Name: in vitro tumor cell rechallenge for predictive evaluation of chimeric antigen receptor t cell antitumor function
Uploaded: 2019-02-27T15:00:00
Duration: 8 min 4 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Tumor Cell Rechallenge For Predictive Evaluation of Chimeric Antigen Receptor T Cell Antitumor Function at JoVE.com

Este trabajo fue financiado por becas del Instituto de California de medicina regenerativa (CIRM) grant 05641 TR3 y subvenciones de NIH CA33572 P30 (núcleos). D.W. es apoyado por becas NCI 1F99CA234923-01.

La IRB no requiere la revisión de este protocolo. Recibimos muestras de tumor glioblastoma fresco desechados de la ciudad de esperanza patología Departamento de que se cifran, y nuestro laboratorio no puede acceder a la clave. Recibimos a las muestras con datos solamente en estado de enfermedad y tratamiento previo en el momento de la biopsia/resección, sin datos de identificación.
1. preparación de medios de comunicación
<ol><li>Preparar medios de células madre neurales para el cultivo de líneas de células primarias de GBM: DMEM:F12, 1:50 B27, 5 μg/mL heparina y 2 mmol/L L-glutamina; complementado con ng/mL 20 factor de crecimiento epidérmico (EGF) y factor de crecimiento básico del fibroblasto (FGF) de ng/mL 20 veces por semana (véase Tabla de materiales).</li>
	<li>Preparar los medios de comunicación de la célula de T: 15 X-VIVO que contiene 10% de suero fetal de ternero (FCS); complementado con rhIL-2 y 0,5 ng/mL rhIL-15 de 70 UI/mL cada 48 horas (véase Tabla de materiales).</li>
	<li>Preparar medios de cultivo Co: media de células madre neuronales sin suplemento de EGF y FGF, y añadir 10% FCS.</li>
	<li>Preparar FACS (FSS) de solución de tinción: HBSS, 2% FCS, NaN3 (0.5 g/500 mL).</li>
</ol>2. preparación de las células tumorales GBM
<ol><li>Recoger esferas de tumor GBM de paso bajo (TSs) por centrifugación a 300 x g durante 4 min y descartar el sobrenadante. Nota: Tumor GBM esferas (TSs) se generan de resecado tumores como se describió anteriormente22,23,24y mantenido en medios de comunicación neural de células madre en incubadoras con 5% CO2 a 37 ° C.</li>
	<li>Medios de cultivo Co precalentamiento en baño de agua de 37 ° C.</li>
	<li>Añadir 1 mL de accutase fría a GBM TSs disociar TSs mediante pipeteo para 30-60 s y dejar de disociación añadiendo 5 mL de medio de cocultivo caliente. Nota: GBM TSs no debe mantenerse en accutase para más de 5 minutos.</li>
	<li>Cosechar células GBM por centrifugación a 300 x g durante 4 min, descartar el sobrenadante y resuspender las células en 2 mL de medio de cultivo Co.</li>
	<li>Determinar la concentración de células usando un contador de viabilidad celular. Nota: Viabilidad de las células debe ser > 70%.</li>
</ol>3. preparación de células de T automóvil
<ol><li>Menos de 24 h antes del ensayo, tomar 100 μl de células de T automóvil cultivadas en un tubo de citómetro de flujo y añadir 2 mL de FSS. Nota: Las células de T automóvil fueron generadas como se ha descrito anteriormente11,21 y cultivadas en medios de comunicación de la célula de T.</li>
	<li>Centrifugación a 300 x g durante 4 min y descartar sobrenadante.</li>
	<li>Añadir 2 mL de FSS para lavar las células, centrifugar a 300 x g durante 4 min y descartar el sobrenadante.</li>
	<li>Se tiñen las células con el anticuerpo apropiado para indicar la expresión de coche a 4 ° C durante 30 minutos. Nota: Por ejemplo, si un coche dirigido de IL13Rα2 descrito anteriormente25 se utiliza, luego la mancha con el anticuerpo anti-IL13.</li>
	<li>Lavar dos veces con 2 mL de FSS y analizar exn de coche utilizando un citómetro de flujo.</li>
	<li>Determinar el % de coches en las células T utilizando la estrategia bloquea que se muestra en la figura 1B.</li>
	<li>En el día de la cultura, cosechar todas las células de T automóvil por centrifugación a 300 x g durante 4 min, descartar el sobrenadante y resuspender las células en 2 mL de medio de cultivo Co.</li>
	<li>Determinar la concentración de células usando un contador de viabilidad celular. Nota: Viabilidad de las células debe ser > 70%.</li>
</ol>4. configurar el tumor — cocultivo de células T
<ol><li>Diluir las células del tumor a una concentración de 0,16 millones/mL con medio de cultivo Co.</li>
