Name: in vitro tumor cell rechallenge for predictive evaluation of chimeric antigen receptor t cell antitumor function
Uploaded: 2019-02-27T15:00:00
Duration: 8 min 4 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Tumor Cell Rechallenge For Predictive Evaluation of Chimeric Antigen Receptor T Cell Antitumor Function at JoVE.com

Dit werk werd gesteund door subsidies van het California Institute voor regeneratieve geneeskunde (CIRM) grant TR3-05641 en NIH grants P30 CA33572 (cores). D.W. wordt ondersteund door NCI fellowship 1F99CA234923-01.

Onze IRB vereist herziening van dit protocol niet. Wij ontvangen afgedankte verse glioblastoma tumor monsters van de stad van hoop pathologie afdeling die zijn gecodeerd, en ons laboratorium krijgt geen toegang tot de sleutel. We ontvangen de exemplaren met gegevens alleen op voorafgaande behandeling en ziekte staat ten tijde van de biopsie/resectie, met geen identificerende gegevens.
1. Media voorbereiding
<ol><li>Bereiden van neurale stamcellen media voor het kweken van primaire GBM cellijnen: DMEM:F12, 1:50 B27, 5 µg/mL heparine en 2 mmol/L L-glutamine; aangevuld met 20 ng/mL epidermale groeifactor (EGF) en 20 ng/mL basis fibroblast groeifactor (FGF) tweemaal per week (Zie Tabel van materialen).</li>
	<li>Bereiden van T cel media: X-VIVO 15 met 10% foetaal kalfsserum (FCS); aangevuld met 70 IE/mL rhIL-2 en 0,5 ng/mL rhIL-15 elke 48 uur (Zie Tabel van materialen).</li>
	<li>Co voedingsbodems bereiden: neurale stamcellen media zonder EGF en FGF supplement nemen en voeg toe 10% FCS.</li>
	<li>FACS kleurstofoplossing (FSS) bereiden: HBSS, 2% FCS, NaN3 (0,5 g/500 mL).</li>
</ol>2. voorbereiding van GBM tumorcellen
<ol><li>Oogst van lage-passage GBM tumor bollen (TSs) door middel van centrifugeren bij 300 x g gedurende 4 min en weggeworpen. Opmerking: GBM tumor bollen (TSs) zijn gegenereerd op basis van gereseceerd tumoren zoals eerder beschreven22,23,24, en onderhouden neurale stamcellen media, starterscentra met 5% CO2 bij 37 ° C.</li>
	<li>Vooraf warm mede voedingsbodems in een waterbad 37 ° C.</li>
	<li>Voeg 1 mL koude accutase tot GBM TSs, TSs distantiëren door pipetteren voor 30-60-s en dissociatie stoppen door toevoeging van 5 mL warme co voedingsbodems. Opmerking: GBM TSs moeten niet worden gehouden op accutase voor meer dan 5 min.</li>
	<li>Oogst GBM cellen door centrifugeren bij 300 x g gedurende 4 min, weggeworpen en resuspendeer de cellen in 2 mL zuiver co voedingsbodems.</li>
	<li>Bepalen van concentratie van de cel met behulp van een cel levensvatbaarheid counter. Opmerking: Levensvatbaarheid van de cellen moet > 70%.</li>
</ol>3. bereiding van auto T cellen
<ol><li>Minder dan 24 uur vóór de assay, neem 100 µL van gekweekte auto T-cellen in een stroom cytometry buis en voeg toe 2 mL FSS. Opmerking: AUTO T-cellen werden gegenereerd zoals eerder beschreven11,21 en gekweekt in T cel media.</li>
	<li>Centrifugeren bij 300 x g gedurende 4 min en negeren supernatant.</li>
	<li>Voeg 2 mL FSS te wassen van de cellen, centrifuge op 300 x g voor 4 min, en weggeworpen.</li>
	<li>Vlek van de cellen met passende antilichaam om aan te geven van de uitdrukking van de auto bij 4 ° C gedurende 30 minuten. Opmerking: Bijvoorbeeld, als een auto IL13Rα2-gerichte beschreven eerder25 wordt gebruikt, dan vlekken met anti-IL13 antistof.</li>
	<li>Was tweemaal met 2 mL FSS en analyseren van auto exn met behulp van een cytometer stroom.</li>
	<li>Bepaal de auto % op T cellen met behulp van het gating strategie afgebeeld in Figuur 1B.</li>
	<li>Op de dag van de mede cultuur, oogsten van alle auto T cellen door centrifugeren bij 300 x g gedurende 4 min wordt weggeworpen en resuspendeer de cellen in 2 mL zuiver co voedingsbodems.</li>
	<li>Bepalen van concentratie van de cel met behulp van een cel levensvatbaarheid counter. Opmerking: Levensvatbaarheid van de cellen moet > 70%.</li>
</ol>4. instellen tumor — T celkweek co
<ol><li>Tumorcellen tot een concentratie van met co voedingsbodems 0.16 miljoen/mL verdund.</li>
	<li>Gebaseerd op auto %, Verdun auto T-cellen bij een concentratie van 0.04 miljoen auto+ cellen/mL met co voedingsbodems. Opmerking: Bijvoorbeeld, als de auto 50 is % en T cel concentratie 0,4 miljoen/mL is, moet een verdunning 1:5 om de uiteindelijke concentratie van 0.04 miljoen auto+ cellen/mL.</li>
	<li>Pipetteer 100 µL van verdunde tumorcellen in ieder putje van een 96-Wells flat-onderkant weefselkweek plaat.</li>
	<li>Pipetteer 100 µL van verdunde auto T cellen in elk putje waarin tumorcellen en meng goed. Opmerking: Elke celcultuur co tumor-T zal worden geanalyseerd op 4 tijd punten. 4-6 wordt gerepliceerd vereist bij misschien wel telkens punt op basis van verschillende analyse, maar < 3 duplo's per tijdstip wordt niet aanbevolen; Zie tabel 1 voor een representatieve platemap.</li>
	<li>Het handhaven van de plaat in een 37 ° C, 5% CO2 incubator.</li>
</ol>5. tumor cel Rechallenge
Opmerking: Herprovocatie vindt plaats op 2, 4 en 6 dagen post de eerste co cultuur setup(Figuur 1).
<ol><li>Oogst en distantiëren GBM TSs zoals hierboven (stappen 2.1-2.6) beschreven.</li>
	<li>Resuspendeer GBM cellen bij een concentratie van 0.64 miljoen/mL.</li>
	<li>Bepalen van de co cultuur putten moeten herprovocatie (Zie tabel 1) en zorgvuldig verwijderen boven aan elk putje 50 µL media.</li>
	<li>Voeg 50 µL celsuspensie GBM in elk putje en meng goed, dan zet de plaat terug in een 37 ° C, 5% CO2 incubator.</li>
</ol>6. de oogst van monsters en stromen van cytometrische analyse
Opmerking: Monsters zal in 1, 3, 5 en 7 dagen post die de eerste co cultuur-installatie, met 1, 2, 3 en 4 rondes van tumor uitdaging, respectievelijk worden geoogst.
<ol><li>Vooraf warm trypsine-EDTA-oplossing 0,05% in 37 ° C waterbaden.</li>
	<li>Het bepalen van de putten die moeten oogsten en overdracht van de media in een nieuwe ronde-96-Wells bodemplaat.</li>
	<li>Pipeteer 50 µL van trypsine-EDTA in de putten te verteren resterende tumorcellen bij 37 ° C gedurende 5 minuten.</li>
