Name: in vitro tumor cell rechallenge for predictive evaluation of chimeric antigen receptor t cell antitumor function
Uploaded: 2019-02-27T15:00:00
Duration: 8 min 4 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Tumor Cell Rechallenge For Predictive Evaluation of Chimeric Antigen Receptor T Cell Antitumor Function at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet av tilskudd fra California Institutt for regenerativ medisin (CIRM) gi TR3-05641 og NIH tilskudd P30 CA33572 (kjerner). DW støttes av NCI fellesskap 1F99CA234923-01.

Våre IRB krever ikke gjennomgang av denne protokollen. Vi mottar kasserte frisk glioblastom svulst prøver fra byen av håp patologi avdelingen som er kodet, og vårt laboratorium får ikke tilgang til nøkkelen. Vi mottar prøver med data bare tidligere behandling og begrunne ved biopsi/resection, uten identifiserende data.
1. Media forberedelse
<ol><li>Forberede nevrale stamceller medier for dyrking primære GBM linjer: DMEM:F12, 1:50 B27, 5 µg/mL heparin og 2 mmol/L L-glutamin; supplert med 20 ng/mL til epidermal vekstfaktor (EGF) og 20 ng/mL grunnleggende fibroblast vekstfaktor (FGF) to ganger i uken (se Tabell for materiale).</li>
	<li>Forberede T celle medier: X-VIVO 15 inneholder 10% fosterets kalv serum (FCS); supplert med 70 IU/mL rhIL-2 og 0,5 ng/mL rhIL-15 hver 48 h (se Tabell for materiale).</li>
	<li>Forberede co kultur medier: ta nevrale stamceller media uten EGF og FGF supplement, og legge til 10% FCS.</li>
	<li>Forberede FACS flekk løsning (FSS): HBSS, 2% FCS, NaN3 (0,5 g/500 mL).</li>
</ol>2. forberedelse av GBM kreftceller
<ol><li>Høste lav-passasjen GBM svulst kuler (TSs) med sentrifugering på 300 x g for 4 min og kast nedbryting. Merk: GBM tumor kuler (TSs) genereres fra resected svulster som beskrevet tidligere22,23,24, og opprettholdt i nevrale stamceller medier, i inkubatorer med 5% CO2 på 37 ° C.</li>
	<li>Forvarm co kultur medier i et 37 ° C vannbad.</li>
	<li>Legge til 1 mL kaldt accutase GBM TSs distansere TSs av pipettering for 30-60 s og stoppe dissosiasjon ved å legge til 5 mL av varm co kultur medier. Merk: GBM TSs burde ikke være holdt på accutase for mer enn 5 minutter.</li>
	<li>Høste GBM celler med sentrifugering 300 x g for 4 min forkaste nedbryting og resuspend celler i 2 mL co kultur medier.</li>
	<li>Bestemme cellen konsentrasjon bruke en celle levedyktighet teller. Merk: Cellen levedyktighet må > 70%.</li>
</ol>3. forberedelse av bilen T-celler
<ol><li>Mindre enn 24 timer før analysen, tar 100 µL av kultivert bil T-celler i en flow cytometri røret, og legger 2 mL FSS. Merk: BIL T celler ble generert som beskrevet tidligere11,21 og kultivert i T celle medier.</li>
	<li>Sentrifugering på 300 x g 4 min og Forkast nedbryting.</li>
	<li>Legg 2 mL FSS å vaske cellene, sentrifuge 300 x g for 4 min, og forkaste nedbryting.</li>
	<li>Stain cellene med passende antistoff å angi bil uttrykk på 4 ° C i 30 min. Merk: For eksempel hvis en IL13Rα2 målrettede bil beskrevet tidligere25 brukes, så flekker med anti-IL13 antistoff.</li>
	<li>Vask to ganger med 2 mL FSS og analysere bil exn ved hjelp av en flow cytometer.</li>
	<li>Bestemme bil % på T celler ved hjelp av gating strategien som vist i figur 1B.</li>
	<li>På dagen for co kultur, høste alle bil T-celler med sentrifugering 300 x g for 4 min, forkaste nedbryting og resuspend celler i 2 mL co kultur medier.</li>
	<li>Bestemme cellen konsentrasjon bruke en celle levedyktighet teller. Merk: Cellen levedyktighet må > 70%.</li>
</ol>4. Sett opp svulst-T celle co kultur
<ol><li>Fortynne kreftceller til en konsentrasjon av 0,16 millioner/mL med co kultur medier.</li>
	<li>Basert på bilen %, fortynne bil T-celler til en konsentrasjon av 0,04 millioner bilen+ celler/mL med co kultur medier. Merk: For eksempel hvis bilen er 50% og T celle konsentrasjon er 0,4 millioner/mL, så lage en 1:5 fortynning å få den endelige konsentrasjonen av 0,04 millioner bilen+ celler/mL.</li>
	<li>Pipetter 100 µL av utvannet kreftceller i hver brønn av en 96-brønns flat bunn vev kultur plate.</li>
	<li>Pipetter 100 µL av utvannet bil T-celler i hver brønn som inneholder kreftceller og bland godt. Merk: Hver svulst-T celle co kultur vil bli analysert på 4 tidspunkt. 4-6 gjentak kan være nødvendig ved hver gang poeng basert på analyse, men < 3 gjentak per punkt anbefales ikke; se tabell 1 for en representant platemap.</li>
	<li>Vedlikeholde platen i en 37 ° C, 5% CO2 inkubator.</li>
</ol>5. svulst celle Rechallenge
Merk: Rechallenge foregår på 2, 4 og 6 dager post første co kultur oppsettet (figur 1A).
<ol><li>Høste og dissociate GBM TSs som beskrevet ovenfor (trinn 2.1-2.6).</li>
	<li>Resuspend GBM celler i en konsentrasjon av 0.64 millioner/mL.</li>
	<li>Bestemme co kultur brønnene som trenger rechallenge (se tabell 1) og fjern forsiktig 50 µL media fra toppen av hver brønn.</li>
	<li>Legge til 50 µL av GBM celle suspensjon i hver brønn og bland godt, så sette platen tilbake i en 37 ° C, 5% CO2 inkubator.</li>
</ol>6. høste prøver og Flow Cytometric analyse
Merk: Prøver vil bli høstet på 1, 3, 5 og 7 dager post første co kultur stilling, med 1, 2, 3 og 4 runder av svulst utfordring, henholdsvis.
<ol><li>Forvarm 0,05% trypsin-EDTA løsning på 37 ° C waterbath.</li>
	<li>Bestemme brønnene som trenger høsting og overføre media til en ny runde-96-brønns bunnplaten.</li>
	<li>Pipetter 50 µL av trypsin-EDTA i brønnene å fordøye gjenværende kreftceller ved 37 ° C i 5 minutter.</li>
	<li>Under et mikroskop, bekrefte cellene har løsrevet fra bunnen.</li>
	<li>Pipetter rundt godt bunnen resuspend frittliggende celler, og deretter overføre trypsin-EDTA som inneholder frittstående cellene tilsvarende fordelt i 96-brønnen runde-bunnplaten.</li>
