes for T-celle funktionelle test for bil T celle design, prækliniske og kliniske udvikling.

Immunterapi ved hjælp af kimære antigen receptor (bil)-manipuleret T celler har set lovende resultater mod B celle maligniteter1,2,3,4, mens potentialet i rettet mod andre tumorer fortsætter med at være under nøje undersøgelse5,6,7. Har gjort store fremskridt til at optimere bilen konstruktion, fremstillingsprocessen og patienten før infusion regimer6,7,8, og romanen syntesebiologi tilgange forventes at øge deres persistens, sikkerhed og tumor specificitet9,10. Men det har været vanskelig og arbejdskrævende at passende vurdere bil T celler terapeutiske potentiale for at vejlede det bedste valg for kliniske oversættelse. De mest etablerede model hidtil for at evaluere bil T cellefunktion er i immundefekte mus med menneskelige tumor xenografts, hvorved bil T celler er undersøgt for antitumor effekt og sammenlignet ved titreret celle doser11,12 , 13 , 14 , 15. disse in vivo murine undersøgelser er arbejdskrævende og tidskrævende, især når screening stort antal parametre. Yderligere, in vivo undersøgelser kan fastholdes af adgangen til musen stammer, dyrs plejefaciliteter og dyr-håndtering teknikker. Derfor er der behov for at udvikle mere bekvem in vitro-assays giver mulighed for hurtig aflæsning af effektor aktivitet, som også trofast afspejler disse T-celler in vivo antitumor funktion.
Konventionelle metoder til at bestemme T celler in vitro celletoksicitet har fokuseret på påvisning af degranulering, cytokin produktion og evnen til at lyse radioisotop-mærket målceller (dvs. chrom release assays). Mens disse assays er informativ for at definere bil T celle specificitet og omdirigerede mål anerkendelse, undlader de ofte at afspejle in vivo antitumor potentiale manipuleret T celler12,13,16. I visse tilfælde, in vitro-viste drab aktivitet i kort sigt assays en invers korrelation med in vivo antitumor-funktionen16. Sådanne uoverensstemmelser er sandsynligvis et resultat af højt effektor: mål (E:T) nøgletal bruges i disse in vitro-assays, og derfor den manglende evne til at differentiere bil T celle produkter, der er udsat for konsumption17. Derimod under in vivo tumor udryddelse T reagerer celler normalt mod store tumor byrder, der derved kræver flere runder af drab og efterfølgende køre T-celle differentiering og udmattelse18,19, 20, som er en af de største barrierer mod effektiv tumor clearance af bil T celler12,13. I mellemtiden, mest kortsigtede in vitro-drab assays også gøre ikke udlæsning forskelle i T-celle spredning, boer i bil T celle behandlet patienter kapacitet for bil T celle ekspansion er stærkt korreleret med klinisk svar4. Således, den passende in vitro assay skulle sammenfatte betingelser af høj tumor byrde, induktion af T celle udmattelse, og giver mulighed for udlæsning af T celle ekspansion.
Her beskriver vi en strategi for at evaluere bil T celler for gentagne tumor drab potentiale, med en enkel in vitro-Co kultur assay. Forskellige T-celle effektor aktivitet parametre kan undersøges samtidigt, herunder target cell drab, bil T celle ekspansion og hukommelse - eller udmattelse-associerede fænotyper. De resultater, genereret fra dette assay korrelere godt med bil T-celler in vivo antitumor virkning og kan udnyttes til at vurdere styrken af bil T celle produkter. Mens vi beskrive en analyse for at vurdere IL13Ra2-målrettet bil T celler mod primære GBM linjer21, kan det let tilpasses til enhver bil T celle platform.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1084px;" width="1083">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:451px;">0.05% Trypsin/0.53mM EDTA in HBSS w/o Calcium and Magnesium</td>
			<td style="width:123px;">Corning</td>
			<td style="width:344px;">MT25051CI</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:451px;">1M Hepes</td>
			<td style="width:123px;">Irvine Scientific</td>
			<td style="width:344px;">9319</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:451px;">200 mM L-Glutamine</td>
			<td style="width:123px;">Cambrex Bio Science</td>
			<td style="width:344px;">17-605E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:451px;">4&#39;,6-diamidino-2-phenylindole, dihydrochloride (DAPI) - FluoroPure grade</td>
			<td style="width:123px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:344px;">D21490</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:451px;">Accutase</td>
			<td style="width:123px;">Innovative Cell Technologies</td>
			<td style="width:344px;">AT104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:451px;">Aldesleukin Proleukin (rhIL-2)</td>
			<td style="width:123px;">Novartis Oncology</td>
			<td style="width:344px;">NDC 0078-0495-61</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Anti-CD137, PE</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555956</td>
			<td>4B4-1</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Anti-CD19, PE-Cy7</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>557835</td>
			<td>SJ25C1</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Anti-CD3, PERCP</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>340663</td>
			<td>SK7</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Anti-CD4, FITC</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>340133</td>
