Name: in vitro tumor cell rechallenge for predictive evaluation of chimeric antigen receptor t cell antitumor function
Uploaded: 2019-02-27T15:00:00
Duration: 8 min 4 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Tumor Cell Rechallenge For Predictive Evaluation of Chimeric Antigen Receptor T Cell Antitumor Function at JoVE.com

Este trabalho foi financiado por doações da Califórnia Instituto de medicina regenerativa (CIRM) grant TR3-05641 e bolsas NIH P30 CA33572 (núcleos). D.W. é suportado pelo NCI comunhão 1F99CA234923-01.

Nossa IRB não exige a revisão do presente protocolo. Recebemos amostras de tumor glioblastoma fresco descartados da cidade de Hope departamento de patologia que são codificados, e o nosso laboratório não consegue ter acesso à chave. Nós recebemos os espécimes com dados somente em estado de doença e tratamento prévio no momento da biópsia/ressecção, sem dados de identificação.
1. preparação de mídia
<ol><li>Preparar a mídia de células-tronco neurais para cultivo de linhas de células GBM primárias: DMEM:F12, 01:50 B27, 5 µ g/mL heparina e 2 mmol/L, L-glutamina; suplementado com ng/mL 20 fator de crescimento epidérmico (EGF) e fator de crescimento de fibroblastos básico de ng/mL 20 (FGF) duas vezes por semana (ver Tabela de materiais).</li>
	<li>Preparar a mídia de célula T: 15 X-VIVO contendo 10% de soro fetal bezerro (FCS); suplementado com 70 UI/mL rhIL-2 e 0,5 ng/mL rhIL-15 cada 48 h (ver a Tabela de materiais).</li>
	<li>Preparar meios de cultura co: levar células-tronco neurais mídias sem suplemento de EGF e FGF, e adicionar 10% FCS.</li>
	<li>Preparar FACS coloração solução (FSS): HBSS, 2% FCS, NaN3 (0,5 g/500 mL).</li>
</ol>2. preparação de células de Tumor GBM
<ol><li>Colheita de esferas de tumor GBM baixa passagem (TSs) por centrifugação a 300 x g durante 4 min e descartar o sobrenadante. Nota: Tumor GBM esferas (TSs) são geradas a partir ressecados tumores conforme descrito anteriormente,22,23,24e mantidos em meios de comunicação de células-tronco neurais, em incubadoras com 5% CO2 a 37 ° C.</li>
	<li>Meios de cultura co pre-aquecido em banho maria a 37 ° C.</li>
	<li>Adicionar 1 mL de accutase frio para GBM TSs, dissociar TSs pipetando para 30-60 s e parar de dissociação pela adição de 5 mL de meios de cultura co quente. Nota: GBM TSs não devem ser mantidos em accutase por mais de 5 min.</li>
	<li>Colheita de células GBM por centrifugação a 300 x g durante 4 min, descartar o sobrenadante e ressuspender as células em 2 mL de meios de cultura co.</li>
	<li>Determine a concentração de células usando um contador de viabilidade celular. Nota: Viabilidade celular deve ser > 70%.</li>
</ol>3. preparação de células T de carro
<ol><li>Menos de 24 horas antes do ensaio, ter 100 µ l de células T de carro cultivadas em um tubo de citometria de fluxo e adicionar 2 mL de FSS. Nota: As pilhas de T do carro foram geradas conforme descrito anteriormente,11,21 e cultivadas em meios de célula T.</li>
	<li>Centrifugação a 300 x g durante 4 min e descarte sobrenadante.</li>
	<li>Adicionar 2 mL de FSS para lavar as células, centrifugar x 300 g por 4 min e descartar o sobrenadante.</li>
	<li>Manche as células com anticorpo adequado para indicar a expressão carro a 4 ° C por 30 min. Nota: Por exemplo, se um carro IL13Rα2-alvo descrito anteriormente25 é usado, então mancha com anticorpo anti-IL13.</li>
	<li>Lave duas vezes com 2 mL de FSS e analisar carro exn usando um citômetro de fluxo.</li>
	<li>Determine a % de carro em células T, usando a estratégia associada mostrada na Figura 1B.</li>
	<li>No dia da co-cultura, recolher todas as pilhas de T de carro por centrifugação a 300 x g durante 4 min, descartar o sobrenadante e ressuspender as células em 2 mL de meios de cultura co.</li>
	<li>Determine a concentração de células usando um contador de viabilidade celular. Nota: Viabilidade celular deve ser > 70%.</li>
</ol>4. configurar o tumor — co-cultura de células T
<ol><li>Dilua as células do tumor para uma concentração de 0,16 milhões/mL, com meios de cultura co.</li>
	<li>Baseado no carro %, diluir as células T de carro a uma concentração de 0,04 milhões carro+ células/mL com meios de cultura co. Nota: Por exemplo, se o carro é de 50% e a concentração de células T é 0,4 milhões/mL, em seguida, fazer uma diluição de 1:5 para obter a concentração final de 0,04 milhões carro+ células/mL.</li>
	<li>Pipete 100 µ l de células tumorais diluídos para cada poço de uma placa de cultura de tecidos de 96 poços de fundo plano.</li>
	<li>Pipete 100 µ l de células de carro T diluídas em cada poço que contém células de tumor e mistura bem. Nota: Cada co-cultura de células de tumor-T será analisada em 4 pontos de tempo. 4-6 repetições podem ser necessárias em cada vez ponto com base na análise de diferente, mas < 3 repetições por ponto de tempo não é recomendado; consulte a tabela 1 para um representante platemap.</li>
	<li>Manter a placa em um 37 ° C, 5% CO2 incubadora.</li>
</ol>5. tumor Cell reexposição
Nota: Reexposição ocorre em 2, 4 e 6 dias posto o setup inicial co-cultura (Figura 1A).
<ol><li>Colheita e dissociar GBM TSs, como descrito acima (passos 2.1-2.6).</li>
	<li>Ressuspender as células GBM em uma concentração de 0,64 milhões/mL.</li>
	<li>Determinar os poços de co-cultura que precisam reexposição (ver tabela 1) e remova cuidadosamente os meios de comunicação 50 social µ l da parte superior de cada poço.</li>
	<li>Adicionar 50 µ l de suspensão de células GBM em cada poço e misture bem e, em seguida, volte a colocar a placa na 37 ° C, 5% CO2 incubadora.</li>
</ol>6. colheita de amostras e fluxo Cytometric Analysis
Nota: Amostras de irão ser colhidas no posto de 1, 3, 5 e 7 dias, que a configuração inicial co-cultura, com 1, 2, 3 e 4 rodadas de desafio de tumor, respectivamente.
<ol><li>Pré-aquecer a solução de tripsina-EDTA 0,05% em banho-maria 37 ° C.</li>
	<li>Determine os poços que precisam da colheita e transferir os meios de comunicação para uma nova placa de 96 poços de fundo redondo.</li>