	<li>Sentrifuger runde-96-brønns bunnplaten på 300 x g, 4 ° C i 4 minutter, deretter kaste nedbryting.</li>
	<li>Legg 200 µL/godt av FSS å vaske celler, sentrifuger 300 x g, 4 ° C i 4 min, så kast nedbryting.</li>
	<li>Resuspend celler i 100 µL/vel FSS inneholder antistoffer (se Tabell for materiale), og flekken celler ved 4 ° C i 30 min.</li>
	<li>Legg 100 µL/vel FSS celler, sentrifuge på 300 x g, 4 ° C i 4 minutter, deretter Forkast nedbryting.</li>
	<li>Legg 200 µL/godt av FSS å vaske celler, sentrifuger 300 x g, 4 ° C i 4 min, så kast nedbryting.</li>
	<li>Resuspend celler med 100-200 µL/godt av FSS med 500 ng/mL DAPI, og deretter analysere prøver av flowcytometri.</li>
</ol>7. funksjonelle og Phen Otypic analyse av bilen T-celler
<ol><li>Hente datafilene fra flyt cytometer og gate alle live (DAPI-) celler (figur 1C).</li>
	<li>Kvantifisere kreftceller av gating CD45- befolkning og bil T celler av gating CD45+, bil + befolkningen (figur 1C). Merk: Hvis kreftceller uttrykke CD45 (f.eks Raji lymfom celler), anti-CD3 flekker kan brukes til å skille T celler fra kreftceller.</li>
	<li>Tegn svulst celle og bil T celle nummer gjennom tiden.</li>
	<li>Identifisere T celle aktivering av co uttrykket av 4-1BB og CD69. Merk: Disse overflate markører kan brukes til å analysere T celle aktivering 6-24 h innlegget første co kultur.</li>
	<li>Identifisere T celle konsumpsjon av uttrykket av PD-1, LAG-3 og TIM-3.</li>
	<li>Identifisere T celle Minnestatus ved uttrykk for CD45RO og CD62L.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Porter, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chimeric+antigen+receptor+T+cells+persist+and+induce+sustained+remissions+in+relapsed+refractory+chronic+lymphocytic+leukemia.">Chimeric antigen receptor T cells persist and induce sustained remissions in relapsed refractory chronic lymphocytic leukemia.</a> Science Translational Medicine. 7 (303), (2015).</li><li>Brentjens, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD19-targeted+T+cells+rapidly+induce+molecular+remissions+in+adults+with+chemotherapy-refractory+acute+lymphoblastic+leukemia.">CD19-targeted T cells rapidly induce molecular remissions in adults with chemotherapy-refractory acute lymphoblastic leukemia.</a> Science Translational Medicine. 5 (177), (2013).</li><li>Grupp, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chimeric+antigen+receptor-modified+T+cells+for+acute+lymphoid+leukemia.">Chimeric antigen receptor-modified T cells for acute lymphoid leukemia.</a> The New England Journal of Medicine. 368 (16), 1509-1518 (2013).</li><li>Lee, D. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cells+expressing+CD19+chimeric+antigen+receptors+for+acute+lymphoblastic+leukaemia+in+children+and+young+adults:+a+phase+1+dose-escalation+trial.">T cells expressing CD19 chimeric antigen receptors for acute lymphoblastic leukaemia in children and young adults: a phase 1 dose-escalation trial.</a> The Lancet. 385 (9967), 517-528 (2015).</li><li>Yong, C. S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CAR+T-cell+therapy+of+solid+tumors.">CAR T-cell therapy of solid tumors.</a> Immunology and Cell Biology. 95 (4), 356-363 (2017).</li><li>Barrett, D. M., Singh, N., Porter, D. L., Grupp, S. A., June, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chimeric+antigen+receptor+therapy+for+cancer.">Chimeric antigen receptor therapy for cancer.</a> Annual Review of Medicine. 65, 333-347 (2014).</li><li>Priceman, S. J., Forman, S. J., Brown, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Smart+CARs+engineered+for+cancer+immunotherapy.">Smart CARs engineered for cancer immunotherapy.</a> Current Opinion in Oncology. 27 (6), 466-474 (2015).</li><li>Fesnak, A. D., June, C. H., Levine, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineered+T+cells:+the+promise+and+challenges+of+cancer+immunotherapy.">Engineered T cells: the promise and challenges of cancer immunotherapy.</a> Nature Reviews Cancer. 16 (9), 566-581 (2016).</li><li>Esensten, J. H., Bluestone, J. A., Lim, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+Therapeutic+T+Cells:+From+Synthetic+Biology+to+Clinical+Trials.">Engineering Therapeutic T Cells: From Synthetic Biology to Clinical Trials.</a> Annual Review of Pathology. 12, 305-330 (2017).</li><li>Lim, W. A., June, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Principles+of+Engineering+Immune+Cells+to+Treat+Cancer.">The Principles of Engineering Immune Cells to Treat Cancer.</a> Cell. 168 (4), 724-740 (2017).</li><li>Brown, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+IL13Ralpha2-Targeted+Chimeric+Antigen+Receptor+T+Cells+for+Improved+Anti-tumor+Efficacy+against+Glioblastoma.">Optimization of IL13Ralpha2-Targeted Chimeric Antigen Receptor T Cells for Improved Anti-tumor Efficacy against Glioblastoma.</a> Molecular Therapy. , (2017).</li><li>Long, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=4-1BB+costimulation+ameliorates+T+cell+exhaustion+induced+by+tonic+signaling+of+chimeric+antigen+receptors.">4-1BB costimulation ameliorates T cell exhaustion induced by tonic signaling of chimeric antigen receptors.</a> Nature Medicine. 21 (6), 581-590 (2015).</li><li>Cherkassky, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+CAR+T+cells+with+cell-intrinsic+PD-1+checkpoint+blockade+resist+tumor-mediated+inhibition.">Human CAR T cells with cell-intrinsic PD-1 checkpoint blockade resist tumor-mediated inhibition.</a> The Journal of Clinical Investigation. 126 (8), 3130-3144 (2016).</li><li>Priceman, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Co-stimulatory+signaling+determines+tumor+antigen+sensitivity+and+persistence+of+CAR+T+cells+targeting+PSCA++metastatic+prostate+cancer.">Co-stimulatory signaling determines tumor antigen sensitivity and persistence of CAR T cells targeting PSCA+ metastatic prostate cancer.