			<td>SK3</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Anti-CD45, PERCP</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>340665</td>
			<td>2D1</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Anti-CD45RO, PE</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>561137</td>
			<td>UCHL1</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Anti-CD62L, APC</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>559772</td>
			<td>DREG-56</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Anti-CD69, APC</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>340560</td>
			<td>L78</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Anti-CD8, APC-Cy7</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>348793</td>
			<td>SK1</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Anti-IL-13, PE</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>340508</td>
			<td>JES10-5A2</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Anti-LAG-3, PE</td>
			<td>eBiosciences</td>
			<td>12-2239-41</td>
			<td>3DS223H</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Anti-PD-1, APC-Cy7</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>329921</td>
			<td>EH12.2H7</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Anti-TIM-3, APC</td>
			<td>eBiosciences</td>
			<td>17-3109-42</td>
			<td>F38-2E2</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:451px;">B-27 Serum-Free Supplement (50X)</td>
			<td style="width:123px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:344px;">17504-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:451px;">Corning 96 Well Clear Flat Bottom Polystyrene TC-Treated Microplates, Individually Wrapped, with Lid, Sterile (Product #3596)</td>
			<td style="width:123px;">Corning Life Sciences</td>
			<td style="width:344px;">3596</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:451px;">Defined fetal bovine serum,HI IR</td>
			<td style="width:123px;">Hyclone Labs</td>
			<td style="width:344px;">SH30070.03IH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:451px;">DMEM F-12 50:50 (1X) w/o Glutamine</td>
			<td style="width:123px;">MediaTech, Inc.</td>
			<td style="width:344px;">15-090-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:451px;">DMEM High Gluc w/o L-Glu, Na Pyr 1 L</td>
			<td style="width:123px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:344px;">11960051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:451px;">DMEM-Ham&#39;s F12 50:50 Mixture with L-glutamine and 15 mM HEPES</td>
			<td style="width:123px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:344px;">MT10092CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:451px;">HBSS</td>
			<td style="width:123px;">Irvine Scientific</td>
			<td style="width:344px;">9224</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:451px;">Heat-Inactivated FCS</td>
			<td style="width:123px;">Hyclone</td>
			<td style="width:344px;">SH30070.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:451px;">Heparin Sodium(1,000 U/ml)</td>
			<td style="width:123px;">American Pharmaceutical</td>
			<td style="width:344px;">401811B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:451px;">MACSQuant</td>
			<td style="width:123px;">Milteni Biotech Inc.</td>
			<td style="width:344px;">BIS013220&#160;</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PBS 1X W/CA &#38; MG</td>
			<td>Irvine Scientific</td>
			<td>9236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:451px;">PBS with 1MM EDTA (No Ca2+ or Mg2+)</td>
			<td style="width:123px;">VWR Scientific Products</td>
			<td style="width:344px;">PB15009A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:451px;">Recombinant human EGF</td>
			<td style="width:123px;">R&#38;D Systems</td>
			<td style="width:344px;">236-EG-200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:451px;">Recombinant human FGF</td>
			<td style="width:123px;">R&#38;D Systems</td>
			<td style="width:344px;">233-FB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:451px;">rhIL-15 Working Dilution (10 ng/&#181;L)</td>
			<td style="width:123px;">CellGenix, US Operations</td>
			<td style="width:344px;">tF0297</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="45">
			<td height="45" style="height:45px;width:451px;">Sodium Azide (NaN3)</td>
			<td style="width:123px;">Sigma</td>
			<td style="width:344px;">S8032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:451px;">Sorvall ST40R</td>
			<td style="width:123px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:344px;">41693700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:451px;">TC-HEPES BUFFER (1M) SOLN 100ML&#160;</td>
			<td style="width:123px;">IRVINE SCIENTIFIC CORP</td>
			<td style="width:344px;">6472</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:451px;">Tecnol Procedure Mask</td>
			<td style="width:123px;">Kimberly-Clark</td>
			<td style="width:344px;">47117</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:451px;">X-VIVO 15</td>
			<td style="width:123px;">Lonza</td>
			<td style="width:344px;">BW04-744Q</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro tumor cell rechallenge for predictive evaluation of chimeric antigen receptor t cell antitumor function