	<li>Pipete 50 µ l de tripsina-EDTA para os poços a digerir as células remanescentes do tumor a 37 ° C por 5 min.</li>
	<li>Sob um microscópio, confirme que as células têm destacado do fundo.</li>
	<li>Pipetar em torno do bem fundo para Ressuspender desanexada de células e, em seguida, transferir do trypsin-EDTA contendo células desanexadas o correspondente aos poços da placa de 96 poços de fundo redondo.</li>
	<li>Centrifugar a placa de 96 poços de fundo redondo a 300 x g, 4 ° C por 4 min, depois descartar o sobrenadante.</li>
	<li>Adicionar 200 µ l/poço de FSS para lavar as células, centrifugação a 300 x g, 4 ° C por 4 min, em seguida, descartar o sobrenadante.</li>
	<li>Ressuspender as células em 100 µ l/poço FSS contendo anticorpos (ver Tabela de materiais), células e e mancha a 4 ° C por 30 min.</li>
	<li>Adicionar 100 µ l/poço FSS às células, centrifugar a 300 x g, 4 ° C por 4 min, então descarte sobrenadante.</li>
	<li>Adicionar 200 µ l/poço de FSS para lavar as células, centrifugação a 300 x g, 4 ° C por 4 min, em seguida, descartar o sobrenadante.</li>
	<li>Ressuspender as células com 100-200 µ l/poço de FSS com DAPI de 500 ng/mL e, em seguida, analisar amostras por citometria de fluxo.</li>
</ol>7. funcional e análise de Otypic Phen de células T de carro
<ol><li>Recuperar os arquivos de dados do citômetro de fluxo e portão todas ao vivo (DAPI) células (Figura 1C).</li>
	<li>Quantificar células tumorais pelo gating a CD45 população– e células T de carro pelo gating a CD45+, carro + população (Figura 1C). Nota: Se as células tumorais expressam CD45 (por exemplo, células do linfoma Ribeiro), anti-CD3 a coloração pode ser usada para diferenciar as células T de células tumorais.</li>
	<li>Lote celular do tumor e número de células T de carro através do curso do tempo.</li>
	<li>Identifica a ativação de célula T pela expressão co de 4-1BB e CD69. Nota: Estes marcadores de superfície podem ser usados para analisar a célula T ativação 6-24 h post inicial co-cultura.</li>
	<li>Identifica a célula T exaustão pela expressão de PD-1, 3-LAG e TIM-3.</li>
	<li>Identifica o status da memória de célula T pela expressão de CD45RO e CD62L.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Porter, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chimeric+antigen+receptor+T+cells+persist+and+induce+sustained+remissions+in+relapsed+refractory+chronic+lymphocytic+leukemia.">Chimeric antigen receptor T cells persist and induce sustained remissions in relapsed refractory chronic lymphocytic leukemia.</a> Science Translational Medicine. 7 (303), (2015).</li><li>Brentjens, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD19-targeted+T+cells+rapidly+induce+molecular+remissions+in+adults+with+chemotherapy-refractory+acute+lymphoblastic+leukemia.">CD19-targeted T cells rapidly induce molecular remissions in adults with chemotherapy-refractory acute lymphoblastic leukemia.</a> Science Translational Medicine. 5 (177), (2013).</li><li>Grupp, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chimeric+antigen+receptor-modified+T+cells+for+acute+lymphoid+leukemia.">Chimeric antigen receptor-modified T cells for acute lymphoid leukemia.</a> The New England Journal of Medicine. 368 (16), 1509-1518 (2013).</li><li>Lee, D. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cells+expressing+CD19+chimeric+antigen+receptors+for+acute+lymphoblastic+leukaemia+in+children+and+young+adults:+a+phase+1+dose-escalation+trial.">T cells expressing CD19 chimeric antigen receptors for acute lymphoblastic leukaemia in children and young adults: a phase 1 dose-escalation trial.</a> The Lancet. 385 (9967), 517-528 (2015).</li><li>Yong, C. S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CAR+T-cell+therapy+of+solid+tumors.">CAR T-cell therapy of solid tumors.</a> Immunology and Cell Biology. 95 (4), 356-363 (2017).</li><li>Barrett, D. M., Singh, N., Porter, D. L., Grupp, S. A., June, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chimeric+antigen+receptor+therapy+for+cancer.">Chimeric antigen receptor therapy for cancer.</a> Annual Review of Medicine. 65, 333-347 (2014).</li><li>Priceman, S. J., Forman, S. J., Brown, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Smart+CARs+engineered+for+cancer+immunotherapy.">Smart CARs engineered for cancer immunotherapy.</a> Current Opinion in Oncology. 27 (6), 466-474 (2015).</li><li>Fesnak, A. D., June, C. H., Levine, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineered+T+cells:+the+promise+and+challenges+of+cancer+immunotherapy.">Engineered T cells: the promise and challenges of cancer immunotherapy.</a> Nature Reviews Cancer. 16 (9), 566-581 (2016).</li><li>Esensten, J. H., Bluestone, J. A., Lim, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+Therapeutic+T+Cells:+From+Synthetic+Biology+to+Clinical+Trials.">Engineering Therapeutic T Cells: From Synthetic Biology to Clinical Trials.</a> Annual Review of Pathology. 12, 305-330 (2017).</li><li>Lim, W. A., June, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Principles+of+Engineering+Immune+Cells+to+Treat+Cancer.">The Principles of Engineering Immune Cells to Treat Cancer.</a> Cell. 168 (4), 724-740 (2017).</li><li>Brown, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+IL13Ralpha2-Targeted+Chimeric+Antigen+Receptor+T+Cells+for+Improved+Anti-tumor+Efficacy+against+Glioblastoma.">Optimization of IL13Ralpha2-Targeted Chimeric Antigen Receptor T Cells for Improved Anti-tumor Efficacy against Glioblastoma.</a> Molecular Therapy. , (2017).</li><li>Long, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=4-1BB+costimulation+ameliorates+T+cell+exhaustion+induced+by+tonic+signaling+of+chimeric+antigen+receptors.">4-1BB costimulation ameliorates T cell exhaustion induced by tonic signaling of chimeric antigen receptors.</a> Nature Medicine. 21 (6), 581-590 (2015).</li><li>Cherkassky, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+CAR+T+cells+with+cell-intrinsic+PD-1+checkpoint+blockade+resist+tumor-mediated+inhibition.">Human CAR T cells with cell-intrinsic PD-1 checkpoint blockade resist tumor-mediated inhibition.