	<li>Controleer onder een Microscoop, of dat de cellen hebben losgemaakt van de bodem.</li>
	<li>Pipetteer rond de goed onderkant naar resuspendeer vrijstaande cellen en overdracht van trypsine-EDTA met vrijstaande cellen aan de overeenkomstige putjes van de bodemplaat, die ronde-96-Wells.</li>
	<li>Centrifuge de ronde-96-Wells bodemplaat 300 x g4 ° C voor 4 min, vervolgens weggeworpen.</li>
	<li>Voeg 200 µL per putje van FSS te wassen van de cellen, centrifuge op 300 x g, 4 ° C voor 4 min, dan wordt weggeworpen.</li>
	<li>Resuspendeer de cellen in 100 µL per putje FSS met antilichamen (Zie Tabel van materialen) en vlek cellen bij 4 ° C gedurende 30 minuten.</li>
	<li>Voeg 100 µL per putje FSS aan cellen, centrifugeer bij 300 x g, 4 ° C voor 4 min, vervolgens negeren supernatant.</li>
	<li>Voeg 200 µL per putje van FSS te wassen van de cellen, centrifuge op 300 x g, 4 ° C voor 4 min, dan wordt weggeworpen.</li>
	<li>Resuspendeer de cellen met 100-200 µL per putje van FSS met 500 ng/mL DAPI en analyseren van monsters met stroom cytometry.</li>
</ol>7. functionele en Phen Otypic analyse van auto T cellen
<ol><li>Haalt de gegevensbestanden van stroom cytometer, en poort van alle levende (DAPI-) cellen (Figuur 1C).</li>
	<li>Kwantificeren van tumorcellen door gating de CD45- bevolking en auto T cellen door gating de CD45+, auto + bevolking (Figuur 1C). Opmerking: Als de tumorcellen express CD45 (b.v. Raji lymfoom cellen), anti-CD3 kleuring kan worden gebruikt om te onderscheiden van T cellen van tumorcellen.</li>
	<li>Perceel tumor cel en auto T celaantal doorheen de tijd.</li>
	<li>T-cel activatie identificeren door de co uitdrukking van 4-1BB en CD69. Opmerking: Deze oppervlakte markeringen kunnen worden gebruikt voor het analyseren van T cel activatie 6-24 h post eerste co cultuur.</li>
	<li>T cel uitputting identificeren door de uitdrukking van PD-1, LAG-3 en TIM-3.</li>
	<li>T cel Geheugenstatus identificeren door de uitdrukking van CD45RO en CD62L.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Porter, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chimeric+antigen+receptor+T+cells+persist+and+induce+sustained+remissions+in+relapsed+refractory+chronic+lymphocytic+leukemia.">Chimeric antigen receptor T cells persist and induce sustained remissions in relapsed refractory chronic lymphocytic leukemia.</a> Science Translational Medicine. 7 (303), (2015).</li><li>Brentjens, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD19-targeted+T+cells+rapidly+induce+molecular+remissions+in+adults+with+chemotherapy-refractory+acute+lymphoblastic+leukemia.">CD19-targeted T cells rapidly induce molecular remissions in adults with chemotherapy-refractory acute lymphoblastic leukemia.</a> Science Translational Medicine. 5 (177), (2013).</li><li>Grupp, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chimeric+antigen+receptor-modified+T+cells+for+acute+lymphoid+leukemia.">Chimeric antigen receptor-modified T cells for acute lymphoid leukemia.</a> The New England Journal of Medicine. 368 (16), 1509-1518 (2013).</li><li>Lee, D. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cells+expressing+CD19+chimeric+antigen+receptors+for+acute+lymphoblastic+leukaemia+in+children+and+young+adults:+a+phase+1+dose-escalation+trial.">T cells expressing CD19 chimeric antigen receptors for acute lymphoblastic leukaemia in children and young adults: a phase 1 dose-escalation trial.</a> The Lancet. 385 (9967), 517-528 (2015).</li><li>Yong, C. S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CAR+T-cell+therapy+of+solid+tumors.">CAR T-cell therapy of solid tumors.</a> Immunology and Cell Biology. 95 (4), 356-363 (2017).</li><li>Barrett, D. M., Singh, N., Porter, D. L., Grupp, S. A., June, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chimeric+antigen+receptor+therapy+for+cancer.">Chimeric antigen receptor therapy for cancer.</a> Annual Review of Medicine. 65, 333-347 (2014).</li><li>Priceman, S. J., Forman, S. J., Brown, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Smart+CARs+engineered+for+cancer+immunotherapy.">Smart CARs engineered for cancer immunotherapy.</a> Current Opinion in Oncology. 27 (6), 466-474 (2015).</li><li>Fesnak, A. D., June, C. H., Levine, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineered+T+cells:+the+promise+and+challenges+of+cancer+immunotherapy.">Engineered T cells: the promise and challenges of cancer immunotherapy.</a> Nature Reviews Cancer. 16 (9), 566-581 (2016).</li><li>Esensten, J. H., Bluestone, J. A., Lim, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+Therapeutic+T+Cells:+From+Synthetic+Biology+to+Clinical+Trials.">Engineering Therapeutic T Cells: From Synthetic Biology to Clinical Trials.</a> Annual Review of Pathology. 12, 305-330 (2017).</li><li>Lim, W. A., June, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Principles+of+Engineering+Immune+Cells+to+Treat+Cancer.">The Principles of Engineering Immune Cells to Treat Cancer.</a> Cell. 168 (4), 724-740 (2017).</li><li>Brown, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+IL13Ralpha2-Targeted+Chimeric+Antigen+Receptor+T+Cells+for+Improved+Anti-tumor+Efficacy+against+Glioblastoma.">Optimization of IL13Ralpha2-Targeted Chimeric Antigen Receptor T Cells for Improved Anti-tumor Efficacy against Glioblastoma.</a> Molecular Therapy. , (2017).</li><li>Long, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=4-1BB+costimulation+ameliorates+T+cell+exhaustion+induced+by+tonic+signaling+of+chimeric+antigen+receptors.">4-1BB costimulation ameliorates T cell exhaustion induced by tonic signaling of chimeric antigen receptors.</a> Nature Medicine. 21 (6), 581-590 (2015).</li><li>Cherkassky, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+CAR+T+cells+with+cell-intrinsic+PD-1+checkpoint+blockade+resist+tumor-mediated+inhibition.">Human CAR T cells with cell-intrinsic PD-1 checkpoint blockade resist tumor-mediated inhibition.</a> The Journal of Clinical Investigation. 126 (8), 3130-3144 (2016).