Feltet af kimære antigen receptor (bil) T-celleterapi skrider hurtigt med forbedring af bildesign, gen-engineering tilgange og produktions optimeringer. En udfordring for disse udviklingsbestræbelser, men har været oprettelsen af in vitro-assays, der kan håndfast informere udvælgelse af de optimale bil T celle produkter til in vivo terapeutiske succes. Standard in vitro-tumor-lysis assays undlader ofte at afspejle den sande antitumor potentiale af bil T-celler på grund af den relativt korte Co kultur tid og høj T-celle tumor forhold. Her, beskriver vi en in vitro-Co kultur metode til at vurdere bil T celle rekursive drab potentiale ved høj tumor celle belastning. I denne analyse, langsigtede cytotoksiske funktion og proliferativ kapacitet af bil T celler er undersøgt in vitro-over 7 dage med yderligere tumor mål gives til fælles kultur hver anden dag. Denne analyse kan være kombineret med profilering T-celle aktivering, udmattelse og hukommelse fænotyper. Ved hjælp af denne analyse, har vi med succes kendetegnet de funktionelle og fænotypiske forskelle mellem CD4+ og CD8+ bil T celler mod glioblastom (GBM) celler, som afspejler deres differential in vivo antitumor aktivitet i orthotopic xenograft modeller. Denne metode giver en letkøbt tilgang til at vurdere bil T celle potens og belyse de funktionelle forskelle på tværs af forskellige bil T celle produkter.