</a> The Journal of Clinical Investigation. 126 (8), 3130-3144 (2016).</li><li>Priceman, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Co-stimulatory+signaling+determines+tumor+antigen+sensitivity+and+persistence+of+CAR+T+cells+targeting+PSCA++metastatic+prostate+cancer.">Co-stimulatory signaling determines tumor antigen sensitivity and persistence of CAR T cells targeting PSCA+ metastatic prostate cancer.</a> Oncoimmunology. 7 (2), 1380764 (2018).</li><li>Eyquem, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+a+CAR+to+the+TRAC+locus+with+CRISPR/Cas9+enhances+tumour+rejection.">Targeting a CAR to the TRAC locus with CRISPR/Cas9 enhances tumour rejection.</a> Nature. 543 (7643), 113-117 (2017).</li><li>Gattinoni, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acquisition+of+full+effector+function+in+vitro+paradoxically+impairs+the+in+vivo+antitumor+efficacy+of+adoptively+transferred+CD8++T+cells.">Acquisition of full effector function in vitro paradoxically impairs the in vivo antitumor efficacy of adoptively transferred CD8+ T cells.</a> The Journal of Clinical Investigation. 115 (6), 1616-1626 (2005).</li><li>Malandro, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonal+Abundance+of+Tumor-Specific+CD4(+)+T+Cells+Potentiates+Efficacy+and+Alters+Susceptibility+to+Exhaustion.">Clonal Abundance of Tumor-Specific CD4(+) T Cells Potentiates Efficacy and Alters Susceptibility to Exhaustion.</a> Immunity. 44 (1), 179-193 (2016).</li><li>Gattinoni, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt+signaling+arrests+effector+T+cell+differentiation+and+generates+CD8++memory+stem+cells.">Wnt signaling arrests effector T cell differentiation and generates CD8+ memory stem cells.</a> Nature Medicine. 15 (7), 808-813 (2009).</li><li>Klebanoff, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Central+memory+self/tumor-reactive+CD8++T+cells+confer+superior+antitumor+immunity+compared+with+effector+memory+T+cells.">Central memory self/tumor-reactive CD8+ T cells confer superior antitumor immunity compared with effector memory T cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (27), 9571-9576 (2005).</li><li>Gattinoni, L., Klebanoff, C. A., Restifo, N. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paths+to+stemness:+building+the+ultimate+antitumour+T+cell.">Paths to stemness: building the ultimate antitumour T cell.</a> Nature Reviews Cancer. 12 (10), 671-684 (2012).</li><li>Wang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glioblastoma-targeted+CD4++CAR+T+cells+mediate+superior+antitumor+activity.">Glioblastoma-targeted CD4+ CAR T cells mediate superior antitumor activity.</a> JCI Insight. 3 (10), (2018).</li><li>Kahlon, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+recognition+and+killing+of+glioblastoma+multiforme+by+interleukin+13-zetakine+redirected+cytolytic+T+cells.">Specific recognition and killing of glioblastoma multiforme by interleukin 13-zetakine redirected cytolytic T cells.</a> Cancer Research. 64 (24), 9160-9166 (2004).</li><li>Brown, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recognition+and+killing+of+brain+tumor+stem-like+initiating+cells+by+CD8++cytolytic+T+cells.">Recognition and killing of brain tumor stem-like initiating cells by CD8+ cytolytic T cells.</a> Cancer Research. 69 (23), 8886-8893 (2009).</li><li>Lee, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+stem+cells+derived+from+glioblastomas+cultured+in+bFGF+and+EGF+more+closely+mirror+the+phenotype+and+genotype+of+primary+tumors+than+do+serum-cultured+cell+lines.">Tumor stem cells derived from glioblastomas cultured in bFGF and EGF more closely mirror the phenotype and genotype of primary tumors than do serum-cultured cell lines.</a> Cancer Cell. 9 (5), 391-403 (2006).</li><li>Brown, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regression+of+Glioblastoma+after+Chimeric+Antigen+Receptor+T-Cell+Therapy.">Regression of Glioblastoma after Chimeric Antigen Receptor T-Cell Therapy.</a> The New England Journal of Medicine. 375 (26), 2561-2569 (2016).</li><li>Salter, A. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphoproteomic+analysis+of+chimeric+antigen+receptor+signaling+reveals+kinetic+and+quantitative+differences+that+affect+cell+function.">Phosphoproteomic analysis of chimeric antigen receptor signaling reveals kinetic and quantitative differences that affect cell function.</a> Science Signaling. 11 (544), (2018).</li><li>Rossi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preinfusion+polyfunctional+anti-CD19+chimeric+antigen+receptor+T+cells+are+associated+with+clinical+outcomes+in+NHL.">Preinfusion polyfunctional anti-CD19 chimeric antigen receptor T cells are associated with clinical outcomes in NHL.</a> Blood. 132 (8), 804-814 (2018).</li><li>Garcia-Diaz, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interferon+Receptor+Signaling+Pathways+Regulating+PD-L1+and+PD-L2+Expression.">Interferon Receptor Signaling Pathways Regulating PD-L1 and PD-L2 Expression.</a> Cell Reports. 19 (6), 1189-1201 (2017).</li><li>Walker, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+Antigen+and+Receptor+Densities+Regulate+Efficacy+of+a+Chimeric+Antigen+Receptor+Targeting+Anaplastic+Lymphoma+Kinase.">Tumor Antigen and Receptor Densities Regulate Efficacy of a Chimeric Antigen Receptor Targeting Anaplastic Lymphoma Kinase.</a> Molecular Therapy. 25 (9), 2189-2201 (2017).</li><li>Fraietta, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determinants+of+response+and+resistance+to+CD19+chimeric+antigen+receptor+(CAR)+T+cell+therapy+of+chronic+lymphocytic+leukemia.">Determinants of response and resistance to CD19 chimeric antigen receptor (CAR) T cell therapy of chronic lymphocytic leukemia.</a> Nature Medicine. 24 (5), 563-571 (2018).</li><li>Fraietta, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disruption+of+TET2+promotes+the+therapeutic+efficacy+of+CD19-targeted+T+cells.">Disruption of TET2 promotes the therapeutic efficacy of CD19-targeted T cells.</a> Nature. 558 (7709), 307-312 (2018).</li></ol>