	<li>Basado en el coche %, diluir las células de T automóvil a una concentración de 0,04 millones células/mL del coche+ con medios de cultivo Co. Nota: Por ejemplo, si el coche es un 50% y concentración de la célula de T es de 0,4 millones/mL, luego realizar una dilución 1:5 para obtener la concentración final de coche+ 0,04 millones células/mL.</li>
	<li>Pipetear 100 μl de las células tumorales diluido en cada pocillo de una placa de cultivo de tejidos de 96 pozos de fondo plano.</li>
	<li>Pipetear 100 μl de células de T automóvil diluidas en cada pocillo que contiene la mezcla y las células tumorales bien. Nota: Se analizará cada cocultivo de células T tumor en 4 puntos del tiempo. 4-6 repeticiones podrían ser necesarios cada vez punto basado en diferentes análisis, pero < 3 repeticiones por el momento no se recomienda; Vea la tabla 1 para un representante platemap.</li>
	<li>Mantener la placa a 37 ° C, 5% CO2 incubadora.</li>
</ol>5. tumor de la célula Rechallenge
Nota: Rechallenge ocurre en 2, 4 y 6 días post la configuración inicial de cocultivo (figura 1A).
<ol><li>Cosecha y disociar GBM TSs como se describió anteriormente (pasos 2.1-2.6).</li>
	<li>Resuspender las células GBM en una concentración de 0,64 millones/mL.</li>
	<li>Determinar los pozos de la cultura que necesitan rechallenge (ver tabla 1) y retire con cuidado los medios de comunicación μl 50 desde la parte superior de cada pozo.</li>
	<li>Añadir 50 μl de suspensión celular GBM en cada pozo y mezclar bien, luego vuelva a colocar la placa en a 37 ° C, 5% CO2 incubadora.</li>
</ol>6. cosecha de muestras y análisis cytometric del flujo
Nota: Las muestras serán cosechadas en el post de días 1, 3, 5 y 7 que la configuración inicial de co-cultivo, con 1, 2, 3 y 4 rondas de desafío del tumor, respectivamente.
<ol><li>Solución de tripsina-EDTA 0.05% precalentamiento en baño María de 37 ° C.</li>
	<li>Determinar los pozos que necesitan recolección y transferencia de los medios de comunicación en una nueva placa de 96 pocillos de fondo redondo.</li>
	<li>Pipetear 50 μl de tripsina-EDTA en los pozos de digerir células restantes del tumor a 37 ° C durante 5 minutos.</li>
	<li>Bajo el microscopio, confirman que las células han separado de la parte inferior.</li>
	<li>Pipetear en la parte inferior bien para resuspender las células separadas, luego transferencia de tripsina-EDTA con células separadas en los pocillos correspondientes de la placa de 96 pocillos de fondo redondo.</li>
	<li>Centrífuga de la placa de 96 pocillos de fondo redondo a 300 x g, 4 ° C por 4 minutos, luego deseche el sobrenadante.</li>
	<li>Agregar 200 μL/pocillo de FSS para lavar las células, centrifugar a 300 x g, 4 ° C por 4 minutos, luego deseche el sobrenadante.</li>
	<li>Resuspender las células en 100 μL/pocillo FSS que contiene anticuerpos (véase Tabla de materiales) y tinción de las células a 4 ° C durante 30 minutos.</li>
	<li>Añadir 100 μL/pocillo FSS a células, centrifugar a 300 x g, 4 ° C durante 4 min, entonces descartar sobrenadante.</li>
	<li>Agregar 200 μL/pocillo de FSS para lavar las células, centrifugar a 300 x g, 4 ° C por 4 minutos, luego deseche el sobrenadante.</li>
	<li>Resuspender las células con 100-200 μL/pocillo de FSS con DAPI de 500 ng/mL, entonces el análisis de muestras por citometría de flujo.</li>
</ol>7. funcional y Phen Otypic análisis de las células de T automóvil
<ol><li>Recuperar los archivos de datos de citometría de flujo y todos (DAPI-) células vivas (figura 1C) de la puerta.</li>
	<li>Cuantificar las células tumorales por bloquear el CD45 coche T células por bloquear el CD45 y población– +, coche + población (figura 1C). Nota: Si las células tumorales expresan CD45 (e.g. células del linfoma de Raji), anti-CD3 tinción puede utilizarse para diferenciar las células de T de las células del tumor.</li>
	<li>Trama de la célula del tumor y número de células T de coche por el curso del tiempo.</li>
	<li>Identificar la activación de la célula de T por la coexpresión de 4-1BB y CD69. Nota: Estos marcadores de superficie pueden utilizarse para analizar T activación 6-24 h post inicial co cultivo celular.</li>
	<li>Identificar agotamiento de la célula de T por la expresión de PD-1, LAG-3 y TIM-3.</li>