</li><li>Priceman, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Co-stimulatory+signaling+determines+tumor+antigen+sensitivity+and+persistence+of+CAR+T+cells+targeting+PSCA++metastatic+prostate+cancer.">Co-stimulatory signaling determines tumor antigen sensitivity and persistence of CAR T cells targeting PSCA+ metastatic prostate cancer.</a> Oncoimmunology. 7 (2), 1380764 (2018).</li><li>Eyquem, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+a+CAR+to+the+TRAC+locus+with+CRISPR/Cas9+enhances+tumour+rejection.">Targeting a CAR to the TRAC locus with CRISPR/Cas9 enhances tumour rejection.</a> Nature. 543 (7643), 113-117 (2017).</li><li>Gattinoni, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acquisition+of+full+effector+function+in+vitro+paradoxically+impairs+the+in+vivo+antitumor+efficacy+of+adoptively+transferred+CD8++T+cells.">Acquisition of full effector function in vitro paradoxically impairs the in vivo antitumor efficacy of adoptively transferred CD8+ T cells.</a> The Journal of Clinical Investigation. 115 (6), 1616-1626 (2005).</li><li>Malandro, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonal+Abundance+of+Tumor-Specific+CD4(+)+T+Cells+Potentiates+Efficacy+and+Alters+Susceptibility+to+Exhaustion.">Clonal Abundance of Tumor-Specific CD4(+) T Cells Potentiates Efficacy and Alters Susceptibility to Exhaustion.</a> Immunity. 44 (1), 179-193 (2016).</li><li>Gattinoni, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt+signaling+arrests+effector+T+cell+differentiation+and+generates+CD8++memory+stem+cells.">Wnt signaling arrests effector T cell differentiation and generates CD8+ memory stem cells.</a> Nature Medicine. 15 (7), 808-813 (2009).</li><li>Klebanoff, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Central+memory+self/tumor-reactive+CD8++T+cells+confer+superior+antitumor+immunity+compared+with+effector+memory+T+cells.">Central memory self/tumor-reactive CD8+ T cells confer superior antitumor immunity compared with effector memory T cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (27), 9571-9576 (2005).</li><li>Gattinoni, L., Klebanoff, C. A., Restifo, N. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paths+to+stemness:+building+the+ultimate+antitumour+T+cell.">Paths to stemness: building the ultimate antitumour T cell.</a> Nature Reviews Cancer. 12 (10), 671-684 (2012).</li><li>Wang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glioblastoma-targeted+CD4++CAR+T+cells+mediate+superior+antitumor+activity.">Glioblastoma-targeted CD4+ CAR T cells mediate superior antitumor activity.</a> JCI Insight. 3 (10), (2018).</li><li>Kahlon, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+recognition+and+killing+of+glioblastoma+multiforme+by+interleukin+13-zetakine+redirected+cytolytic+T+cells.">Specific recognition and killing of glioblastoma multiforme by interleukin 13-zetakine redirected cytolytic T cells.</a> Cancer Research. 64 (24), 9160-9166 (2004).</li><li>Brown, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recognition+and+killing+of+brain+tumor+stem-like+initiating+cells+by+CD8++cytolytic+T+cells.">Recognition and killing of brain tumor stem-like initiating cells by CD8+ cytolytic T cells.</a> Cancer Research. 69 (23), 8886-8893 (2009).</li><li>Lee, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+stem+cells+derived+from+glioblastomas+cultured+in+bFGF+and+EGF+more+closely+mirror+the+phenotype+and+genotype+of+primary+tumors+than+do+serum-cultured+cell+lines.">Tumor stem cells derived from glioblastomas cultured in bFGF and EGF more closely mirror the phenotype and genotype of primary tumors than do serum-cultured cell lines.</a> Cancer Cell. 9 (5), 391-403 (2006).</li><li>Brown, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regression+of+Glioblastoma+after+Chimeric+Antigen+Receptor+T-Cell+Therapy.">Regression of Glioblastoma after Chimeric Antigen Receptor T-Cell Therapy.</a> The New England Journal of Medicine. 375 (26), 2561-2569 (2016).</li><li>Salter, A. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphoproteomic+analysis+of+chimeric+antigen+receptor+signaling+reveals+kinetic+and+quantitative+differences+that+affect+cell+function.">Phosphoproteomic analysis of chimeric antigen receptor signaling reveals kinetic and quantitative differences that affect cell function.</a> Science Signaling. 11 (544), (2018).</li><li>Rossi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preinfusion+polyfunctional+anti-CD19+chimeric+antigen+receptor+T+cells+are+associated+with+clinical+outcomes+in+NHL.">Preinfusion polyfunctional anti-CD19 chimeric antigen receptor T cells are associated with clinical outcomes in NHL.</a> Blood. 132 (8), 804-814 (2018).</li><li>Garcia-Diaz, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interferon+Receptor+Signaling+Pathways+Regulating+PD-L1+and+PD-L2+Expression.">Interferon Receptor Signaling Pathways Regulating PD-L1 and PD-L2 Expression.</a> Cell Reports. 19 (6), 1189-1201 (2017).</li><li>Walker, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+Antigen+and+Receptor+Densities+Regulate+Efficacy+of+a+Chimeric+Antigen+Receptor+Targeting+Anaplastic+Lymphoma+Kinase.">Tumor Antigen and Receptor Densities Regulate Efficacy of a Chimeric Antigen Receptor Targeting Anaplastic Lymphoma Kinase.</a> Molecular Therapy. 25 (9), 2189-2201 (2017).</li><li>Fraietta, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determinants+of+response+and+resistance+to+CD19+chimeric+antigen+receptor+(CAR)+T+cell+therapy+of+chronic+lymphocytic+leukemia.">Determinants of response and resistance to CD19 chimeric antigen receptor (CAR) T cell therapy of chronic lymphocytic leukemia.</a> Nature Medicine. 24 (5), 563-571 (2018).</li><li>Fraietta, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disruption+of+TET2+promotes+the+therapeutic+efficacy+of+CD19-targeted+T+cells.">Disruption of TET2 promotes the therapeutic efficacy of CD19-targeted T cells.</a> Nature. 558 (7709), 307-312 (2018).</li></ol>