A construção do carro descrita neste trabalho ter sido aprovados pela Mustang Bio., Inc., para os quais S.J.F. e C.E.B recebem pagamentos de royalties. Todos os outros autores declaram não potenciais conflitos de interesse.

Este ensaio de desafio de células de tumor repetitivas fornece uma abordagem conveniente para avaliar potência funcional célula T de carro, usando uma configuração in vitro que recapitula a carga alta tumor associada com modelos de tumor in vivo. Durante este ensaio de 7 dias, as células T de carro passam por quatro rodadas de desafio de tumor (co-cultura inicial e reexposição de x 3), criando um ambiente onde esgotado as células T podem perder sua capacidade de responder ao desafio de tumor, apesar de uma potente resposta inicial. Eliminação de células do tumor e expansão de células T de carro representam duas leituras fundamentais que podem ser adquiridas a partir deste ensaio, enquanto os fenótipos de células T de carro podem ser facilmente analisados pela coloração de marcadores de superfície ou intracelulares que indicam a ativação de células T, exaustão e/ou memória. Este ensaio também é conveniente para combinar com a análise de não-tendencioso de carro T células transcriptome proteome ou fósforo-proteome21,26e polyfunctionality de células T que foi aprovada para prever respostas clínicas27. Além disso, as células do tumor também podem ser testadas para sua resposta adaptável contra células T imunidade como a secreção de citocinas28. Desde que as amostras são colhidas em vários pontos do tempo, este ensaio permite não só estática, mas também a análise dinâmica do comportamento de célula T de carro quando responder ao excesso número de células tumorais.
O ensaio é particularmente poderoso nos comparando a potência efetoras de células T de carro visando o mesmo antígeno, mas com projetos diferentes e/ou processos de fabricação. Nós usamos este ensaio para identificar esse CD4+ carro T células foram capazes de mediar a função de efetor superior a longo prazo do que CD8+ células21. Foi também demonstrado que eficácia in vivo de carro foi correlacionada com a citotoxicidade em pontos de tempo posteriores (D7-D5) durante este ensaio, destacando ainda mais a necessidade de utilizar o desafio de tumor repetitivas para avaliação de célula T de carro in vitro. Apesar de células GBM foram usadas como o exemplo das células alvo aqui, este ensaio poderia ser facilmente adotado para uma combinação de diferentes células T-tumor. Nomeadamente, comportamento de célula T de carro também pode variar com antigénios diferentes densidades e engenharia células cancerosas para expressar a vários níveis de antígenos alvo fornecidos a ferramenta para investigar eventos moleculares sequenciais em cima do carro de reconhecimento29. Portanto, este ensaio também pode ser explorado para examinar o padrão de ativação de certas células T carro contra alvos diferentes.
Uma vez que a viabilidade celular de destino e a expansão de células T de carro são duas leituras iniciais deste teste, é fundamental que todas as culturas co começarcom com viável (> 70%) tumor e as células T. Ao realizar os processos de reexposição, a ação dos meios de comunicação de aspiração (etapa 5.3) não deve incomodar tumor e as células T no fundo dos poços, a fim de não apresentar variações desnecessárias das contagens de células. Ao executar este ensaio em linhas de células alvo de suspensão, é aconselhável colher células restantes por centrifugação antes reexposição de células do tumor.
Uma limitação deste teste é que os parâmetros de configuração (E:T rácios de co-cultura inicial e reexposição) precisa ser ajustado com base em diferentes combinações de carro-tumor. Por exemplo, se as células tumorais expressam um nível considerável de moléculas imuno-inibitórios (por exemplo, PD-L1), uma maior taxa de E:T é recomendada tendo em conta que o total matar eficiência é prejudicada em comparação com as células do tumor PD-L1-baixo. Antes de aplicar o ensaio de novas combinações de carro-tumor, um estudo piloto é recomendável para determinar as condições ideais, que geralmente permite que as células T de carro mais potentes, testadas no ensaio para eliminar > 80% de células tumorais no ponto final. Desde que o contato direto celular é necessária por carro mediada por células T matar, se as células de tumor foram rotulados de fluorescência, então o painel de análise de fluxo cytometric deve ser ajustado em conformidade (por exemplo, se as pilhas do tumor eram GFP-rotulados, então qualquer FITC-conjugados os anticorpos não devem ser usados).
A atividade clínica de células T de carro contra tumores malignos de células B tem levado a dois medicamentos aprovados pela FDA. No entanto, a resposta tem mostrado uma variação substancial entre pacientes diferentes27,30,31, que foi elucidado para correlacionar com as propriedades fenotípicas do carro produtos30. Este ensaio de desafio de tumor repetitivas in-vitro ainda fornece uma abordagem para testar funcionalmente a potência de efetor do carro além da Caracterização fenotípica e a produção de citocinas polyfunctionality e permite o rastreio de uma taxa de transferência de produtos clínicos em comparação com modelos de tumor em vivo, mantendo a fidelidade de preditiva. Em geral, este ensaio poderia ser usado para teste funcional de células T para desenho de célula T de carro, desenvolvimento pré-clínicos e clínico.