</a> Oncoimmunology. 7 (2), 1380764 (2018).</li><li>Eyquem, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+a+CAR+to+the+TRAC+locus+with+CRISPR/Cas9+enhances+tumour+rejection.">Targeting a CAR to the TRAC locus with CRISPR/Cas9 enhances tumour rejection.</a> Nature. 543 (7643), 113-117 (2017).</li><li>Gattinoni, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acquisition+of+full+effector+function+in+vitro+paradoxically+impairs+the+in+vivo+antitumor+efficacy+of+adoptively+transferred+CD8++T+cells.">Acquisition of full effector function in vitro paradoxically impairs the in vivo antitumor efficacy of adoptively transferred CD8+ T cells.</a> The Journal of Clinical Investigation. 115 (6), 1616-1626 (2005).</li><li>Malandro, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonal+Abundance+of+Tumor-Specific+CD4(+)+T+Cells+Potentiates+Efficacy+and+Alters+Susceptibility+to+Exhaustion.">Clonal Abundance of Tumor-Specific CD4(+) T Cells Potentiates Efficacy and Alters Susceptibility to Exhaustion.</a> Immunity. 44 (1), 179-193 (2016).</li><li>Gattinoni, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt+signaling+arrests+effector+T+cell+differentiation+and+generates+CD8++memory+stem+cells.">Wnt signaling arrests effector T cell differentiation and generates CD8+ memory stem cells.</a> Nature Medicine. 15 (7), 808-813 (2009).</li><li>Klebanoff, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Central+memory+self/tumor-reactive+CD8++T+cells+confer+superior+antitumor+immunity+compared+with+effector+memory+T+cells.">Central memory self/tumor-reactive CD8+ T cells confer superior antitumor immunity compared with effector memory T cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (27), 9571-9576 (2005).</li><li>Gattinoni, L., Klebanoff, C. A., Restifo, N. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paths+to+stemness:+building+the+ultimate+antitumour+T+cell.">Paths to stemness: building the ultimate antitumour T cell.</a> Nature Reviews Cancer. 12 (10), 671-684 (2012).</li><li>Wang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glioblastoma-targeted+CD4++CAR+T+cells+mediate+superior+antitumor+activity.">Glioblastoma-targeted CD4+ CAR T cells mediate superior antitumor activity.</a> JCI Insight. 3 (10), (2018).</li><li>Kahlon, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+recognition+and+killing+of+glioblastoma+multiforme+by+interleukin+13-zetakine+redirected+cytolytic+T+cells.">Specific recognition and killing of glioblastoma multiforme by interleukin 13-zetakine redirected cytolytic T cells.</a> Cancer Research. 64 (24), 9160-9166 (2004).</li><li>Brown, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recognition+and+killing+of+brain+tumor+stem-like+initiating+cells+by+CD8++cytolytic+T+cells.">Recognition and killing of brain tumor stem-like initiating cells by CD8+ cytolytic T cells.</a> Cancer Research. 69 (23), 8886-8893 (2009).</li><li>Lee, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+stem+cells+derived+from+glioblastomas+cultured+in+bFGF+and+EGF+more+closely+mirror+the+phenotype+and+genotype+of+primary+tumors+than+do+serum-cultured+cell+lines.">Tumor stem cells derived from glioblastomas cultured in bFGF and EGF more closely mirror the phenotype and genotype of primary tumors than do serum-cultured cell lines.</a> Cancer Cell. 9 (5), 391-403 (2006).</li><li>Brown, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regression+of+Glioblastoma+after+Chimeric+Antigen+Receptor+T-Cell+Therapy.">Regression of Glioblastoma after Chimeric Antigen Receptor T-Cell Therapy.</a> The New England Journal of Medicine. 375 (26), 2561-2569 (2016).</li><li>Salter, A. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphoproteomic+analysis+of+chimeric+antigen+receptor+signaling+reveals+kinetic+and+quantitative+differences+that+affect+cell+function.">Phosphoproteomic analysis of chimeric antigen receptor signaling reveals kinetic and quantitative differences that affect cell function.</a> Science Signaling. 11 (544), (2018).</li><li>Rossi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preinfusion+polyfunctional+anti-CD19+chimeric+antigen+receptor+T+cells+are+associated+with+clinical+outcomes+in+NHL.">Preinfusion polyfunctional anti-CD19 chimeric antigen receptor T cells are associated with clinical outcomes in NHL.</a> Blood. 132 (8), 804-814 (2018).</li><li>Garcia-Diaz, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interferon+Receptor+Signaling+Pathways+Regulating+PD-L1+and+PD-L2+Expression.">Interferon Receptor Signaling Pathways Regulating PD-L1 and PD-L2 Expression.</a> Cell Reports. 19 (6), 1189-1201 (2017).</li><li>Walker, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+Antigen+and+Receptor+Densities+Regulate+Efficacy+of+a+Chimeric+Antigen+Receptor+Targeting+Anaplastic+Lymphoma+Kinase.">Tumor Antigen and Receptor Densities Regulate Efficacy of a Chimeric Antigen Receptor Targeting Anaplastic Lymphoma Kinase.</a> Molecular Therapy. 25 (9), 2189-2201 (2017).</li><li>Fraietta, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determinants+of+response+and+resistance+to+CD19+chimeric+antigen+receptor+(CAR)+T+cell+therapy+of+chronic+lymphocytic+leukemia.">Determinants of response and resistance to CD19 chimeric antigen receptor (CAR) T cell therapy of chronic lymphocytic leukemia.</a> Nature Medicine. 24 (5), 563-571 (2018).</li><li>Fraietta, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disruption+of+TET2+promotes+the+therapeutic+efficacy+of+CD19-targeted+T+cells.">Disruption of TET2 promotes the therapeutic efficacy of CD19-targeted T cells.</a> Nature. 558 (7709), 307-312 (2018).</li></ol>