De constructie van de auto in dit werk beschreven zijn gelicentieerd door Mustang Bio., Inc., waarvoor S.J.F. en C.E.B. royalty's te betalen ontvangen. Alle andere auteurs verklaren geen potentiële belangenconflicten.

Deze repetitieve tumor cel uitdaging assay biedt een handige aanpak om te evalueren van auto T cel functionele potentie, met behulp van een in vitro setup dat de last van de hoge tumor in vivo tumor modellen is gekoppeld recapituleert. Tijdens deze 7-daagse assay, auto T cellen ondergaan vier rondes van tumor uitdaging (eerste co cultuur en 3 x herprovocatie), creëren een omgeving waar uitgeput T-cellen kunnen verliezen hun vermogen om te reageren op de uitdaging van de tumor ondanks een krachtige eerste reactie. Tumor cel eliminatie en auto T cel expansie vertegenwoordigen twee fundamentele uitlezingen die kunnen worden verkregen uit deze assay, terwijl de fenotypen van auto T cellen kunnen gemakkelijk worden geanalyseerd door kleuring van dagbouw of intracellulaire markeringen die aangeven van T cel activatie, uitputting en/of geheugen. Deze bepaling is ook handig te combineren met niet-vertekende analyse van auto T cellen transcriptome Proteoom of fosfor-Proteoom21,26, en T-cel polyfunctionality heeft aangenomen om te voorspellen klinische reacties27. Tumorcellen kunnen bovendien ook worden getest voor hun adaptieve reactie tegen T-cel-immuniteit zoals cytokine secretie28. Aangezien monsters worden geoogst op meerdere tijdstippen, voorziet deze bepaling niet alleen statische, maar ook dynamische analyse van auto T cel gedrag wanneer reageren op overtollige aantal tumorcellen.
De bepaling is bijzonder krachtig in vergelijking van de effector potentie van auto T cellen gericht op het zelfde antigeen, maar met verschillende ontwerpen en/of productieprocessen. We hebben deze test gebruikt om te identificeren die CD4+ auto T cellen waren kunnen bemiddelen superieure lange termijn effector functie dan CD8+ cellen21. Het was ook te zien dat in vivo werkzaamheid van de auto was gecorreleerd met de cytotoxiciteit op latere tijdstippen (D5-D7) tijdens deze assay, verder benadrukken de noodzaak van het gebruik van repetitieve tumor uitdaging voor in vitro auto T cel evaluatie. Hoewel GBM cellen werden gebruikt als het voorbeeld van doelcellen hier, deze bepaling kan zonder problemen worden aangenomen tot een combinatie van verschillende T-cel-tumor. Met name kan auto T cel gedrag ook variëren bij verschillende antigeen dichtheden en engineering kankercellen aan verschillende niveaus van gerichte antigenen verstrekt het gereedschap om te onderzoeken sequentiële moleculaire gebeurtenissen op auto erkenning29express. Deze test kan dus ook worden benut om de onderzoeken van het patroon voor activering van bepaalde auto T cellen tegen verschillende doelen.
Aangezien de levensvatbaarheid van de cellen van het doel en de auto T cel expansie twee upfront uitlezingen van deze test zijn, is het essentieel dat alle co culturen met levensvatbare beginnen (> 70%) tumor en T-cellen. Bij het uitvoeren van de herprovocatie processen, moet de actie van zuigen media (stap 5.3) tumor en T-cellen in de bodem van de putten, om niet te introduceren geen onnodige variaties van de graven van de cellen niet verstoren. Bij het uitvoeren van deze test op opschorting doel cellijnen, is het aanbevolen om de oogst van de resterende cellen door centrifugeren voordat tumor cel herprovocatie.
Een beperking van deze bepaling is dat de setup-parameters (E:T ratio's van de eerste mede cultuur en herprovocatie) moet worden aangepast op basis van verschillende combinaties van de auto-tumor. Bijvoorbeeld, als de tumorcellen express een grote mate van immuno-remmende molecules (zoals PD-L1), een hogere ratio van E:T is het raadzaam gezien het feit dat de algehele efficiëntie doden is verminderde in vergelijking met de PD-L1-low tumorcellen. Voordat u de test op nieuwe auto-tumor combinaties toepast, een pilot-studie wordt aanbevolen om te bepalen van de optimale omstandigheden, waardoor meestal de meest potente auto T cellen getest in de bepaling te elimineren > 80% van de tumorcellen op het eindpunt. Aangezien de cel direct contact nodig is voor de auto T cellen gemedieerde doden, mochten de tumorcellen fluorescentie-label, vervolgens het panel van flow cytometrische analyse dienovereenkomstig moet worden aangepast (bijv als de tumorcellen GFP-label, dan ieder FITC-geconjugeerd antilichamen mag niet worden gebruikt).
De klinische activiteit van auto T cellen tegen B-cel maligniteiten heeft geleid tot twee FDA-goedgekeurde geneesmiddelen. Het antwoord heeft echter aanzienlijke variatie geleerd over verschillende patiënten27,30,31, die was te correleren met de fenotypische eigenschappen van de auto producten30toegelicht. Deze test van de uitdaging in vitro repetitieve tumor verder biedt een aanpak om functioneel testen de auto effector potentie naast de fenotypische karakterisaties en polyfunctionality cytokine productie, en zorgt voor hogere-throughput screening van klinische producten in vergelijking met in vivo tumor modellen met behoud van de voorspellende trouw. Over het algemeen kan deze test worden gebruikt voor functionele test van de T cel voor auto T cel ontwerp, preklinische en klinische ontwikkeling.