Brug analysen ovenfor beskrevne, vi har udmærkede differential effektor potens og dræbe dynamics medieret af CD4+ og CD8+ bil T celler. Resultaterne præsenteres her illustrere forskellen mellem CD4+ og CD8+ bil T celler, genereret fra en sund donor uafhængigt af vores tidligere publikation21.
Gennem en standard degranulering assay, kunne vi konstatere, at begge CD4+ og CD8+ bil T celler blev lige så aktiveret mod GBM celler, der udtrykker den målrettede antigen, som angivet ved udtrykket CD107a og intracellulære cytokin (Figur 2A). Dog bruger gentagne tumor udfordring assay, vi fandt, at CD4+ men ikke CD8+ bil T celler udstillet mulighed for flere runde drab (figur 2B). CD4+ bil T celler også opnået bedre udvidelse i forhold til CD8 + celler under dette assay (figur 2C). Forskellen på ekspansion mellem bil T celle subsets blev kun observeret fra D3 efter to runder af tumor udfordring (1:12 E:T), mens forskellen af cytotoksicitet blev observeret begyndelsen på D5 efter tre runder af tumor udfordring (1:20 E:T), der angiver, at kortsigtede assays undladt at belyse forskelle i styrken af forskellige bil T celle produkter. Når 1:1 blandet CD4+ og CD8+ bil T celler blev anvendt til dette assay, de blev fundet for at excellere CD8+ men ikke CD4+ bil T celler på langsigtede cytotoksicitet (figur 2B). Udvidelse af CD8+ bil T celler er fremkaldt ved den Co anvendt CD4+ celler, mens CD4+ bil T celle ekspansion blev hæmmet i overværelse af CD8+ celler (figur 2C).
At forklare den mekanisme, der adskiller effektor aktivitet mellem CD4+ og CD8+ bil T celler, vi først bekræfte at 24 timer efter første Co kultur, begge CD4+ og CD8+ bil T celler var sammenligneligt aktiveret (figur 3 A). I mellemtiden, som angivet af CD45RO og CD62L udtryk, begge CD4+ og CD8+ bil T celler viste en overgang fra centrale hukommelse (CD45RO+, CD62L+) til effektor hukommelse (CD45RO+, CD62L-) fænotype under gentagne tumor challenge (fig. 3B). Så vi kendetegnet celler på D3 af denne analyse, en tid, før bilen T celle subsets begyndte at vise funktionel forskel. T-celle udmattelse var præget af fælles udtryk for hæmmende receptorer PD-1, LAG-3 og TIM-315,21, som viste at CD8+ bil T celler var mere tilbøjelige til udmattelse sammenlignet med CD4+ bil T celler () Figur 3 C). yderligere, ingen forskel var set på CD8+ bil T celle udmattelse i tilstedeværelse/fravær af co anvendt CD4+ celler (figur 3C), der angiver at CD4-induceret CD8+ bil T celle ekspansion er ikke forbundet med en bedre effektor funktion.
Sammen, resultaterne fra denne analyse konstateret at CD4+ bil T celler udkonkurreret CD8+ celler, specielt i langsigtede cytotoksicitet. Trods den lignende kortfristede cytotoksicitet (1-3 dage, en gang rechallenged), CD4+ bil T celler vedvarende effektor funktion ved gentagne tumor udfordring, mens CD8+ celler blev opbrugt og undladt at styre tumorcellevækst. Når de to delmængder var blandet, CD4+ bil T celler lettet udvidelse af CD8+ bil T celler, men udmattelse status af CD8+ celler blev ikke forbedret, hvilket resulterer i manglende synergistisk effekt mellem de to grupper. Tilsvarende forskel mellem CD4+ og CD8+ bil T celler sås i en in vivo model som tidligere beskrevet21. Faktisk, CD8+ bil T celler var i stand til at mægle kortsigtede tumor clearance men fulgte med antigen-positive gentagelse; i kontrast, CD4+ bil T celle behandling resulterede i langsigtede tumor udryddelse21, som minder om deres gentagende drab potentiale ved hjælp af in vitro rechallenge analyse.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59275/59275fig1.jpg"> Figur 1 : Skema og analyse strategien af gentagne udfordring assay. (A) skemaet og tidslinje for gentagne tumor udfordring assay. Til hver brønd, blev bil T-celler først Co kulturperler med PBT030-2 GBM celler (4.000 bil + celler, 16.000 tumorceller) og igen udfordret med 32.000 tumorceller hver anden dag (D2, D4 og D6). Analyse af tumor celle samt bil T celle nummer og bil T celle fænotype er udført på D1, D3, D5 og D7. (B) Gating strategi for at bestemme bil % i T celler, før du konfigurerer fælles kultur. (C) Gating strategi af levende celler, tumorceller og bil T celler fra gentagne udfordring assay. (D) Tumor celler antallet på forskellige tidspunkter af rechallenge assay, co kulturperler med untransduced T-celler. Fejllinjer = ±SEM. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59275/59275fig1large.jpg" target="_blank">venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59275/59275fig2.jpg"> Figur 2 : Gentagne udfordring assay afslører forskelle i drab og proliferativ potens CD4+ og CD8+ bil T celler. (A) degranulering og intracellulære cytokin farvning af CD4+ og CD8+ bil T celler efter 5 h Co kultur med GBM celler (E:T = 1:1). (B) CD4+, CD8+ eller blandet (CD4:CD8 = 1:1) bil T-celler blev anvendt til gentagne udfordring assay, og levedygtige tumorceller blev kvantificeres. p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001 sammenlignet med CD4+, ved hjælp af en-vejs ANOVA med Bonferronis flere sammenligning test. (C) CD4+ og CD8+ bil T celle ekspansion under gentagne tumor udfordring assay. Sammenligning af (venstre til højre) CD4+ vs CD8+, enkelt delmængde; CD4+ vs CD8+, inden for gruppen "blandet"; CD4+, enkelt vs blandet; CD8+, enkelt vs blandet. p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001 ved hjælp af en uparret Student t -test. Fejllinjer = ±SEM. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59275/59275fig2large.jpg" target="_blank">venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59275/59275fig3.jpg"> Figur 3 : Analyse af T celle fænotype under gentagne udfordring assay. (A) 4-1BB og CD69 farvning på bil T celler på D1 i analysen. (B) CD45RO og CD62L farvning af bil T-celler, før du anvender for at rechallenge assay (input) og D3 og D7 af analysen. (C) Co udtryk af PD-1, LAG-3 og TIM-3 på bil T celler på D3 i analysen. (Top) Gating strategier til at identificere T celler udtrykker 1, 2 eller 3 hæmmende receptorer. (Nederst) Sammenligning af: CD4+ celler (enkelt delmængde), CD8+ celler (enkelt delmængde), CD8+ celler (indenfor gruppen "blandet"). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59275/59275fig3large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Table 1" src="/files/ftp_upload/59275/59275table1.jpg"> Tabel 1: Repræsentative plade kort af rechallenge opsætning.

Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Tumor Cell Rechallenge For Predictive Evaluation of Chimeric Antigen Receptor T Cell Antitumor Function at JoVE.com

In Vitro Tumor Cell Rechallenge For Predictive Evaluation of Chimeric Antigen Receptor T Cell Antitumor Function

I Vitro Tumor celle Rechallenge For intelligent evaluering af kimære Antigen Receptor T-celle Antitumor funktion

Her, beskriver vi en in vitro-Co kultur metode rekursivt udfordring tumor-målrettet T celler, som giver mulighed for fænotypiske og funktionelle analyse af antitumor T celleaktivitet.

The field of chimeric antigen receptor (CAR) T cell therapy is rapidly advancing with improvements in CAR design, gene-engineering approaches and ...

Denne protokol giver en langsigtet, in vitro, funktionel metode til evaluering af kimære antigen receptor, eller CAR T-celler, gennem gentagne tumor celle udfordring. Denne teknik er mindre tidskrævende, og mindre arbejdskrævende end in vivo CAR T celle funktion evaluering, mens du stadig opnå en nøjagtig repræsentation af den sande anti-tumor effektivitet. Denne in vitro teknik muliggør høj gennemløb screening og differentiering af CAR T celle anti-tumor potens.Som har den potentielle anvendelse til vurdering af klinisk effektivitet af CAR T celleprodukter. Begynd med at adskille glioblastoma tumorsfærer fra en glioblastoma tumorsfære kultur. Med en milliliter kold accutase og 30 til 60 sekunders pipettering.Når tumorsfærer er blevet forstyrret, stoppe reaktionen med fem milliliter varm co-kultur medium. Og pellet tumor celle suspensioner ved centrifugering. Re-suspendere glioblastoma celler til en 1,6 gange 10 til den femte tumorceller pr milliliter frisk coculture medium koncentration, og fortynde t-celler høstet fra en CAR T celle kultur til den passende procentdel af CAR positive T-celler pr milliliter co-kultur medium koncentration.Dernæst tilsættes 100 mikroliter af de fortyndede tumorceller til hver brønd af en 96 godt flad bund væv kultur plade. Og 100 mikroliter AF CAR T celler i hver brønd af tumorceller med blid blanding. Derefter placere pladen i en 37 grader Celsius, 5% kuldioxid inkubator.På dag to, fire og seks af kultur, omhyggeligt fjerne 50 mikroliter af medium fra hver brønd af tumorcellen, T-celle co-kultur plade dømt til rechallenge ifølge bordet. Derefter tilsættes 50 mikroliter af frisk glioblastoma celle suspension, forberedt som netop påvist, men med dobbelt så meget cellenummer af den oprindelige co-kultur til hver brønd med blid blanding. Og returnere pladen til cellekultur kuvøse.Dag et, tre, fem og syv af co-kultur, overføre supernatant fra hver brønd, der skal høstes i en ny 96 godt runde bundplade i henhold til bordet og tilføje 50 mikroliter af forvarmet 0,5% Trypsin EDTA i hvert medium forarmet godt. Efter fem minutter ved 37 grader Celsius bekræftes det, at cellerne er afmonteret fra bunden af hver brønd ved lysmikroskopi, og forsigtigt pipette enzymopløsningen rundt i bunden af hver brønd for at opsbruge cellerne. Før du overfører den fritliggende cellesuspension til de relevante tilsvarende brønde af den nye 96 brøndplade.Pellet cellerne ved centrifugering, og vask cellerne med 200 mikroliter af fluorescerende aktiveret cellesortering stående opløsning, eller FFS per brønd med en anden centrifugering. Re-suspendere pellets i 100 