BIL Konstruer beskrevet i dette arbeidet er lisensiert av Mustang Bio., Inc., som S.J.F. og C.E.B. får royaltybetalinger. Alle andre forfattere erklære noen mulige interessekonflikter.

Denne repeterende svulst celle utfordring analysen gir en praktisk tilnærming for å evaluere bil T celle funksjonell styrke, med en i vitro oppsett som viser høy svulst byrden knyttet i vivo svulst modeller. Under dette 7-dagers analysen, bil T celler gjennomgå fire runder av svulst utfordring (første co kultur og 3 x rechallenge), skape et miljø der utmattet T celler kan miste deres evne å svare svulst utfordringen til tross for en potent første reaksjon. Svulst celle eliminering og bil T celleutvidelse representerer to grunnleggende readouts som kan erverves fra denne analysen, mens fenotyper bil T celler lett kan analyseres av flekker overflaten eller intracellulær indikatorer som angir T celle aktivering, utmattelse og/eller minne. Denne analysen er også praktisk å kombinere med ikke-partisk analyse av bilen T celler transcriptome, proteom eller fosfor-proteom21,26og T celle polyfunctionality som er vedtatt for å forutsi kliniske svar27. Videre kan kreftceller også være testet for deres adaptive responsen mot T celle immunitet som cytokin sekresjon28. Siden prøver høstes ved flere tidspunkt, kan denne analysen for ikke bare statiske, men også dynamisk analyse av bilen T celle atferd når du svarer på overskytende antall kreftceller.
Analysen er spesielt kraftig i sammenligne effektor styrken av bilen T-celler målretting samme antigen, men med forskjellige design og/eller produksjonsprosesser. Vi har brukt denne analysen identifisere at CD4+ bil T celler klarte å megle overlegen langsiktige effektor funksjon enn CD8+ celler21. Det ble også vist at i vivo bil effekten var korrelert med cytotoksisitet på senere tidspunkt (D5-D7) under denne analysen, fremhever videre bruk av repeterende svulst utfordring for i vitro bil T celle evaluering. Selv om GBM celler ble brukt som eksempel på målcellene her, kan denne analysen lett vedtatt å en annen T celle-svulst kombinasjon. Spesielt kan bil T celle atferd også variere på forskjellige antigen tettheter og engineering kreftceller uttrykke ulike nivåer av målrettet antigener gitt verktøyet for å undersøke sekvensiell molekylære hendelsene på bilen anerkjennelse29. Derfor kan denne analysen også utnyttes for å undersøke aktivisering mønsteret av visse bil T-celler mot forskjellige mål.
Siden målet cellen levedyktighet og bil T celleutvidelse to forhånd readouts av denne analysen, er det viktig at alle co kulturer starter med levedyktig (> 70%) svulsten og T celler. Når du utfører rechallenge prosesser, bør handlingen av aspirating media (trinn 5.3) ikke forstyrr svulsten og T celler i bunnen av brønnene, for ikke å introdusere unødvendige varianter av celler teller. Når du utfører denne analysen på suspensjon målet cellelinjer, anbefales det å høste gjenværende celler med sentrifugering før svulst celle rechallenge.
En begrensning av denne analysen er at oppsettparameterne (E:T prosenter første co kultur-og rechallenge) må justeres basert på forskjellige bil-svulst kombinasjoner. For eksempel hvis kreftceller uttrykke en betydelig grad av immuno-hemmende molekyler (f.eks PD-L1), høyere E:T forholdet anbefales gitt at samlet drepe effektivitet er svekket sammenlignet med PD-L1-lav kreftceller. Før du bruker analysen på nye bil-svulst kombinasjoner, en pilotstudie er anbefalt å bestemme de optimale forholdene, som vanligvis gir de mest potente bil T cellene testet i analysen å eliminere > 80% av kreftceller på sluttpunktet. Siden direkte celle-celle kontakt er nødvendig for T celle-mediert drapet på bilen, hvis kreftceller fluorescens-merket, deretter panel av flyt cytometric analyse må bli justert tilsvarende (f.eks hvis kreftceller var GFP-merket, deretter noe FITC-konjugerte antistoffer bør ikke brukes).
Klinisk aktiviteten av bilen T-celler mot B-cell malignancies har ført til to FDA-godkjent narkotika. Men har svaret vist betydelig variasjon over pasienter27,30,31, som var belyst for å korrelere med fenotypiske egenskapene til bilen produkter30. Denne i vitro repeterende svulst utfordring analysen videre gir en tilnærming for å funksjonelt teste bilen effektor styrken i tillegg til fenotypiske karakteristikkene og polyfunctionality cytokiner produksjonen, og tillater høyere gjennomstrømming screening av klinisk produkter i forhold til i vivo svulst modeller samtidig beholde prediktiv gjengivelsen. Samlet kan denne analysen brukes for T celle Funksjonstesten for bil T celle design, prekliniske og kliniske utvikling.