Immunotherapie met behulp van chimeer antigeen receptor (CAR)-gemanipuleerde T cellen veelbelovende resultaten tegen B-cel maligniteiten1,2,3,4, terwijl het potentieel van gericht op andere tumoren heeft gezien blijft onder strenge onderzoek5,6,7. Grote vooruitgang heeft geboekt om de auto-construct, productieproces en patiënt pre infusie regimes6,7,8te optimaliseren en nieuwe synthetische biologie benaderingen naar verwachting stijgen hun persistentie, veiligheid en tumor specificiteit9,10. Het is echter moeilijk en arbeidsintensief om te beoordelen op de juiste wijze het therapeutisch potentieel van auto T cellen om te begeleiden de beste keuze voor klinische vertaling geweest. Het meest gevestigde model tot nu toe te evalueren van auto T cel functie is in immunodeficiëntie muizen die menselijke tumor xenografts, waarbij auto T-cellen worden onderzocht voor antitumor werkzaamheid en vergeleken in milliliters gestelde cel doses11,12 , 13 , 14 , 15. deze in vivo lymfkliertest onderzoek zijn arbeidsintensief en tijdrovend, vooral wanneer het screenen van grote aantallen van parameters. Verder, in vivo studies kunnen worden gefixeerd door de toegankelijkheid van de muis stammen, dierenverzorgers faciliteiten en dier-behandeling technieken. Daarom is er behoefte aan meer handige in-vitrotests waardoor snelle uitlezingen effector activiteit, die ook getrouw beeld geven van de in vivo antitumorale functie van deze T-cellen.
Conventionele methoden ter bepaling van de cytotoxiciteit van T cellen in vitro hebben gericht op het opsporen van degranulatie, cytokine productie en de mogelijkheid lyse isotoop-geëtiketteerden doelcellen (dat wil zeggen, chroom release assays). Terwijl deze testen informatief zijn voor het definiëren van auto T cel specificiteit en de erkenning van de omgeleide doel, verzuimen vaak na te denken in vivo antitumorale potentieel van gemanipuleerde T cellen12,13,16. In bepaalde gevallen, in vitro toonde activiteit in korte termijn testen doden een omgekeerde correlatie met in vivo antitumorale functie16. Deze inconsistentie is waarschijnlijk het gevolg van hoge effector: target (E:T) ratio's gebruikt in deze in-vitrotests, en daarom het onvermogen om te onderscheiden van auto T cel producten die gevoelig voor uitputting17 zijn. Daarentegen tijdens in vivo tumor uitroeiing T reageren cellen gewoonlijk tegen grote tumor lasten, waardoor meerdere rondes van doden en vervolgens rijden T cel differentiatie en uitputting18,19, 20, dat een van de grote belemmeringen tegen effectieve tumor goedkeuring door auto T is cellen12,,13. Ondertussen doen meest op korte termijn in vitro doden testen ook niet uitlezing verschillen in T-celproliferatie, terwijl dat bij auto T cel behandelde patiënten is de capaciteit voor auto T cel uitbreiding sterk gecorreleerd met klinische reacties4. Dus, de juiste in-vitro-assay zou moeten recapituleren voorwaarden van hoge tumor last, inductie van T cel uitputting, en zorgt voor de uitlezing van de T cel expansie.
Hier beschrijven we een strategie om te evalueren van auto T-cellen voor repetitieve tumor potentieel, met een eenvoudige in-vitro co cultuur assay doden. Andere T cel effector activiteit parameters kunnen tegelijk worden onderzocht, met inbegrip van de target cel doden, auto T cel expansie en geheugen - of uitputting-geassocieerde fenotypen. De resultaten van deze test correleren goed met de in vivo antitumorale werking van auto T-cellen, en kunnen worden benut om de potentie van auto T cel producten beoordelen. We beschrijven een test om te beoordelen van de IL13Ra2-gerichte auto T cellen tegen primaire GBM lijnen21, kan het gemakkelijk worden aangepast aan elk auto T-cel-platform.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1084px;" width="1083">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:451px;">0.05% Trypsin/0.53mM EDTA in HBSS w/o Calcium and Magnesium</td>
			<td style="width:123px;">Corning</td>
			<td style="width:344px;">MT25051CI</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:451px;">1M Hepes</td>
			<td style="width:123px;">Irvine Scientific</td>
			<td style="width:344px;">9319</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:451px;">200 mM L-Glutamine</td>
			<td style="width:123px;">Cambrex Bio Science</td>
			<td style="width:344px;">17-605E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:451px;">4&#39;,6-diamidino-2-phenylindole, dihydrochloride (DAPI) - FluoroPure grade</td>
			<td style="width:123px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:344px;">D21490</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:451px;">Accutase</td>
			<td style="width:123px;">Innovative Cell Technologies</td>
			<td style="width:344px;">AT104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:451px;">Aldesleukin Proleukin (rhIL-2)</td>
			<td style="width:123px;">Novartis Oncology</td>
			<td style="width:344px;">NDC 0078-0495-61</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Anti-CD137, PE</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555956</td>
			<td>4B4-1</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Anti-CD19, PE-Cy7</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>557835</td>
			<td>SJ25C1</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Anti-CD3, PERCP</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>340663</td>
			<td>SK7</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Anti-CD4, FITC</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>340133</td>
			<td>SK3</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Anti-CD45, PERCP</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>340665</td>
			<td>2D1</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Anti-CD45RO, PE</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>561137</td>
			<td>UCHL1</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Anti-CD62L, APC</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>559772</td>
			<td>DREG-56</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Anti-CD69, APC</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>340560</td>
			<td>L78</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Anti-CD8, APC-Cy7</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>348793</td>
			<td>SK1</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Anti-IL-13, PE</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>340508</td>
			<td>JES10-5A2</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Anti-LAG-3, PE</td>
			<td>eBiosciences</td>
			<td>12-2239-41</td>
			<td>3DS223H</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Anti-PD-1, APC-Cy7</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>329921</td>
			<td>EH12.2H7</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Anti-TIM-3, APC</td>
			<td>eBiosciences</td>
			<td>17-3109-42</td>
			<td>F38-2E2</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:451px;">B-27 Serum-Free Supplement (50X)</td>
			<td style="width:123px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:344px;">17504-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:451px;">Corning 96 Well Clear Flat Bottom Polystyrene TC-Treated Microplates, Individually Wrapped, with Lid, Sterile (Product #3596)</td>
			<td style="width:123px;">Corning Life Sciences</td>
			<td style="width:344px;">3596</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:451px;">Defined fetal bovine serum,HI IR</td>
			<td style="width:123px;">Hyclone Labs</td>
			<td style="width:344px;">SH30070.03IH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:451px;">DMEM F-12 50:50 (1X) w/o Glutamine</td>
			<td style="width:123px;">MediaTech, Inc.</td>
			<td style="width:344px;">15-090-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:451px;">DMEM High Gluc w/o L-Glu, Na Pyr 1 L</td>
			<td style="width:123px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:344px;">11960051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:451px;">DMEM-Ham&#39;s F12 50:50 Mixture with L-glutamine and 15 mM HEPES</td>
			<td style="width:123px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:344px;">MT10092CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:451px;">HBSS</td>
			<td style="width:123px;">Irvine Scientific</td>
			<td style="width:344px;">9224</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:451px;">Heat-Inactivated FCS</td>
			<td style="width:123px;">Hyclone</td>
			<td style="width:344px;">SH30070.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:451px;">Heparin Sodium(1,000 U/ml)</td>
			<td style="width:123px;">American Pharmaceutical</td>
			<td style="width:344px;">401811B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:451px;">MACSQuant</td>
			<td style="width:123px;">Milteni Biotech Inc.</td>
			<td style="width:344px;">BIS013220&#160;</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PBS 1X W/CA &#38; MG</td>
			<td>Irvine Scientific</td>
			<td>9236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:451px;">PBS with 1MM EDTA (No Ca2+ or Mg2+)</td>
			<td style="width:123px;">VWR Scientific Products</td>
			<td style="width:344px;">PB15009A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:451px;">Recombinant human EGF</td>
			<td style="width:123px;">R&#38;D Systems</td>
			<td style="width:344px;">236-EG-200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:451px;">Recombinant human FGF</td>
			<td style="width:123px;">R&#38;D Systems</td>
			<td style="width:344px;">233-FB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:451px;">rhIL-15 Working Dilution (10 ng/&#181;L)</td>
			<td style="width:123px;">CellGenix, US Operations</td>
			<td style="width:344px;">tF0297</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="45">
			<td height="45" style="height:45px;width:451px;">Sodium Azide (NaN3)</td>
			<td style="width:123px;">Sigma</td>
			<td style="width:344px;">S8032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:451px;">Sorvall ST40R</td>
			<td style="width:123px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:344px;">41693700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:451px;">TC-HEPES BUFFER (1M) SOLN 100ML&#160;</td>
			<td style="width:123px;">IRVINE SCIENTIFIC CORP</td>
			<td style="width:344px;">6472</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:451px;">Tecnol Procedure Mask</td>
			<td style="width:123px;">Kimberly-Clark</td>
			<td style="width:344px;">47117</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:451px;">X-VIVO 15</td>
			<td style="width:123px;">Lonza</td>
			<td style="width:344px;">BW04-744Q</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro tumor cell rechallenge for predictive evaluation of chimeric antigen receptor t cell antitumor function