	<li>Identificar el estado de la memoria de la célula de T por la expresión de CD45RO y CD62L.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Porter, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chimeric+antigen+receptor+T+cells+persist+and+induce+sustained+remissions+in+relapsed+refractory+chronic+lymphocytic+leukemia.">Chimeric antigen receptor T cells persist and induce sustained remissions in relapsed refractory chronic lymphocytic leukemia.</a> Science Translational Medicine. 7 (303), (2015).</li><li>Brentjens, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD19-targeted+T+cells+rapidly+induce+molecular+remissions+in+adults+with+chemotherapy-refractory+acute+lymphoblastic+leukemia.">CD19-targeted T cells rapidly induce molecular remissions in adults with chemotherapy-refractory acute lymphoblastic leukemia.</a> Science Translational Medicine. 5 (177), (2013).</li><li>Grupp, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chimeric+antigen+receptor-modified+T+cells+for+acute+lymphoid+leukemia.">Chimeric antigen receptor-modified T cells for acute lymphoid leukemia.</a> The New England Journal of Medicine. 368 (16), 1509-1518 (2013).</li><li>Lee, D. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cells+expressing+CD19+chimeric+antigen+receptors+for+acute+lymphoblastic+leukaemia+in+children+and+young+adults:+a+phase+1+dose-escalation+trial.">T cells expressing CD19 chimeric antigen receptors for acute lymphoblastic leukaemia in children and young adults: a phase 1 dose-escalation trial.</a> The Lancet. 385 (9967), 517-528 (2015).</li><li>Yong, C. S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CAR+T-cell+therapy+of+solid+tumors.">CAR T-cell therapy of solid tumors.</a> Immunology and Cell Biology. 95 (4), 356-363 (2017).</li><li>Barrett, D. M., Singh, N., Porter, D. L., Grupp, S. A., June, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chimeric+antigen+receptor+therapy+for+cancer.">Chimeric antigen receptor therapy for cancer.</a> Annual Review of Medicine. 65, 333-347 (2014).</li><li>Priceman, S. J., Forman, S. J., Brown, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Smart+CARs+engineered+for+cancer+immunotherapy.">Smart CARs engineered for cancer immunotherapy.</a> Current Opinion in Oncology. 27 (6), 466-474 (2015).</li><li>Fesnak, A. D., June, C. H., Levine, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineered+T+cells:+the+promise+and+challenges+of+cancer+immunotherapy.">Engineered T cells: the promise and challenges of cancer immunotherapy.</a> Nature Reviews Cancer. 16 (9), 566-581 (2016).</li><li>Esensten, J. H., Bluestone, J. A., Lim, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+Therapeutic+T+Cells:+From+Synthetic+Biology+to+Clinical+Trials.">Engineering Therapeutic T Cells: From Synthetic Biology to Clinical Trials.</a> Annual Review of Pathology. 12, 305-330 (2017).</li><li>Lim, W. A., June, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Principles+of+Engineering+Immune+Cells+to+Treat+Cancer.">The Principles of Engineering Immune Cells to Treat Cancer.</a> Cell. 168 (4), 724-740 (2017).</li><li>Brown, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+IL13Ralpha2-Targeted+Chimeric+Antigen+Receptor+T+Cells+for+Improved+Anti-tumor+Efficacy+against+Glioblastoma.">Optimization of IL13Ralpha2-Targeted Chimeric Antigen Receptor T Cells for Improved Anti-tumor Efficacy against Glioblastoma.</a> Molecular Therapy. , (2017).</li><li>Long, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=4-1BB+costimulation+ameliorates+T+cell+exhaustion+induced+by+tonic+signaling+of+chimeric+antigen+receptors.">4-1BB costimulation ameliorates T cell exhaustion induced by tonic signaling of chimeric antigen receptors.</a> Nature Medicine. 21 (6), 581-590 (2015).</li><li>Cherkassky, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+CAR+T+cells+with+cell-intrinsic+PD-1+checkpoint+blockade+resist+tumor-mediated+inhibition.">Human CAR T cells with cell-intrinsic PD-1 checkpoint blockade resist tumor-mediated inhibition.</a> The Journal of Clinical Investigation. 126 (8), 3130-3144 (2016).</li><li>Priceman, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Co-stimulatory+signaling+determines+tumor+antigen+sensitivity+and+persistence+of+CAR+T+cells+targeting+PSCA++metastatic+prostate+cancer.">Co-stimulatory signaling determines tumor antigen sensitivity and persistence of CAR T cells targeting PSCA+ metastatic prostate cancer.