Immunterapi bruker chimeric antigen reseptor (bil)-konstruert T celler har sett lovende resultater mot B cell malignancies1,2,3,4, mens potensialet for målretting andre svulster fortsetter å være under strenge etterforskningen5,6,7. Stor fremgang har blitt gjort å optimalisere bil konstruksjon, produksjonsprosessen og pasienten før infusjonen regimer6,7,8, og romanen syntetisk biologi tilnærminger forventes å øke deres utholdenhet, sikkerhet og svulst spesifisitet9,10. Men har det vært vanskelig og arbeidskrevende til riktig vurdere terapeutiske potensialet i bilen T celler for å lede det beste valget for klinisk oversettelse. Den mest etablerte modellen så langt for å evaluere bil T celle-funksjonen er i immunodeficient mus bærer menneskelig svulst xenografts, der bilen T celler er undersøkt for antitumor effekt og sammenlignet på titrerte celle doser11,12 , 13 , 14 , 15. disse i vivo murine studiene er arbeidskrevende og tidkrevende, særlig når screening stort antall parametere. Videre, i vivo studier kan dempes av tilgjengeligheten av musen stammer, dyr omsorg fasiliteter og dyr behandling teknikker. Derfor er det behov for å utvikle mer praktisk in vitro analyser muliggjør rask readouts effektor aktivitet, som også trofast reflekterer i vivo antitumor funksjonen til disse T-celler.
Konvensjonelle metoder for å bestemme cytotoksisitet T celler i vitro har fokusert på deteksjon av omfatter degranulering, cytokin produksjon og muligheten til å lyse radioisotop-merket målcellene (dvs. krom utgivelsen analyser). Mens disse analyser er informativ for bil T celle spesifisitet og Omdirigert målet anerkjennelse, unnlater de ofte å reflektere i vivo antitumor potensial utviklet T celler12,13,16. I enkelte tilfeller i vitro viste drepe aktivitet i kortsiktige analyser en invers korrelasjon med i vivo antitumor funksjonen16. Slike uoverensstemmelser er sannsynligvis resultatet av høy effektor: mål (E:T) prosenter brukes i disse in vitro analyser og derfor manglende evne til å skille bil T celle produkter som er tilbøyelige til utmattelse17. Derimot under i vivo svulst fjerning T reagerer cellene vanligvis mot stor svulst byrder, og dermed krever flere runder med drap og deretter kjøre T celle differensiering og utmattelse18,19, 20, som er en av de største hindringene mot effektive svulst godkjennes av bilen T celler12,13. I mellomtiden, de fleste kortsiktige i vitro drapet analyser også gjøre ikke avlesning forskjeller i T celle spredning, mens i bilen T celle behandlet pasienter kapasiteten for bil T celleutvidelse er sterkt korrelert med kliniske svar4. Dermed riktig i vitro analysen måtte recapitulate for høy svulst byrden, induksjon av T celle utmattelse, og tillater avlesning av T celle ekspansjon.
Her beskriver vi en strategi for å evaluere bil T celler for repeterende svulst drepe potensial, med en enkel i vitro co kultur analysen. Ulike T-celler effektor aktivitet parametere kan samtidig undersøkes, inkludert målet cellen drapet, bil T celleutvidelse og minne - eller utmattelse-assosiert fenotyper. Resultatene fra denne analysen korrelerer med i vivo antitumor effekten av bilen T-celler, og kan utnyttes for å vurdere styrken på bilen T celle produkter. Mens vi beskriver en analyse for å vurdere IL13Ra2-målrettet bil T-celler mot primære GBM linjer21, kan det lett tilpasses enhver bil T celle plattform.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1084px;" width="1083">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:451px;">0.05% Trypsin/0.53mM EDTA in HBSS w/o Calcium and Magnesium</td>
			<td style="width:123px;">Corning</td>
			<td style="width:344px;">MT25051CI</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:451px;">1M Hepes</td>
			<td style="width:123px;">Irvine Scientific</td>
			<td style="width:344px;">9319</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:451px;">200 mM L-Glutamine</td>
			<td style="width:123px;">Cambrex Bio Science</td>
			<td style="width:344px;">17-605E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:451px;">4&#39;,6-diamidino-2-phenylindole, dihydrochloride (DAPI) - FluoroPure grade</td>
			<td style="width:123px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:344px;">D21490</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:451px;">Accutase</td>
			<td style="width:123px;">Innovative Cell Technologies</td>
			<td style="width:344px;">AT104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:451px;">Aldesleukin Proleukin (rhIL-2)</td>
			<td style="width:123px;">Novartis Oncology</td>
			<td style="width:344px;">NDC 0078-0495-61</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Anti-CD137, PE</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555956</td>
			<td>4B4-1</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Anti-CD19, PE-Cy7</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>557835</td>
			<td>SJ25C1</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Anti-CD3, PERCP</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>340663</td>
			<td>SK7</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Anti-CD4, FITC</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>340133</td>
			<td>SK3</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Anti-CD45, PERCP</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>340665</td>
			<td>2D1</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Anti-CD45RO, PE</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>561137</td>
			<td>UCHL1</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Anti-CD62L, APC</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>559772</td>
			<td>DREG-56</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Anti-CD69, APC</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>340560</td>
			<td>L78</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Anti-CD8, APC-Cy7</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>348793</td>
			<td>SK1</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Anti-IL-13, PE</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>340508</td>
			<td>JES10-5A2</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Anti-LAG-3, PE</td>
			<td>eBiosciences</td>
			<td>12-2239-41</td>
			<td>3DS223H</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Anti-PD-1, APC-Cy7</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>329921</td>
			<td>EH12.2H7</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Anti-TIM-3, APC</td>
			<td>eBiosciences</td>
			<td>17-3109-42</td>
			<td>F38-2E2</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:451px;">B-27 Serum-Free Supplement (50X)</td>
			<td style="width:123px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:344px;">17504-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:451px;">Corning 96 Well Clear Flat Bottom Polystyrene TC-Treated Microplates, Individually Wrapped, with Lid, Sterile (Product #3596)</td>
			<td style="width:123px;">Corning Life Sciences</td>
			<td style="width:344px;">3596</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:451px;">Defined fetal bovine serum,HI IR</td>
			<td style="width:123px;">Hyclone Labs</td>
			<td style="width:344px;">SH30070.03IH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:451px;">DMEM F-12 50:50 (1X) w/o Glutamine</td>
			<td style="width:123px;">MediaTech, Inc.</td>
			<td style="width:344px;">15-090-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:451px;">DMEM High Gluc w/o L-Glu, Na Pyr 1 L</td>
			<td style="width:123px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:344px;">11960051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:451px;">DMEM-Ham&#39;s F12 50:50 Mixture with L-glutamine and 15 mM HEPES</td>
			<td style="width:123px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:344px;">MT10092CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:451px;">HBSS</td>
			<td style="width:123px;">Irvine Scientific</td>
			<td style="width:344px;">9224</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:451px;">Heat-Inactivated FCS</td>
			<td style="width:123px;">Hyclone</td>
			<td style="width:344px;">SH30070.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:451px;">Heparin Sodium(1,000 U/ml)</td>
			<td style="width:123px;">American Pharmaceutical</td>
			<td style="width:344px;">401811B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:451px;">MACSQuant</td>
			<td style="width:123px;">Milteni Biotech Inc.</td>
			<td style="width:344px;">BIS013220&#160;</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PBS 1X W/CA &#38; MG</td>
			<td>Irvine Scientific</td>
			<td>9236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:451px;">PBS with 1MM EDTA (No Ca2+ or Mg2+)</td>
			<td style="width:123px;">VWR Scientific Products</td>
			<td style="width:344px;">PB15009A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:451px;">Recombinant human EGF</td>
			<td style="width:123px;">R&#38;D Systems</td>
			<td style="width:344px;">236-EG-200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:451px;">Recombinant human FGF</td>
			<td style="width:123px;">R&#38;D Systems</td>
			<td style="width:344px;">233-FB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:451px;">rhIL-15 Working Dilution (10 ng/&#181;L)</td>
			<td style="width:123px;">CellGenix, US Operations</td>
			<td style="width:344px;">tF0297</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="45">
			<td height="45" style="height:45px;width:451px;">Sodium Azide (NaN3)</td>
			<td style="width:123px;">Sigma</td>
			<td style="width:344px;">S8032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:451px;">Sorvall ST40R</td>
			<td style="width:123px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:344px;">41693700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:451px;">TC-HEPES BUFFER (1M) SOLN 100ML&#160;</td>
			<td style="width:123px;">IRVINE SCIENTIFIC CORP</td>
			<td style="width:344px;">6472</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:451px;">Tecnol Procedure Mask</td>
			<td style="width:123px;">Kimberly-Clark</td>
			<td style="width:344px;">47117</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:451px;">X-VIVO 15</td>
			<td style="width:123px;">Lonza</td>
			<td style="width:344px;">BW04-744Q</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro tumor cell rechallenge for predictive evaluation of chimeric antigen receptor t cell antitumor function