mikroliter af antistof cocktail af interesse i 100 mikroliter af SSS per brønd for en 30 minutters inkubation ved fire grader Celsius. A slutningen af inkubationen fjerne alle ubundne antistof ved sekventiel 100 og 200 mikroliter FSS vasker og re-suspendere cellerne i 100 til 200 mikroliter af DAPI nukleare plet og FSS.Derefter analysere cellerne i henhold til standard flow cytometrisk analyse protokoller. For funktionel og fæotypisk analyse af CAR T-cellerne efter tumorcelle co-kultur, hente datafiler fra flow cytometer, og gate alle de levende DAPI negative celler. For at kvantificere tumorceller, gate CD45 negative befolkning.For at kvantificere CAR T-cellerne er cd45-positive CAR-positive populationer i gate. Derefter plotte tumor og CAR T celle numre i løbet af den tid, løbet af eksperimentet, identificere T-celle aktivering ved co-ekspression af 41BB, og CD69. T-celleudmattelse ved udtrykket PD1, LAG3 og TIM3 og T-cellehukommelsesstatus LAG3 og TIM3 og T-cellehukommelsesstatus ved CD45RO og CD62 ligand expression.cd45RO og CD62-ligandudtryk. Både CD4 positive og CD8 positive CAR T-celler aktiveres ligeligt mod glioblastomceller, der udtrykker målantigenet som angivet i deres CD107a og intracellulære cytokinudtryk. Men, som vurderet af gentagne tumor udfordring SA, CD4 positive, men ikke CD8 positive, CAR T celler er i stand til flere runde drab.CD4 positive CAR T-celler opnår også en mere robust ekspansion. Når CD4-positive og CD8-positive CAR T-celler blandes med et en-til-et-forhold, udfører denne cellekombination CD8-positive, men ikke CD4-positive CAR T-celler med hensyn til langtidscytotoksicitet. Desuden er udvidelsen af CD8 positive CAR T-celler induceret ved tilsætning af CD4 positive T-celler.Mens CD4 positive CAR T celle ekspansion er hæmmet i nærvær af CDa positive celler. 24 timer efter den oprindelige co-kultur aktiveres både CD4 positive og CD8 positive CAR T-celler på samme måde. Under den gentagne tumor udfordring, både CD4 positive og CD8 positive CAR T celler demonstrere en overgang fra en CD45RO positiv, CD62 ligan positiv central hukommelse fænotype, til en CD45RO positiv CD62 ligan negativ effektor hukommelse fænotype.CD8 positive CAR T-celler er også mere tilbøjelige til udmattelse sammenlignet med CD4 positive CAR T-celler som vurderet af deres PD1, LAG3 og TIM3 udtryk efter tre dages co-kultur. Desuden er der ikke observeret forskelle i CDa-positiv CAR T-celleudmattelse i tilstedeværelse eller fravær af CD4-positive T-celler, hvilket indikerer, at CD4-induceret CD8-positiv CAR T-celleudvidelse ikke er forbundet med en bedre effektorfunktion. Dette essay kan også kombineres med sortering af T-celler danner co-kultur til at udføre yderligere analyse på transskriptoer, proteomics, og specifikke gener af interesse.Denne gentagne tumor udfordring kunne også bruges som en platform for at undersøge de biologiske begivenheder post CAR T celle tumor anerkendelse.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Target Cell Pre-enrichment and Whole Genome Amplification for Single Cell Downstream Characterization

Target Cell pre berigelse og hele genom forstærkning for enkelt celle Downstream karakterisering

Rare target cells can be isolated from a high background of non-target cells using antibodies specific for surface proteins of target cells. A recently ...