Imunoterapia usando o receptor de antígeno Quimérico (carro)-Engenharia de células T tem visto resultados promissores contra células B malignidades1,2,3,4, enquanto o potencial de atingir outros tumores continua a estar sob investigação rigorosa5,6,7. Grande progresso tem sido feito para otimizar a construção do carro, processo de fabricação e paciente pré-infusão de regimes6,7,8, e abordagens de biologia sintética romance são esperadas para aumentar sua persistência, segurança e tumor especificidade9,10. No entanto, tem sido difícil e trabalhoso para avaliar adequadamente o potencial terapêutico de células T do carro para orientar a melhor escolha para tradução clínica. O modelo mais estabelecido até agora para avaliar a função de célula T de carro é em camundongos imunodeficientes rolamento xenografts tumor humano, no qual células T de carro são examinadas para eficácia antitumoral e comparadas às células titulada doses11,12 , 13 , 14 , 15. estes estudos murino in vivo são trabalhosa e demorada, especialmente quando um grande número de parâmetros de rastreio. Estudos in vivo, mais podem ser contidos pela acessibilidade de cepas de rato, instalações de cuidados com animais e técnicas de manipulação de animais. Portanto, há uma necessidade de desenvolver mais convenientes ensaios in vitro, permitindo a rápida leituras de atividade efetoras, que reflectem também fielmente a função antitumoral in vivo destas células T.
Métodos convencionais para determinar a citotoxicidade das células T in vitro centraram-se na detecção de degranulação, produção de citocinas e a capacidade de lyse pilhas radioisótopo-etiquetadas do alvo (ou seja, ensaios de liberação de cromo). Enquanto estes ensaios são informativos para definir a especificidade de célula T de carro e redirecionada alvo de reconhecimento, eles muitas vezes não reflectem o potencial antitumoral in vivo de engenharia T células12,13,16. Em certos casos, em vitro matar atividade em ensaios de curto prazo mostrou uma correlação inversa com função antitumoral in vivo16. Tal inconsistência é provavelmente o resultado de rácios de alta effector: alvo (E:T) usado nestes ensaios in vitro e, portanto, a incapacidade para diferenciar produtos de célula T de carro que são propensos a exaustão17. Por outro lado, durante a erradicação do tumor em vivo T células geralmente respondem contra sobrecargas de tumor grande, que exige várias rodadas de matar e posteriormente dirigir a célula T diferenciação e exaustão18,19, 20, que é uma das principais barreiras contra afastamento de tumor eficaz por carro T células12,13. Enquanto isso, mais a curto prazo ensaios in vitro de matança também fazer não leitura diferenças na proliferação de células T, Considerando que em carro T célula Tratado pacientes a capacidade de expansão de célula T de carro é fortemente correlacionada com respostas clínicas4. Assim, o ensaio in vitro apropriado seria necessário para recapitular as condições de carga alta tumor, indução de células T de exaustão e permite a leitura de expansão de células T.
Aqui nós descrevemos uma estratégia para avaliar as pilhas de T do carro para tumor repetitiva matando potencial, com um ensaio simples co-cultura in-vitro. Parâmetros de atividade diferentes células T efetoras podem ser examinados simultaneamente, incluindo a morte de célula de destino, expansão de célula T de carro e fenótipos associados a memória ou exaustão. Os resultados gerados a partir deste ensaio se correlacionam bem com o efeito antitumoral in vivo de células T de carro e podem ser explorados para avaliar a potência dos produtos de célula T de carro. Enquanto nós descrevemos um ensaio para avaliar as células T de carro IL13Ra2-alvo contra primário GBM linhas21, pode ser facilmente adaptado para qualquer plataforma de célula T de carro.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1084px;" width="1083">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:451px;">0.05% Trypsin/0.53mM EDTA in HBSS w/o Calcium and Magnesium</td>
			<td style="width:123px;">Corning</td>
			<td style="width:344px;">MT25051CI</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:451px;">1M Hepes</td>
			<td style="width:123px;">Irvine Scientific</td>
			<td style="width:344px;">9319</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:451px;">200 mM L-Glutamine</td>
			<td style="width:123px;">Cambrex Bio Science</td>
			<td style="width:344px;">17-605E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:451px;">4&#39;,6-diamidino-2-phenylindole, dihydrochloride (DAPI) - FluoroPure grade</td>
			<td style="width:123px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:344px;">D21490</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:451px;">Accutase</td>
			<td style="width:123px;">Innovative Cell Technologies</td>
			<td style="width:344px;">AT104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:451px;">Aldesleukin Proleukin (rhIL-2)</td>
			<td style="width:123px;">Novartis Oncology</td>
			<td style="width:344px;">NDC 0078-0495-61</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Anti-CD137, PE</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555956</td>
			<td>4B4-1</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Anti-CD19, PE-Cy7</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>557835</td>
			<td>SJ25C1</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Anti-CD3, PERCP</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>340663</td>
			<td>SK7</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Anti-CD4, FITC</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>340133</td>
			<td>SK3</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Anti-CD45, PERCP</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>340665</td>
			<td>2D1</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Anti-CD45RO, PE</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>561137</td>
			<td>UCHL1</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Anti-CD62L, APC</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>559772</td>
			<td>DREG-56</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Anti-CD69, APC</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>340560</td>
			<td>L78</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Anti-CD8, APC-Cy7</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>348793</td>
			<td>SK1</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Anti-IL-13, PE</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>340508</td>
			<td>JES10-5A2</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Anti-LAG-3, PE</td>
			<td>eBiosciences</td>
			<td>12-2239-41</td>
			<td>3DS223H</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Anti-PD-1, APC-Cy7</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>329921</td>
			<td>EH12.2H7</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Anti-TIM-3, APC</td>
			<td>eBiosciences</td>
			<td>17-3109-42</td>
			<td>F38-2E2</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:451px;">B-27 Serum-Free Supplement (50X)</td>
			<td style="width:123px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:344px;">17504-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:451px;">Corning 96 Well Clear Flat Bottom Polystyrene TC-Treated Microplates, Individually Wrapped, with Lid, Sterile (Product #3596)</td>
			<td style="width:123px;">Corning Life Sciences</td>
			<td style="width:344px;">3596</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:451px;">Defined fetal bovine serum,HI IR</td>
			<td style="width:123px;">Hyclone Labs</td>
			<td style="width:344px;">SH30070.03IH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:451px;">DMEM F-12 50:50 (1X) w/o Glutamine</td>
			<td style="width:123px;">MediaTech, Inc.</td>
			<td style="width:344px;">15-090-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:451px;">DMEM High Gluc w/o L-Glu, Na Pyr 1 L</td>
			<td style="width:123px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:344px;">11960051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:451px;">DMEM-Ham&#39;s F12 50:50 Mixture with L-glutamine and 15 mM HEPES</td>
			<td style="width:123px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:344px;">MT10092CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:451px;">HBSS</td>
			<td style="width:123px;">Irvine Scientific</td>
			<td style="width:344px;">9224</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:451px;">Heat-Inactivated FCS</td>
			<td style="width:123px;">Hyclone</td>
			<td style="width:344px;">SH30070.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:451px;">Heparin Sodium(1,000 U/ml)</td>
			<td style="width:123px;">American Pharmaceutical</td>
			<td style="width:344px;">401811B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:451px;">MACSQuant</td>
			<td style="width:123px;">Milteni Biotech Inc.</td>
			<td style="width:344px;">BIS013220&#160;</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PBS 1X W/CA &#38; MG</td>
			<td>Irvine Scientific</td>
			<td>9236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:451px;">PBS with 1MM EDTA (No Ca2+ or Mg2+)</td>
			<td style="width:123px;">VWR Scientific Products</td>
			<td style="width:344px;">PB15009A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:451px;">Recombinant human EGF</td>
			<td style="width:123px;">R&#38;D Systems</td>
			<td style="width:344px;">236-EG-200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:451px;">Recombinant human FGF</td>
			<td style="width:123px;">R&#38;D Systems</td>
			<td style="width:344px;">233-FB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:451px;">rhIL-15 Working Dilution (10 ng/&#181;L)</td>
			<td style="width:123px;">CellGenix, US Operations</td>
			<td style="width:344px;">tF0297</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="45">
			<td height="45" style="height:45px;width:451px;">Sodium Azide (NaN3)</td>
			<td style="width:123px;">Sigma</td>
			<td style="width:344px;">S8032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:451px;">Sorvall ST40R</td>
			<td style="width:123px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:344px;">41693700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:451px;">TC-HEPES BUFFER (1M) SOLN 100ML&#160;</td>
			<td style="width:123px;">IRVINE SCIENTIFIC CORP</td>
			<td style="width:344px;">6472</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:451px;">Tecnol Procedure Mask</td>
			<td style="width:123px;">Kimberly-Clark</td>
			<td style="width:344px;">47117</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:451px;">X-VIVO 15</td>
			<td style="width:123px;">Lonza</td>
			<td style="width:344px;">BW04-744Q</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro tumor cell rechallenge for predictive evaluation of chimeric antigen receptor t cell antitumor function