Feltet chimeric antigen reseptor (bil) T cellen terapi er raskt fremrykkende med forbedringer i bildesign, gen-engineering tilnærminger og produksjon optimaliseringer. En utfordring for disse utvikling innsats, men har vært etableringen av in vitro analyser som kan robust informere utvalg av optimal bil T celle produktene for i vivo terapeutiske suksess. Standard i vitro svulst-lysis analyser unnlater ofte å reflektere hva ekte antitumor bil T-celler på grunn av relativt kort co kultur og høy T celle tumor forhold. Her beskriver vi en i vitro co kultur metode for å vurdere bil T celle rekursiv drepe potensial på høy svulst celle laster. I denne analysen, langsiktig cytotoksiske funksjon og proliferativ kapasitet på bilen T celler er undersøkt i vitro over 7 dager med ekstra svulst mål administrert til co kultur annenhver dag. Denne analysen kan være kombinert med profilering T celle aktivering, utmattelse og minne fenotyper. Bruker denne analysen, har vi klarer utmerket funksjonelle og fenotypiske forskjellene mellom CD4+ og CD8+ bil T celler mot glioblastom (GBM) celler, som reflekterer deres differensial i vivo antitumor aktivitet i orthotopic xenograft modeller. Denne metoden gir en lettvinte tilnærming å vurdere bil T celle styrke og å belyse de funksjonelle variantene over ulike bilen T celle produkter.

Bruke analysen beskrevet ovenfor, vi har utmerket differensial effektor styrken og drepe dynamics formidlet av CD4+ og CD8+ bil T celler. Resultatene presenteres her viser forskjellen mellom CD4+ og CD8+ bil T celler, generert fra en frisk donor uavhengig av vår forrige publikasjonen21.
Gjennom en standard omfatter degranulering analysen, kunne vi observere som begge CD4+ og CD8+ bil T celler ble like aktivert mot GBM celler som uttrykker målrettet antigen, som indikert av uttrykk for CD107a og intracellulær cytokin (Figur 2A). Imidlertid bruker repeterende svulst utfordring analysen, vi fant at CD4+ men ikke CD8+ bil T celler utstilt evnen til flere-runde drapet (figur 2B). CD4+ bil T celler også oppnådd bedre ekspansjon i forhold til CD8 + celler under denne analysen (figur 2C). Forskjellen på utvidelse mellom bil T celle undergrupper ble kun observert fra D3 etter to runder av svulst utfordring (1:12 E:T), mens forskjellen på cytotoksisitet ble observert begynnelsen på D5 etter tre runder av svulst utfordring (1:20 E:T), som angir at kortsiktige analyser kunne belyse forskjeller i styrken på forskjellige bil T celle produkter. Når 11: blandet CD4+ og CD8+ bil T celler ble brukt til denne analysen, de ble funnet for å utkonkurrere CD8+ men ikke CD4+ bil T celler på langsiktige cytotoksisitet (figur 2B). Utvidelse av CD8+ bil T celler ble indusert ved co anvendt CD4+ celler, mens CD4+ bil T celleutvidelse var hemmet i nærvær av CD8+ celler (figur 2C).
Å forklare mekanismen som skiller effektor aktiviteten mellom CD4+ og CD8+ bil T celler, vi først bekrefte at 24 timer etter første co kultur, både CD4+ og CD8+ bil T celler var sammenlignbare aktivert (Figur 3 A). I mellomtiden, som indikert av CD45RO og CD62L uttrykk, begge CD4+ og CD8+ bil T celler viste en overgang fra sentrale minne (CD45RO+, CD62L+) effektor minne (CD45RO+, CD62L-) fenotypen under repeterende svulst challenge (Figur 3B). Så vi preget cellene på D3 av denne analysen, en tid før bilen T celle undergrupper begynte å vise funksjonell forskjell. T celle utmattelse var preget av co uttrykk for hemmende reseptorer PD-1, LAG-3 og TIM-315,21, som viste at CD8+ bil T celler ble mer utsatt for utmattelse sammenlignet med CD4+ bil T celler () Figur 3 C). videre ingen forskjell ble sett på CD8+ bil T celle konsumpsjon i tilstedeværelse/fravær av co anvendt CD4+ celler (Figur 3C), som indikerer at CD4-indusert CD8+ bil T celleutvidelse er ikke knyttet til en bedre effektor funksjon.
Sammen resultatene fra denne analysen identifiserte at CD4+ bil T celler oppnådd CD8+ celler spesielt i langsiktig cytotoksisitet. Til tross for det lignende kortsiktige cytotoksisitet (1-3 dager, når rechallenged), CD4+ bil T celler vedvarende effektor funksjon ved repeterende svulst utfordring, mens CD8+ celler ble utmattet og kunne kontrollere svulst cellevekst. Når de to undergrupper ble blandet, CD4+ bil T celler tilrettelagt utvidelse av CD8+ bil T celler, men utmattelse status CD8+ celler var ikke ameliorated, noe som resulterer i mangel på synergistisk effekt mellom de to gruppene. Lignende forskjellen mellom CD4+ og CD8+ bil T celler ble sett i en i vivo modell som beskrevet tidligere21. Faktisk CD8+ bil T celler klarte å megle kortsiktige svulst klaring men fulgt med antigen-positive regelmessighet; i kontrast, CD4+ bil T cellen behandling resulterte i langsiktig svulst fjerning21, som er deres repeterende drapet potensialet ved hjelp i vitro rechallenge analysen.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59275/59275fig1.jpg"> Figur 1 : Skjema og analyse strategi for repeterende utfordring analysen. (A) skjema og tidslinjen repeterende svulst utfordring analysen. For hver brønn, ble bil T celler først co kultivert med PBT030-2 GBM celler (4000 bil + celler, 16000 kreftceller) og nytt utfordret med 32 000 kreftceller annenhver dag (D2, D4 og D6). Analyse av svulst celle og bil T celle nummer, samt bil T celle fenotypen utføres på D1, D3, D5 og D7. (B) Gating strategi for å finne bilen % i T celler før du oppretter co kulturen. (C) Gating strategi lever celler og kreftceller bil T celler fra repeterende utfordring analysen. (D) Tumor celler tall på ulike tider av rechallenge analysen, co kultivert med untransduced T-celler. Feilfelt = ±SEM. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59275/59275fig1large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59275/59275fig2.jpg"> Figur 2 : Repeterende utfordring analysen avdekker forskjeller i drapet og proliferativ styrke mellom CD4+ og CD8+ bil T celler. (A) omfatter degranulering og intracellulær cytokin flekker av CD4+ og CD8+ bil T celler etter 5t co kultur med GBM celler (E:T = 1:1). (B) CD4+, CD8+ eller blandet (CD4:CD8 = 1:1) bil T celler ble brukt til repeterende utfordring analysen og levedyktig kreftceller kvantifisert. p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001 sammenlignet med CD4+, med enveis ANOVA Bonferronis flere sammenligning tester. (C) CD4+ og CD8+ bil T celleutvidelse under repeterende svulst utfordring analysen. Sammenligning av (venstre) CD4+ vs CD8+, enkelt subset; CD4+ vs CD8+, innen "blandete" gruppen; CD4+, enkelt vs blandet; CD8+, enkelt vs blandet. p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001 bruker en kort Student t -test. Feilfelt = ±SEM. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59275/59275fig2large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59275/59275fig3.jpg"> Figur 3 : Analyse av T celle fenotypen under repeterende utfordring analysen. (A) 4-1BB og CD69 flekker på bilen T-celler på D1 til analysen. (B) CD45RO og CD62L farging av bilen T-celler før du rechallenge analysen (inndata), og på D3 og D7 til analysen. (C) co uttrykk av PD-1, LAG-3 og TIM-3 på bilen T-celler på D3 til analysen. (Øverst) Gating strategier for å identifisere T celler uttrykke 1, 2 eller 3 hemmende reseptorer. (Nederst) Sammenligning av: CD4+ celler (enkelt subset), CD8+ celler (enkelt subset), CD8+ celler (innen gruppen "blandete"). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59275/59275fig3large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Table 1" src="/files/ftp_upload/59275/59275table1.jpg"> Tabell 1: Representant plate kart over rechallenge oppsett.

Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Tumor Cell Rechallenge For Predictive Evaluation of Chimeric Antigen Receptor T Cell Antitumor Function at JoVE.com

In Vitro Tumor Cell Rechallenge For Predictive Evaluation of Chimeric Antigen Receptor T Cell Antitumor Function

I Vitro svulst celle Rechallenge For prediktiv evaluering av Chimeric Antigen reseptor T celle Antitumor funksjon

Her beskriver vi en i vitro co kultur metode rekursivt utfordring svulst målrettede T celler, som tillater fenotypiske og funksjonell analyse av antitumor T celle aktivitet.

The field of chimeric antigen receptor (CAR) T cell therapy is rapidly advancing with improvements in CAR design, gene-engineering approaches and ...

Denne protokollen gir en langsiktig, in vitro, funksjonell metode for evaluering av kimerisk antigenreseptor, eller CAR T-celler, gjennom repeterende tumorcelleutfordring. Denne teknikken er mindre tidkrevende, og mindre arbeidsintensiv enn in vivo CAR T cellefunksjonsevaluering samtidig som den oppnår en nøyaktig representasjon av den sanne anti-tumoreffekten. Denne in vitro teknikken muliggjør høy gjennomstrømning screening og differensiering av CAR T celle anti-tumor styrke.Som har den potensielle anvendelsen for å vurdere klinisk effektivitet av CAR T celleprodukter. Begynn med å dissosiere glioblastom tumorsfærer fra en glioblastom tumorsfære kultur. Med en milliliter kald accutase, og 30 til 60 sekunder med pipettering.Når tumorsfærene har blitt forstyrret, stopp reaksjonen med fem milliliter varme co-kultur medium. Og pellet svulstcellesuspensjoner ved sentrifugering. Re-suspendere glioblastom cellene til en 1,6 ganger 10 til den femte tumorceller per milliliter fersk kokultur medium konsentrasjon, og fortynne T-celler høstet fra en CAR T celle kultur til riktig prosentandel av CAR positive T-celler per milliliter av co-kultur middels konsentrasjon.Deretter legger du til 100 mikroliter av de fortynnede tumorcellene til hver brønn av en 96 godt flat bunnvevskulturplate. Og 100 mikroliter av CAR T-celler i hver brønn av tumorceller med mild blanding. Plasser deretter platen i en 37 grader Celsius, 5% karbondioksidinkubator.På dag to, fire og seks av kultur, forsiktig fjerne 50 mikroliter av medium fra hver brønn av tumorcellen, T celle co-kultur plate slated for rechallenge ifølge bordet. Deretter legger du til 50 mikroliter med fersk glioblastomcellesuspensjon, tilberedt som nettopp demonstrert, men med dobbelt så mange cellenummer av den første samkulturen til hver brønn med mild blanding. Og returnere platen til cellekulturinkubatoren.Dag én, tre, fem og syv av co-kultur, overføre supernatant fra hver brønn som skal høstes inn i en ny 96 godt rund bunnplate i henhold til bordet og legge til 50 mikroliter av forhåndsoppvarmet 0,5% Trypsin EDTA i hvert medium utarmet godt. Etter fem minutter ved 37 grader Celsius, bekreft at cellene har løsnet fra bunnen av hver brønn ved lett mikroskopi, og pipette forsiktig enzymløsningen rundt bunnen av hver brønn for å gjenopplive cellene. Før du overfører den frittliggende cellefjæringen til de aktuelle tilsvarende brønnene til den nye 96 brønnplaten.Pellet cellene ved sentrifugering, og vask cellene med 200 mikroliter av fluorescerende aktivert celle sortering stående løsning, eller FFS per brønn med en andre sentrifugering. Re-suspendere pellets i 100 mikroliter av antistoff cocktail av interesse i 100 mikroliter SSS per brønn for en 30 minutters inkubasjon ved fire grader Celsius. En slutten av inkubasjonen fjerner ethvert ubundet antistoff ved sekvensiell 100 og 200 mikroliter FSS vasker og re-suspendere cellene i 100 til 200 mikroliter dapi kjernefysisk flekk og FSS.Deretter analyserer du cellene i henhold til standard strømningscytokometriske analyseprotokoller. For funksjonell og fenotypisk analyse av CAR T-cellene etter tumorcellekokultur, hent datafilene fra strømningssytometeret, og gate alle de levende DAPI negative cellene. For å kvantifisere tumorcellene, gate CD45 negativ befolkning.For å kvantifisere CAR T-cellene gate CD45 positiv CAR positiv befolkning. Deretter plotter svulsten og CAR T cellenumrene over eksperimentets tidsforløpet, identifiserer T-celleaktivering ved co-uttrykk for 41BB og CD69. T celleutmattelse ved uttrykk for PD1, LAG3 og TIM3, og T-celleminnestatusen LAG3 og TIM3, og T-celleminnestatusen med CD45RO og CD62 ligand uttrykk.cd45ro og CD62 ligand uttrykk. Både CD4-positive og CD8-positive CAR T-celler blir like aktivert mot glioblastomceller som uttrykker målantigenet som angitt av deres CD107a og intracellulært cytokinuttrykk. Men, som vurdert av repeterende tumor utfordring SA, CD4 positiv, men ikke CD8 positiv, CAR T celler er i stand til flere runde drap.CD4 positive CAR T-celler oppnår også en mer robust ekspansjon. Når CD4-positive, og CD8 positive CAR T-celler blandes med ett til ett forhold, utfører denne cellekombinasjonen CD8-positive, men ikke CD4-positive CAR T-celler når det gjelder langsiktig cytotoksisitet. I tillegg er utvidelsen av CD8 positive CAR T-celler indusert ved tilsetning av CD4-positive T-celler.Mens CD4 positiv CAR T celle ekspansjon er hemmet i nærvær av CDa positive celler. 24 timer etter den første medkulturen aktiveres både CD4-positive og CD8-positive CAR T-celler på samme måte. Under den repeterende tumorutfordringen viser både CD4-positive og CD8 positive CAR T-celler en overgang fra en CD45RO-positiv, CD62 ligan positiv sentral minnefenotype, til en CD45RO positiv CD62 ligan negativ effekteller minnefenotype.CD8 positive CAR T-celler er også mer utsatt for utmattelse sammenlignet med CD4 positive CAR T-celler som vurdert av deres PD1, LAG3 og TIM3 uttrykk etter tre dager med co-kultur. Videre er det ingen forskjeller observert i CDa positiv CAR T-celleutmattelse i nærvær eller fravær av CD4-positive T-celler, noe som indikerer at CD4-indusert CD8-positiv CAR T-celleutvidelse ikke er forbundet med en bedre effektorfunksjon. Dette essayet kan også kombinert med sortering av T-cellene danner samkulturen for å utføre ytterligere analyse på transkripsjoner, proteomikk og spesifikke gener av interesse.Denne repeterende tumorutfordringen kan også brukes som en plattform for å undersøke de biologiske hendelsene etter CAR T celle tumorgjenkjenning.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Target Cell Pre-enrichment and Whole Genome Amplification for Single Cell Downstream Characterization