A Syngeneic Mouse B-Cell Lymphoma Model for Pre-Clinical Evaluation of CD19 CAR T Cells

Syngeneic musen B-celle lymfom Model for præ-klinisk evaluering af CD19 bil T celler

The astonishing clinical success of CD19 chimeric antigen receptor (CAR) T-cell therapy has led to the approval of two second generation chimeric antigen ...

Real Time Detection of In Vitro Tumor Cell Apoptosis Induced by CD8+ T Cells to Study Immune Suppressive Functions of Tumor-infiltrating Myeloid Cells

Real Time Detection of In Vitro Tumor Cell Apoptosis Induced by CD8+ T Cells to Study Immune Suppressive Functions of Tumor-infiltrating Myeloid Cells

Realtid påvisning af i Vitro Tumor celle apoptose induceret af CD8+ T-celler til at studere immun suppressiv funktioner af Tumor infiltrerer myeloide celler

Potentiation of the tumor-killing ability of CD8+ T cells in tumors, along with their efficient tumor infiltration, is a key element of successful ...

Flow Cytometric Analysis of Mitochondrial Reactive Oxygen Species in Murine Hematopoietic Stem and Progenitor Cells and MLL-AF9 Driven Leukemia

Flow Cytometrisk analyse af mitokondrie reaktive oxygen arter i murine hæmatopoietiske stamceller og Progenitorcellerne og MLL-AF9 drevet leukæmi

We present a flow cytometric approach for analyzing mitochondrial ROS in various live bone marrow (BM)-derived stem and progenitor cell populations from ...

Manufacturing Chimeric Antigen Receptor (CAR) T Cells for Adoptive Immunotherapy

Manufacturing Chimeric Antigen Receptor CAR T Cells for Adoptive Immunotherapy

Fremstilling af Chimeric antigen receptor (bil) T-celler til adoptiv immunterapi

Adoptive immunotherapy holds promise for the treatment of cancer and infectious disease. We describe a simple approach to transduce primary human T cells ...

Using Human Induced Pluripotent Stem Cells for the Generation of Tumor Antigen-specific T Cells

Anvendelse af menneskeskabte pluripotente stamceller til generering af tumor antigen-specifikke T-celler

The generation and expansion of functional T cells in vitro can lead to a broad range of clinical applications. One such use is for the treatment of ...

Generation of Orthotopic Pancreatic Tumors and Ex vivo Characterization of Tumor-Infiltrating T Cell Cytotoxicity

Generation of Orthotopic Pancreatic Tumors and Ex vivo Characterization of Tumor-Infiltrating T Cell Cytotoxicity

Generation af Ortotopiske tumorer i bugspytkirtlen og ex vivo karakterisering af tumor Infiltrerende T-celle cytotoksicitet

In vivo models of pancreatic cancer provide invaluable tools for studying disease dynamics, immune infiltration and new therapeutic strategies. The ...

In Vitro Evaluation of Oncogenic Transformation in Human Mammary Epithelial Cells

In Vitro evaluering af onkogene transformation i humane mammary epitelceller

Tumorigenesis is a multi-step process in which cells acquire capabilities&#160;that allow their growth, survival, and dissemination under hostile ...

Dynamic Imaging of Chimeric Antigen Receptor T Cells with [18F]Tetrafluoroborate Positron Emission Tomography/Computed Tomography

Dynamic Imaging of Chimeric Antigen Receptor T Cells with [18F]Tetrafluoroborate Positron Emission Tomography/Computed Tomography

Dynamisk billeddannelse af kimære antigenreceptor-T-celler med [18F]tetrafluorborat positronemissionstomografi/computertomografi

T cells genetically engineered to express chimeric antigen receptors (CAR) have shown unprecedented results in pivotal clinical trials for patients with B ...

Evaluation of the In vivo Antitumor Activity of Polyanhydride IL-1&#945; Nanoparticles

Evaluation of the In vivo Antitumor Activity of Polyanhydride IL-1ÃƒÅ½Ã‚Â± Nanoparticles

Evaluering af in vivo antitumoraktivitet af polyanhydrid IL-1α nanopartikler

Cytokine therapy is a promising immunotherapeutic strategy that can produce robust antitumor immune responses in cancer patients. The proinflammatory ...