O campo da terapia de células T antígeno quimérico do receptor (carro) está a avançar rapidamente com melhorias no projeto do carro, abordagens de gene-engenharia e fabricação otimizações. Um desafio para estes esforços de desenvolvimento, no entanto, tem sido o estabelecimento de ensaios in vitro que robustamente pode informar a seleção dos produtos célula T carro ideais para o sucesso terapêutico em vivo. Ensaios in vitro padrão do tumor-lise frequentemente não reflectem o verdadeiro potencial antitumoral das células T de carro devido ao tempo relativamente curto co-cultura e pilha de T elevada à relação do tumor. Aqui, descrevemos um método de cultura in vitro de co para avaliar recursiva de célula T de carro matando potencial em cargas de célula de tumor elevado. Neste ensaio, a longo prazo função citotóxica e capacidade proliferativa de células T de carro é examinado em vitro durante 7 dias com alvos adicionais tumor administrados à cultura co todos os dias. Este ensaio pode ser acoplado a ativação de célula T de perfil, o cansaço e fenótipos de memória. Usando este ensaio, termos distintos com êxito as diferenças funcionais e fenotípicas entre CD4+ e CD8+ carro T células contra glioblastoma (GBM), reflectindo a sua actividade antitumoral in vivo diferencial em ortotópico modelos de enxerto. Este método fornece uma abordagem superficial para avaliar a potência de célula T de carro e para elucidar as variações funcionais em diferentes produtos de célula T de carro.

Usando o ensaio descrito acima, termos distintos a potência diferencial efetoras e matar dinâmica mediada por CD4+ e CD8+ carro T células. Os resultados aqui apresentados ilustram a diferença entre CD4+ e CD8+ carro T células, geradas a partir de um doador saudável independente da nossa anterior publicação21.
Através de um ensaio de degranulação padrão, pudemos observar que ambos CD4+ e CD8+ carro T células tornou-se igualmente ativadas contra células GBM que expressam o antígeno alvo, conforme indicado pela expressão de CD107a e citocinas intracelulares (Figura 2). No entanto, usando o ensaio de desafio de tumor repetitivos, descobrimos que CD4+ mas não CD8+ carro T células expostas a capacidade de matar múltiplo-redonda (Figura 2B). CD4+ carro T células também expansão melhor alcançado em comparação com células CD8 + durante este ensaio (Figura 2C). A diferença de expansão entre subconjuntos de célula T de carro só foram observados de D3 após duas rodadas de desafio de tumor (1:12 E:T), enquanto a diferença de citotoxicidade foi observada após três rodadas de desafio de tumor (1:20 E:T) com início em D5, indicando que ensaios de curto prazo não conseguiram elucidar as diferenças na potência de diferentes produtos de célula T de carro. Quando o 1:1 misturado CD4+ e CD8+ carro T células foram aplicadas a este ensaio, foram encontrados outperform o CD8+ mas não CD4+ carro T células na citotoxicidade de longo prazo (Figura 2B). A expansão de CD8+ carro T células foi induzido pelo CD4 co aplicada+ células, enquanto CD4+ expansão de célula T de carro foi inibida em presença de CD8+ células (Figura 2C).
Para explicar o mecanismo que distingue a atividade efetora entre CD4+ e CD8+ carro T células, primeiro confirmamos que 24 h após inicial cultura co, ambos CD4+ e CD8+ carro T células foram comparàvel ativado (Figura 3 A). Entretanto, como indicado pela expressão CD45RO e CD62L, ambos CD4+ e CD8+ carro T células mostraram uma transição de memória central (CD45RO+, CD62L+) de memória efetoras (CD45RO+, CD62L–) fenótipo durante o desafio repetitivo do tumor (Figura 3B). Em seguida, caracteriza as células em D3 deste teste, um tempo antes que os subconjuntos de célula T do carro começaram a exibir a diferença funcional. Exaustão de células t foi marcado pela expressão co dos receptores inibitórios PD-1, 3-LAG e TIM-315,,21, que mostrou que CD8+ carro T células eram mais propensas à exaustão em comparação com CD4+ carro T células ( Figura 3 C). Além disso, nenhuma diferença foi vista na CD8+ exaustão de célula T de carro na presença/ausência de CD4 co aplicada+ células (Figura 3C), indicando que induzida por CD4 CD8+ expansão de célula T de carro não é associado com uma melhor função efetora.
Juntos, os resultados do presente ensaio identificaram esse CD4+ carro T células CD8 superou+ especificamente em longo prazo citotoxidade de células. Apesar da citotoxidade de curto prazo semelhante (1-3 dias, uma vez rechallenged), CD4+ carro T células efetoras sustentado função após desafio repetitivo do tumor, enquanto CD8+ células tornou-se exausto e não conseguiram controlar o crescimento de células de tumor. Quando os dois subconjuntos foram misturadas, CD4+ carro T células facilitaram a expansão do CD8+ carro T células, mas o status de exaustão de CD8+ células não foram amenizadas, resultando na falta de efeito sinérgico entre os dois grupos. Diferença semelhante entre CD4+ e CD8+ carro T células foi visto em um modelo in vivo como descrito anteriormente,21. Com efeito, CD8+ carro T células foram capazes de mediar a curto prazo afastamento do tumor mas seguido com recorrência de antígeno-positivo; em contraste, CD4+ tratamento de célula T de carro resultou em longo prazo da erradicação do tumor21, que é uma reminiscência do seu potencial de matar repetitivas usando o ensaio in vitro de reexposição.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59275/59275fig1.jpg"> Figura 1 : Estratégia de esquema e análise do ensaio de desafio repetitivo. (A) esquema e cronograma de ensaio de desafio de tumor repetitivas. Para cada poço, células T de carro foram primeiro co cultivadas com células de GBM PBT030-2 (4.000 carro + células, 16.000 células tumorais) e re-desafiadas com 32.000 células tumorais cada outro dia (D2, D4 e D6). Análise de células do tumor e número de célula T de carro, bem como o fenótipo de células T de carro é realizada em D1, D3, D5 e D7. (B) Gating estratégia para determinar a % de carro em T células antes de configurar a co-cultura. (C) Gating estratégia de células vivas, células tumorais e células T de carro desde o ensaio de desafio repetitivo. (D) Tumor células número em diferentes momentos do ensaio reexposição, co cultivadas com as pilhas de T untransduced. Barras de erro = ±SEM. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59275/59275fig1large.jpg" target="_blank">por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59275/59275fig2.jpg"> Figura 2 : Desafio repetitivo ensaio revela diferenças de potência proliferativa e mortes entre CD4+ e CD8+ carro T células. (A) degranulação e coloração de citocinas intracelulares de CD4+ e CD8+ carro T células após 5h de co-cultura com células GBM (E:T = 1:1). CD4 (B)+, CD8+ ou mista (CD4:CD8 = 1:1) células T de carro foram aplicadas ao ensaio de desafio repetitivo, e células tumorais viáveis foram quantificadas. p < 0.05, * *p < 0,01, * * *p < 0,001 comparado com CD4+, usando o One-Way ANOVA com testes de comparação múltipla de Bonferroni. CD4 (C)+ e CD8+ expansão de célula T de carro durante o ensaio de desafio de tumor repetitivas. Comparação de (esquerda para a direita) CD4+ vs CD8+, único subconjunto; CD4+ vs CD8+, dentro do grupo "misto"; CD4+, single vs misturados; CD8+, single vs misturados. p < 0.05, * *p < 0,01, * * *p < 0,001 usando um unpaired t de Student. Barras de erro = ±SEM. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59275/59275fig2large.jpg" target="_blank">por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59275/59275fig3.jpg"> Figura 3 : Análise do fenótipo de células T durante o ensaio de desafio repetitivo. (A) 4-1BB e CD69 coloração sobre as pilhas de T do carro no D1 do ensaio. (B) CD45RO e CD62L coloração de células T do carro antes de aplicar para reexposição do ensaio (de entrada) e em D3 e D7 do ensaio. (C) expressão co de PD-1, 3-LAG e TIM-3 em células T de carro em D3 do ensaio. (Topo) Retenção de estratégias para identificar células T expressando 1, 2 ou 3 receptores inibitórios. (Parte inferior) Comparação de: CD4+ células (único subconjunto), CD8+ células (único subconjunto), CD8+ células (dentro do grupo "misto"). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59275/59275fig3large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Table 1" src="/files/ftp_upload/59275/59275table1.jpg"> Tabela 1: Mapa de placa representativa da instalação de reexposição.

Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Tumor Cell Rechallenge For Predictive Evaluation of Chimeric Antigen Receptor T Cell Antitumor Function at JoVE.com

In Vitro Tumor Cell Rechallenge For Predictive Evaluation of Chimeric Antigen Receptor T Cell Antitumor Function

Em Vitro Tumor Cell reexposição para avaliação preditiva de Receptor de antígeno quimérico célula T função antitumoral

Aqui, descrevemos um método in vitro co-cultura para recursivamente desafio tumor-alvo as células T, que permite a análise fenotípica e funcional da atividade antitumoral de célula T.

The field of chimeric antigen receptor (CAR) T cell therapy is rapidly advancing with improvements in CAR design, gene-engineering approaches and ...

Este protocolo fornece um método funcional de longo prazo, in vitro, para a avaliação do receptor de antígeno quimérico, ou células CAR T, através de desafio celular tumoral repetitivo. Esta técnica é menos demorada e menos trabalhosa do que a avaliação da função celular IN VIVO CAR T, ao mesmo tempo em que consegue uma representação precisa da verdadeira eficácia anti-tumor. Esta técnica in vitro permite a triagem de alto rendimento e diferenciação da potência anionfí tumoral da célula CAR T.Que tem a aplicação potencial para avaliar a eficácia clínica dos produtos celulares CAR T. Comece por dissociar tumores de glioblastoma de uma cultura glioblastoma tumorsphere. Com um mililitro de accutase frio, e 30 a 60 segundos de pipetação.Quando os tumores tiverem sido interrompidos, pare a reação com cinco mililitros de meio de co-cultura quente. E pelotar as suspensões das células tumorais por centrifugação. Suspenda as células de glioblastoma para uma redução de 1,6 vezes 10 para o quinto tumoral por mililitro de concentração média de cocultura fresca, e diluir células T colhidas de uma cultura celular CAR T para a porcentagem apropriada de células T positivas CAR por mililitro de concentração média de cocultura.Em seguida, adicione 100 microliters das células tumorais diluídas a cada poço de uma placa de cultura de tecido fundo bem plana de 96. E 100 microliters de células CAR T em cada poço de células tumorais com mistura suave. Em seguida, coloque a placa em uma incubadora de 37 graus Celsius, 5% de dióxido de carbono.Nos dias dois, quatro e seis da cultura, remova cuidadosamente 50 microliters de médio de cada poço da célula tumoral, placa de cocultura de células T programada para recoleção de acordo com a tabela. Em seguida, adicione 50 microliters de suspensão celular glioblastoma fresco, preparado como apenas demonstrado, mas com o dobro do número celular da co-cultura inicial a cada poço com mistura suave. E devolva a placa à incubadora de cultura celular.Dias um, três, cinco e sete de co-cultura, transfira o supernante de cada poço para ser colhido em uma nova placa inferior redonda de 96 de acordo com a tabela e adicione 50 microliters de 0,5% edta de trypsin em cada poço empobrecido médio. Após cinco minutos a 37 graus Celsius, confirme que as células se separaram da parte inferior de cada poço por microscopia leve, e pipeta suavemente a solução enzimápica ao redor da parte inferior de cada poço para resuspensar as células. Antes de transferir a suspensão da célula destacada para os poços correspondentes apropriados da nova placa de 96 poços.Pelotar as células por centrifugação, e lavar as células com 200 microliters de fluorescentes ativados solução de classificação celular, ou FFS por poço com uma segunda centrifugação. Suspenda as pelotas em 100 microliters do coquetel de anticorpos de interesse em 100 microliters de SSS por poço para uma incubação de 30 minutos a quatro graus Celsius. A extremidade da incubação remover qualquer anticorpo desvinculado por lavagens FSS sequenciais de 100 e 200 microliteres e suspender as células em 100 a 200 microliters de mancha nuclear DAPI e FSS.Em seguida, analise as células de acordo com protocolos de análise citométrica de fluxo padrão. Para análise funcional e fenotípica das células CAR T após a co-cultura das células tumorais, recupere os arquivos de dados do citômetro de fluxo e proteva todas as células negativas da DAPI ao vivo. Para quantificar as células tumorais, portal a população CD45 negativa.Para quantificar as células CAR T, o cd45 positivo car população positiva. Em seguida, plote os números de células tumorais e CAR T ao longo do tempo do experimento, identificando a ativação de células T pela co-expressão de 41BB e CD69. Exaustão de células T pela expressão de PD1, LAG3 e TIM3, e o status de memória de células T LAG3, e TIM3, e o status de memória de célula T por CD45RO, e expressão ligante CD62.por CD45RO, e cd62 expressão ligand. Tanto as células CD4 positivos quanto as células CAR T positivas são igualmente ativadas contra células glioblastoma que expressam o antígeno alvo, conforme indicado por sua expressão CD107a e citocina intracelular. No entanto, como avaliado pelo desafio do tumor repetitivo SA, CD4 positivo, mas não CD8 positivo, as células CAR T são capazes de matar múltiplas rodadas.As células CAR T positivas CD4 também alcançam uma expansão mais robusta. Quando as células CD4 positivas, e CD8 positive CAR T são misturadas em uma proporção de um para um, esta combinação de células executa cd8 positiva, mas não células CAR T positivas CD4 em termos de citotoxicidade de longo prazo. Além disso, a expansão das células CAR T positivas CD8 é induzida pela adição de células T cd4 positivas.Enquanto a expansão positiva das células CAR T do CD4 é inibida na presença de células positivas de CDa. 24 horas após a co-cultura inicial, as células CAR T positivas cd4 e CD8 são ativadas da mesma forma. Durante o desafio do tumor repetitivo, as células CAR T positivas cd4 e CD8 demonstram uma transição de um fenótipo de memória central cd45RO positivo, para um fenótipo de memória de efeito negativo CD62 cd62 negativo cd62.As células CAR T positivas CD8 também são mais propensas à exaustão em comparação com as células CAR T positivas CD4, conforme avaliado por sua expressão PD1, LAG3 e TIM3 após três dias de co-cultura. Além disso, não observadas diferenças observadas na exaustão positiva da célula CAR T CDa na presença ou ausência de células T positivas cd4, indicando que a expansão positiva da célula CAR T cd8 induzida pelo CD4 não está associada a uma melhor função de efeito. Este ensaio também pode ser associado à classificação das células T formam a co-cultura para realizar análises mais aprofundadas em transcriptomes, proteômicas e genes específicos de interesse.Esse desafio repetitivo do tumor também pode ser usado como plataforma para investigar os eventos biológicos pós reconhecimento de tumor de células CAR T.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Target Cell Pre-enrichment and Whole Genome Amplification for Single Cell Downstream Characterization