Het gebied van chimeer antigeen receptor (auto) T-celtherapie vordert snel met verbeteringen in auto-ontwerp, de benaderingen van de gen-engineering en productie optimalisaties. Een uitdaging voor deze ontwikkelingsinspanningen, echter is de oprichting van in-vitrotests die krachtig selectie van optimale auto T cel producten voor in vivo therapeutische succes kunnen informeren. Standaard in vitro tumor-lysis testen vaak niet na te denken de ware antitumorale potentieel van de auto T cellen als gevolg van de relatief korte co cultuur tijd en hoge T cel tumor/verhouding. Hier beschrijven we een in vitro co cultuur methode om te evalueren van auto T cel recursieve doden potentieel op hoge tumor cel ladingen. In deze bepaling, op lange termijn cytotoxische functie en proliferatieve capaciteit van auto T cellen wordt onderzocht in vitro meer dan 7 dagen met extra tumor doelen aan de co cultuur om de andere dag toegediend. Deze test kan gepaard gaan met profiling T-cel activatie, uitputting en geheugen fenotypen. Met behulp van deze test, hebben we met succes de functionele en fenotypische verschillen tussen CD4 onderscheiden+ en CD8+ auto T cellen tegen glioblastoma (GBM) cellen, als gevolg van hun verschil in vivo antitumorale activiteit in orthotopic xenograft modellen. Deze methode biedt een facile aanpak te evalueren van auto T cel potentie en te verhelderen de functionele verschillen tussen verschillende auto T cel producten.

Met behulp van de hierboven beschreven test, wij hebben de potentie van de differentiële effector onderscheiden en doden dynamics gemedieerd door CD4+ en CD8+ auto T cellen. De resultaten die hier gepresenteerd illustreren het verschil tussen CD4+ en CD8+ auto T cellen, gegenereerd op basis van een gezonde donor onafhankelijk van onze vorige publicatie21.
Door middel van een standaard degranulatie assay, we waren in staat om te zien dat beide CD4+ en CD8+ auto T cellen even tegen GBM cellen die uitdrukking geven aan de gerichte antigeen, werd geactiveerd, zoals aangegeven door de uitdrukking van CD107a en intracellulaire cytokine (Figuur 2). Echter, met behulp van de repetitieve tumor uitdaging assay, vonden we dat CD4+ maar niet CD8+ auto T cellen tentoongesteld de mogelijkheid meerdere-ronde doden (Figuur 2B). CD4+ auto T cellen ook bereikt betere uitbreiding ten opzichte van CD8 +-cellen tijdens deze test (Figuur 2C). Het verschil van expansie tussen auto T cel subsets zijn alleen waargenomen van D3 na twee rondes van de uitdaging van de tumor (1:12 E:T), terwijl het verschil van cytotoxiciteit werd waargenomen beginnen bij de D5 na drie rondes van tumor uitdaging (1:20 E:T), waaruit blijkt dat op korte termijn tests mislukt ophelderen van verschillen in de sterkte van verschillende auto T cel producten. Wanneer de 1:1 gemengd CD4+ en CD8+ auto T cellen werden toegepast op deze test, ze bleken te overtreffen CD8+ maar niet CD4+ auto T cellen op lange termijn cytotoxiciteit (Figuur 2B). De uitbreiding van CD8+ auto T cellen werd geïnduceerd door de mede toegepaste CD4+ cellen, terwijl CD4+ auto T cel expansie was geremd in aanwezigheid van CD8+ cellen (Figuur 2C).
Om uit te leggen van het mechanisme dat de effector activiteit tussen CD4 onderscheidt+ en CD8+ auto T cellen, we eerst bevestigen dat 24u na eerste mede cultuur, beide CD4+ en CD8+ auto T cellen waren vergelijkbaar geactiveerd (Figuur 3 A). Ondertussen, zoals aangegeven door CD45RO en CD62L expressie, beide CD4+ en CD8+ auto T cellen toonde een overgang van centrale geheugen (CD45RO+, CD62L+) naar effector geheugen (CD45RO+, CD62L-) fenotype tijdens herhaalde tumor uitdaging (Figuur 3B). Dan wij de cellen bij de D3 van deze bepaling gekenmerkt, een tijd voordat de auto T cel subsets begonnen met het weergeven van functioneel verschil. T cel uitputting werd gekenmerkt door de co uitdrukking van remmende receptoren PD-1, LAG-3 en TIM-315,21, waaruit bleek dat CD8+ auto T cellen zijn gevoeliger voor de uitputting in vergelijking met CD4+ auto T cellen () Figuur 3 C). verder geen verschil was te zien op CD8+ auto T uitputting van de cel in de aanwezigheid/afwezigheid van mede toegepaste CD4+ cellen (Figuur 3C), die aangeeft dat CD8 CD4-geïnduceerde+ auto T cel expansie is niet een betere effector functie zijn gekoppeld.
Samen, de resultaten van deze test geïdentificeerd die CD4+ auto T cellen CD8 presteerde beter dan+ cellen specifiek in op de lange termijn cytotoxiciteit. Ondanks de gelijkaardige op korte termijn cytotoxiciteit (1-3 dagen, eenmaal rechallenged), CD4+ auto T cellen aanhoudende effector functie op repetitieve tumor uitdaging, terwijl CD8+ cellen werd uitgeput en nagelaten controle tumor celgroei. Wanneer de twee subsets waren gemengd, CD4+ auto T cellen vergemakkelijkt de expansie van CD8+ auto T cellen, maar de status van de uitputting van CD8+ cellen werden niet verbeterd, resulterend in het gebrek aan synergie-effect tussen de twee groepen. Soortgelijk verschil tussen CD4+ en CD8+ auto T cellen werd gezien in een in vivo model als eerder beschreven21. Inderdaad, CD8+ auto T cellen waren in staat om op korte termijn goedkeuring van de tumor maar gevolgd bemiddelen met antigeen-positief herhaling; in contrast, CD4+ auto T cel behandeling resulteerde in lange termijn tumor uitroeiing21, die doet denken aan hun potentieel van de repetitieve doden met behulp van de herprovocatie in vitro assay.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59275/59275fig1.jpg"> Figuur 1 : Schema en analyse strategie van repetitieve uitdaging assay. (A) Schema en tijdlijn van repetitieve tumor uitdaging assay. Voor elk putje, werden auto T-cellen eerst samen met PBT030-2 GBM cellen (4.000 auto + cellen, 16.000 tumorcellen) gekweekt en opnieuw met 32.000 tumorcellen uitgedaagd om de andere dag (D2, D4 en D6). Analyse van de cel van de tumor en auto T celaantal, evenals auto T cel fenotype wordt uitgevoerd op D1, D3, D5 en D7. (B) vóór de oprichting van de co cultuur Gating strategie om te bepalen van auto % in T cellen. (C) Gating strategie van levende cellen en tumorcellen auto T-cellen van de bepaling herhaalde uitdaging. (D) Tumor cellen nummer op verschillende tijdstippen van de bepaling van de herprovocatie, samen met untransduced T-cellen worden gekweekt. Foutbalken = ±SEM. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59275/59275fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59275/59275fig2.jpg"> Figuur 2 : Terugkerende uitdaging assay onthult verschillen in doden en proliferatieve potentie CD4+ en CD8+ auto T cellen. (A) degranulatie en intracellulaire cytokine kleuring van CD4+ en CD8+ auto T cellen na 5U van co cultuur met GBM cellen (E:T = 1:1). (B) CD4+, CD8+ of gemengd (CD4:CD8 = 1:1) auto T-cellen werden toegepast op repetitieve uitdaging assay en levensvatbare tumorcellen werden gekwantificeerd. p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0.001 vergeleken met CD4+, one-way ANOVA met Bonferroni van meerdere vergelijkingstests. (C) CD4+ en CD8+ auto T cel expansie tijdens herhaalde tumor uitdaging assay. Vergelijking van (links naar rechts) CD4+ vs CD8+, enkele deelverzameling; CD4+ vs CD8+, binnen de "gemengde" groep; CD4+, single vs gemengd; CD8+, single vs gemengd. p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0.001 met behulp van een ongepaard Student t -test. Foutbalken = ±SEM. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59275/59275fig2large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59275/59275fig3.jpg"> Figuur 3 : Analyse van T cel fenotype tijdens herhaalde uitdaging assay. (A) 4-1BB en CD69 vlekken op auto T-cellen bij de D1 van de test. (B) CD45RO en CD62L vlekken van auto T cellen alvorens te herprovocatie assay (input) en op de D3 en D7 van de test. (C) mede expression van PD-1, LAG-3 en TIM-3 op auto T-cellen bij de D3 van de test. (Boven) Gating strategieën T cellen uiten van 1, 2 of 3 remmende receptoren worden geïdentificeerd. (Onder) Vergelijking van: CD4+ cellen (één subset), CD8+ cellen (één subset), CD8+ cellen (binnen de "gemengde" groep). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59275/59275fig3large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Table 1" src="/files/ftp_upload/59275/59275table1.jpg"> Tabel 1: De kaart van de representatieve plaat van herprovocatie setup.

Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Tumor Cell Rechallenge For Predictive Evaluation of Chimeric Antigen Receptor T Cell Antitumor Function at JoVE.com

In Vitro Tumor Cell Rechallenge For Predictive Evaluation of Chimeric Antigen Receptor T Cell Antitumor Function

In Vitro Tumor cel Rechallenge voor voorspellende evaluatie van chimeer antigeen Receptor T cel antitumorale functie

Hier beschrijven we een in vitro co cultuur methode recursief uitdaging tumor-gerichte T-cellen, die het mogelijk voor fenotypische en functionele analyse van antitumorale T cel activiteit maakt.

The field of chimeric antigen receptor (CAR) T cell therapy is rapidly advancing with improvements in CAR design, gene-engineering approaches and ...

Dit protocol biedt een lange termijn, in vitro, functionele methode voor de evaluatie van chimerische antigeenreceptor, of CAR T-cellen, door middel van repetitieve tumorcel uitdaging. Deze techniek is minder tijdrovend, en minder arbeidsintensief dan in vivo CAR T-celfunctie evaluatie, terwijl nog steeds het bereiken van een nauwkeurige weergave van de ware anti-tumor werkzaamheid. Deze in vitro techniek maakt de hoge doorvoer screening en differentiatie van CAR T cel anti-tumor potentie.Die heeft de potentiële toepassing voor het beoordelen van de klinische effectiviteit van CAR T-celproducten. Begin met het scheiden van glioblastoom tumorsferen van een glioblastoom tumorsfeer cultuur. Met een milliliter koude accutase, en 30 tot 60 seconden pipetting.Wanneer de tumorsferen zijn verstoord, stop de reactie met vijf milliliter warm co-cultuurmedium. En pellet de tumorcel suspensies door centrifugatie. Stel de glioblastoomcellen opnieuw op tot een 1,6 keer 10 tot de vijfde tumorcellen per milliliter verse cocultuurmediumconcentratie, en verdun T-cellen geoogst uit een CAR T-celkweek tot het juiste percentage CAR-positieve T-cellen per milliliter co-kweekmediumconcentratie.Voeg vervolgens 100 microliter van de verdunde tumorcellen toe aan elke put van een 96 goed platte bodemweefselcultuurplaat. En 100 microliters van CAR T cellen in elke put van tumorcellen met zachte menging. Plaats de plaat vervolgens in een 37 graden Celsius, 5%koolstofdioxide incubator.Op dag twee, vier en zes van de cultuur, voorzichtig verwijderen 50 microliter van medium uit elke put van de tumorcel, T cel co-cultuur plaat gepland voor rechallenge volgens de tabel. Voeg vervolgens 50 microliters verse glioblastoomcelsuspensie toe, bereid zoals net aangetoond, maar met twee keer het celnummer van de initiële co-cultuur aan elke put met zachte menging. En breng de plaat terug naar de celkweek incubator.Dagen een, drie, vijf, en zeven van co-cultuur, de overdracht van de supernatant van elke put te worden geoogst in een nieuwe 96 goed ronde bodemplaat volgens de tabel en voeg 50 microliter van voorverwarmde 0,5%Trypsin EDTA in elk medium uitgeput goed. Na vijf minuten bij 37 graden Celsius, bevestigen dat de cellen hebben losgemaakt van de bodem van elke put door lichte microscopie, en voorzichtig pipette het enzym oplossing rond de bodem van elke put om de cellen opnieuw tepenpen. Voor het overbrengen van de vrijstaande celsuspensie in de passende overeenkomstige putten van de nieuwe 96 puttenplaat.Pellet de cellen door centrifugatie, en was de cellen met 200 microliter tl van fluorescerende geactiveerde cel sorteren staande oplossing, of FFS per goed met een tweede centrifugatie. Schort de pellets opnieuw op in 100 microliters van de antilichaamcocktail die van belang is voor 100 microliter SSS per put gedurende een incubatie van 30 minuten bij vier graden Celsius. A het einde van de incubatie verwijderen van niet-gebonden antilichaam door sequentiële 100 en 200 microliter FSS wast en opnieuw opschorten van de cellen in 100 tot 200 microliters van DAPI nucleaire vlek en FSS.Analyseer vervolgens de cellen volgens de standaardstroomcytometrische analyseprotocollen. Voor functionele en fenotypische analyse van de CAR T-cellen na tumorcel co-cultuur, haal de gegevensbestanden uit de stroom cytometer, en gate alle levende DAPI negatieve cellen. Om de tumorcellen te kwantificeren, poort de CD45 negatieve populatie.Om de CAR T cellen poort de CD45 positieve CAR positieve bevolking te kwantificeren. Vervolgens plot de tumor en CAR T cel nummers in de loop van de tijd van het experiment, het identificeren van T-cel activering door de co-expressie van 41BB, en CD69. T-celuitputting door de expressie van PD1, LAG3 en TIM3, en de T-celgeheugenstatus LAG3 en TIM3, en de T-celgeheugenstatus door CD45RO en CD62 ligand-expressie.cd45RO en CD62 ligand expressie. Zowel CD4-positieve als CD8-positieve CAR T-cellen worden gelijk geactiveerd tegen glioblastoomcellen die het doelantigenen uitdrukken, zoals aangegeven door hun CD107a- en intracellulaire cytokine-expressie. Echter, zoals beoordeeld door repetitieve tumor uitdaging SA, CD4 positief, maar niet CD8 positief, CAR T cellen zijn in staat om meerdere ronde doden.CD4 positieve CAR T cellen bereiken ook een robuustere uitbreiding. Wanneer CD4 positief, en CD8 positieve CAR T cellen worden gemengd op een een-op-een verhouding, deze cel combinatie uit presteert CD8 positief, maar niet CD4 positieve CAR T cellen in termen van lange termijn cytotoxiciteit. Bovendien wordt de uitbreiding van CD8-positieve CAR T-cellen veroorzaakt door de toevoeging van CD4-positieve T-cellen.Terwijl CD4 positieve CAR T-celuitzetting wordt geremd in aanwezigheid van CDa-positieve cellen. 24 uur na de initiële co-cultuur worden zowel CD4-positieve als CD8-positieve CAR T-cellen op dezelfde manier geactiveerd. Tijdens de repetitieve tumor uitdaging, zowel CD4 positieve en CD8 positieve CAR T cellen tonen een overgang van een CD45RO positieve, CD62 ligan positieve centrale geheugen fenotype, naar een CD45RO positieve CD62 ligan negatieve effector geheugen fenotype.CD8 positieve CAR T cellen zijn ook meer vatbaar voor uitputting in vergelijking met CD4 positieve CAR T cellen zoals beoordeeld door hun PD1, LAG3, en TIM3 expressie na drie dagen van co-cultuur. Verder zijn er geen verschillen waargenomen in CDa-positieve CAR T-celuitputting in de aanwezigheid of afwezigheid van CD4-positieve T-cellen, wat aangeeft dat CD4-geïnduceerde CD8-positieve CAR T-celexpansie niet wordt geassocieerd met een betere effectorfunctie. Dit essay kan ook worden gekoppeld aan het sorteren van de T-cellen vormen de co-cultuur om verdere analyse uit te voeren op transcriptomen, proteomics, en specifieke genen van belang.Deze repetitieve tumor uitdaging kan ook worden gebruikt als een platform voor het onderzoeken van de biologische gebeurtenissen na CAR T cel tumor erkenning.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Target Cell Pre-enrichment and Whole Genome Amplification for Single Cell Downstream Characterization