Målet cellen pre berikelse og hele genomet forsterkning for enkeltcelle nedstrøms karakteristikk

Rare target cells can be isolated from a high background of non-target cells using antibodies specific for surface proteins of target cells. A recently ...

A Syngeneic Mouse B-Cell Lymphoma Model for Pre-Clinical Evaluation of CD19 CAR T Cells

En Syngeneic mus B-celle lymfom modell for pre-klinisk evaluering av CD19 bil T-celler

The astonishing clinical success of CD19 chimeric antigen receptor (CAR) T-cell therapy has led to the approval of two second generation chimeric antigen ...

Real Time Detection of In Vitro Tumor Cell Apoptosis Induced by CD8+ T Cells to Study Immune Suppressive Functions of Tumor-infiltrating Myeloid Cells

Real Time Detection of In Vitro Tumor Cell Apoptosis Induced by CD8+ T Cells to Study Immune Suppressive Functions of Tumor-infiltrating Myeloid Cells

Sanntid påvisning av i Vitro svulst celle apoptose indusert av CD8+ T celler å studere immun undertrykkende funksjoner av svulst-infiltrere myeloide celler

Potentiation of the tumor-killing ability of CD8+ T cells in tumors, along with their efficient tumor infiltration, is a key element of successful ...

Flow Cytometric Analysis of Mitochondrial Reactive Oxygen Species in Murine Hematopoietic Stem and Progenitor Cells and MLL-AF9 Driven Leukemia

Flow analytiske analyse av mitokondrie reaktive oksygen arter i murine blodkreft stem og stamceller og MLL-AF9 drevet leukemi

We present a flow cytometric approach for analyzing mitochondrial ROS in various live bone marrow (BM)-derived stem and progenitor cell populations from ...

Manufacturing Chimeric Antigen Receptor (CAR) T Cells for Adoptive Immunotherapy

Manufacturing Chimeric Antigen Receptor CAR T Cells for Adoptive Immunotherapy

Fremstilling chimeric antigen reseptor (CAR) T celler for adoptiv immunterapi

Adoptive immunotherapy holds promise for the treatment of cancer and infectious disease. We describe a simple approach to transduce primary human T cells ...

Using Human Induced Pluripotent Stem Cells for the Generation of Tumor Antigen-specific T Cells

Bruke Human indusert Pluripotent stamceller for generering av tumor antigen-spesifikke T celler

The generation and expansion of functional T cells in vitro can lead to a broad range of clinical applications. One such use is for the treatment of ...

Generation of Orthotopic Pancreatic Tumors and Ex vivo Characterization of Tumor-Infiltrating T Cell Cytotoxicity

Generation of Orthotopic Pancreatic Tumors and Ex vivo Characterization of Tumor-Infiltrating T Cell Cytotoxicity

Generering av Orthotopic bukspyttkjertel svulster og ex vivo karakterisering av tumor-infiltrere T Cell cytotoksisitet

In vivo models of pancreatic cancer provide invaluable tools for studying disease dynamics, immune infiltration and new therapeutic strategies. The ...

In Vitro Evaluation of Oncogenic Transformation in Human Mammary Epithelial Cells

In Vitro evaluering av onkogen transformasjon i humane pattedyr epitelceller

Tumorigenesis is a multi-step process in which cells acquire capabilities&#160;that allow their growth, survival, and dissemination under hostile ...

Dynamic Imaging of Chimeric Antigen Receptor T Cells with [18F]Tetrafluoroborate Positron Emission Tomography/Computed Tomography

Dynamic Imaging of Chimeric Antigen Receptor T Cells with [18F]Tetrafluoroborate Positron Emission Tomography/Computed Tomography

Dynamisk avbildning av chimeriske antigenreseptor T-celler med [18F]Tetrafluoroborate Positron Emission Tomography/Computed Tomography

T cells genetically engineered to express chimeric antigen receptors (CAR) have shown unprecedented results in pivotal clinical trials for patients with B ...

Evaluation of the In vivo Antitumor Activity of Polyanhydride IL-1&#945; Nanoparticles

Evaluation of the In vivo Antitumor Activity of Polyanhydride IL-1ÃƒÅ½Ã‚Â± Nanoparticles

Evaluering av in vivo antitumoraktivitet av polyanhydrid IL-1a nanopartikler

Cytokine therapy is a promising immunotherapeutic strategy that can produce robust antitumor immune responses in cancer patients. The proinflammatory ...