Amplificação de genoma pré-enriquecimento e toda célula alvo para jusante caracterização única célula

Rare target cells can be isolated from a high background of non-target cells using antibodies specific for surface proteins of target cells. A recently ...

Pesquisa do câncer

A Syngeneic Mouse B-Cell Lymphoma Model for Pre-Clinical Evaluation of CD19 CAR T Cells

Um modelo de linfoma de célula B Syngeneic Mouse para avaliação pré-clínica de pilhas de T de carro CD19

The astonishing clinical success of CD19 chimeric antigen receptor (CAR) T-cell therapy has led to the approval of two second generation chimeric antigen ...

Real Time Detection of In Vitro Tumor Cell Apoptosis Induced by CD8+ T Cells to Study Immune Suppressive Functions of Tumor-infiltrating Myeloid Cells

Real Time Detection of In Vitro Tumor Cell Apoptosis Induced by CD8+ T Cells to Study Immune Suppressive Functions of Tumor-infiltrating Myeloid Cells

Detecção de tempo real em Vitro Tumor celular apoptose induzida por CD8+ T células para estudar as funções imunológicas supressora de Tumor infiltrando células mieloides

Potentiation of the tumor-killing ability of CD8+ T cells in tumors, along with their efficient tumor infiltration, is a key element of successful ...

Flow Cytometric Analysis of Mitochondrial Reactive Oxygen Species in Murine Hematopoietic Stem and Progenitor Cells and MLL-AF9 Driven Leukemia

Análise Citométrica de fluxo de espécies reativas de oxigênio mitocondrial em células tronco e progenitoras hematopoiéticas Murinas e leucemia acionada por MLL-AF9

We present a flow cytometric approach for analyzing mitochondrial ROS in various live bone marrow (BM)-derived stem and progenitor cell populations from ...

Manufacturing Chimeric Antigen Receptor (CAR) T Cells for Adoptive Immunotherapy

Manufacturing Chimeric Antigen Receptor CAR T Cells for Adoptive Immunotherapy

Fabricação de células T do receptor de antígeno quimérico (CAR) para imunoterapia adotiva

Adoptive immunotherapy holds promise for the treatment of cancer and infectious disease. We describe a simple approach to transduce primary human T cells ...

Using Human Induced Pluripotent Stem Cells for the Generation of Tumor Antigen-specific T Cells

Usando células-tronco pluripotentes induzidas pelo homem para a geração de células T específicas de antígeno tumoral

The generation and expansion of functional T cells in vitro can lead to a broad range of clinical applications. One such use is for the treatment of ...

Generation of Orthotopic Pancreatic Tumors and Ex vivo Characterization of Tumor-Infiltrating T Cell Cytotoxicity

Generation of Orthotopic Pancreatic Tumors and Ex vivo Characterization of Tumor-Infiltrating T Cell Cytotoxicity

Geração de tumores pancreáticos ortotópicos e caracterização ex vivo da citotoxicidade de células T infiltrada tumoral

In vivo models of pancreatic cancer provide invaluable tools for studying disease dynamics, immune infiltration and new therapeutic strategies. The ...

In Vitro Evaluation of Oncogenic Transformation in Human Mammary Epithelial Cells

Avaliação In Vitro da Transformação Oncogênica em Células Epiteliais Mamárias Humanas

Tumorigenesis is a multi-step process in which cells acquire capabilities&#160;that allow their growth, survival, and dissemination under hostile ...

Dynamic Imaging of Chimeric Antigen Receptor T Cells with [18F]Tetrafluoroborate Positron Emission Tomography/Computed Tomography

Dynamic Imaging of Chimeric Antigen Receptor T Cells with [18F]Tetrafluoroborate Positron Emission Tomography/Computed Tomography

Imagem dinâmica das células T do receptor de antígeno quimérico com [18F]Tetrafluoroborate Positron Emission Tomography/Tomografia Computadorizada

T cells genetically engineered to express chimeric antigen receptors (CAR) have shown unprecedented results in pivotal clinical trials for patients with B ...

Evaluation of the In vivo Antitumor Activity of Polyanhydride IL-1&#945; Nanoparticles

Evaluation of the In vivo Antitumor Activity of Polyanhydride IL-1ÃƒÅ½Ã‚Â± Nanoparticles

Avaliação da Atividade Antitumoral In vivo de Nanopartículas de Polianidrido IL-1α

Cytokine therapy is a promising immunotherapeutic strategy that can produce robust antitumor immune responses in cancer patients. The proinflammatory ...