Target cel pre verrijking en hele genoom versterking voor eencellige Downstream karakterisering

Rare target cells can be isolated from a high background of non-target cells using antibodies specific for surface proteins of target cells. A recently ...

A Syngeneic Mouse B-Cell Lymphoma Model for Pre-Clinical Evaluation of CD19 CAR T Cells

Een Syngeneic B-cel lymfoom muismodel voor pre-klinische evaluatie van CD19 auto T cellen

The astonishing clinical success of CD19 chimeric antigen receptor (CAR) T-cell therapy has led to the approval of two second generation chimeric antigen ...

Real Time Detection of In Vitro Tumor Cell Apoptosis Induced by CD8+ T Cells to Study Immune Suppressive Functions of Tumor-infiltrating Myeloid Cells

Real Time Detection of In Vitro Tumor Cell Apoptosis Induced by CD8+ T Cells to Study Immune Suppressive Functions of Tumor-infiltrating Myeloid Cells

Real-time detectie van In Vitro Tumor cel Apoptosis geïnduceerd door CD8+ T cellen te bestuderen immuun onderdrukkende functies van Tumor-infiltreren myeloïde cellen

Potentiation of the tumor-killing ability of CD8+ T cells in tumors, along with their efficient tumor infiltration, is a key element of successful ...

Flow Cytometric Analysis of Mitochondrial Reactive Oxygen Species in Murine Hematopoietic Stem and Progenitor Cells and MLL-AF9 Driven Leukemia

Flow cytometrische analyse van mitochondriale reactieve zuurstof soorten in Muriene hematopoietische stam en voorlopercellen en MLL-AF9 gedreven leukemie

We present a flow cytometric approach for analyzing mitochondrial ROS in various live bone marrow (BM)-derived stem and progenitor cell populations from ...

Manufacturing Chimeric Antigen Receptor (CAR) T Cells for Adoptive Immunotherapy

Manufacturing Chimeric Antigen Receptor CAR T Cells for Adoptive Immunotherapy

Productie van Chimerische antigeen receptor (auto) T cellen voor adoptie immunotherapie

Adoptive immunotherapy holds promise for the treatment of cancer and infectious disease. We describe a simple approach to transduce primary human T cells ...

Using Human Induced Pluripotent Stem Cells for the Generation of Tumor Antigen-specific T Cells

Met behulp van menselijke geïnduceerde pluripotente stamcellen voor het genereren van tumor-antigeen-specifieke T-cellen

The generation and expansion of functional T cells in vitro can lead to a broad range of clinical applications. One such use is for the treatment of ...

Generation of Orthotopic Pancreatic Tumors and Ex vivo Characterization of Tumor-Infiltrating T Cell Cytotoxicity

Generation of Orthotopic Pancreatic Tumors and Ex vivo Characterization of Tumor-Infiltrating T Cell Cytotoxicity

Generatie van Orthotopic alvleesklier tumoren en ex vivo karakterisering van tumor-Infiltrerende T cel cytotoxiciteit

In vivo models of pancreatic cancer provide invaluable tools for studying disease dynamics, immune infiltration and new therapeutic strategies. The ...

In Vitro Evaluation of Oncogenic Transformation in Human Mammary Epithelial Cells

In Vitro Evaluatie van Oncogene Transformatie in Human Mammary Epithelial Cells

Tumorigenesis is a multi-step process in which cells acquire capabilities&#160;that allow their growth, survival, and dissemination under hostile ...

Dynamic Imaging of Chimeric Antigen Receptor T Cells with [18F]Tetrafluoroborate Positron Emission Tomography/Computed Tomography

Dynamic Imaging of Chimeric Antigen Receptor T Cells with [18F]Tetrafluoroborate Positron Emission Tomography/Computed Tomography

Dynamische beeldvorming van chimere antigeenreceptor T-cellen met [18F]Tetrafluoroboraat positronemissietomografie/computertomografie

T cells genetically engineered to express chimeric antigen receptors (CAR) have shown unprecedented results in pivotal clinical trials for patients with B ...

Evaluation of the In vivo Antitumor Activity of Polyanhydride IL-1&#945; Nanoparticles

Evaluation of the In vivo Antitumor Activity of Polyanhydride IL-1ÃƒÅ½Ã‚Â± Nanoparticles

Evaluatie van de in vivo antitumoractiviteit van polyanhydride IL-1α nanodeeltjes

Cytokine therapy is a promising immunotherapeutic strategy that can produce robust antitumor immune responses in cancer patients. The proinflammatory ...