</a> Oncoimmunology. 7 (2), 1380764 (2018).</li><li>Eyquem, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+a+CAR+to+the+TRAC+locus+with+CRISPR/Cas9+enhances+tumour+rejection.">Targeting a CAR to the TRAC locus with CRISPR/Cas9 enhances tumour rejection.</a> Nature. 543 (7643), 113-117 (2017).</li><li>Gattinoni, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acquisition+of+full+effector+function+in+vitro+paradoxically+impairs+the+in+vivo+antitumor+efficacy+of+adoptively+transferred+CD8++T+cells.">Acquisition of full effector function in vitro paradoxically impairs the in vivo antitumor efficacy of adoptively transferred CD8+ T cells.</a> The Journal of Clinical Investigation. 115 (6), 1616-1626 (2005).</li><li>Malandro, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonal+Abundance+of+Tumor-Specific+CD4(+)+T+Cells+Potentiates+Efficacy+and+Alters+Susceptibility+to+Exhaustion.">Clonal Abundance of Tumor-Specific CD4(+) T Cells Potentiates Efficacy and Alters Susceptibility to Exhaustion.</a> Immunity. 44 (1), 179-193 (2016).</li><li>Gattinoni, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt+signaling+arrests+effector+T+cell+differentiation+and+generates+CD8++memory+stem+cells.">Wnt signaling arrests effector T cell differentiation and generates CD8+ memory stem cells.</a> Nature Medicine. 15 (7), 808-813 (2009).</li><li>Klebanoff, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Central+memory+self/tumor-reactive+CD8++T+cells+confer+superior+antitumor+immunity+compared+with+effector+memory+T+cells.">Central memory self/tumor-reactive CD8+ T cells confer superior antitumor immunity compared with effector memory T cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (27), 9571-9576 (2005).</li><li>Gattinoni, L., Klebanoff, C. A., Restifo, N. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paths+to+stemness:+building+the+ultimate+antitumour+T+cell.">Paths to stemness: building the ultimate antitumour T cell.</a> Nature Reviews Cancer. 12 (10), 671-684 (2012).</li><li>Wang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glioblastoma-targeted+CD4++CAR+T+cells+mediate+superior+antitumor+activity.">Glioblastoma-targeted CD4+ CAR T cells mediate superior antitumor activity.</a> JCI Insight. 3 (10), (2018).</li><li>Kahlon, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+recognition+and+killing+of+glioblastoma+multiforme+by+interleukin+13-zetakine+redirected+cytolytic+T+cells.">Specific recognition and killing of glioblastoma multiforme by interleukin 13-zetakine redirected cytolytic T cells.</a> Cancer Research. 64 (24), 9160-9166 (2004).</li><li>Brown, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recognition+and+killing+of+brain+tumor+stem-like+initiating+cells+by+CD8++cytolytic+T+cells.">Recognition and killing of brain tumor stem-like initiating cells by CD8+ cytolytic T cells.</a> Cancer Research. 69 (23), 8886-8893 (2009).</li><li>Lee, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+stem+cells+derived+from+glioblastomas+cultured+in+bFGF+and+EGF+more+closely+mirror+the+phenotype+and+genotype+of+primary+tumors+than+do+serum-cultured+cell+lines.">Tumor stem cells derived from glioblastomas cultured in bFGF and EGF more closely mirror the phenotype and genotype of primary tumors than do serum-cultured cell lines.</a> Cancer Cell. 9 (5), 391-403 (2006).</li><li>Brown, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regression+of+Glioblastoma+after+Chimeric+Antigen+Receptor+T-Cell+Therapy.">Regression of Glioblastoma after Chimeric Antigen Receptor T-Cell Therapy.</a> The New England Journal of Medicine. 375 (26), 2561-2569 (2016).</li><li>Salter, A. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphoproteomic+analysis+of+chimeric+antigen+receptor+signaling+reveals+kinetic+and+quantitative+differences+that+affect+cell+function.">Phosphoproteomic analysis of chimeric antigen receptor signaling reveals kinetic and quantitative differences that affect cell function.</a> Science Signaling. 11 (544), (2018).</li><li>Rossi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preinfusion+polyfunctional+anti-CD19+chimeric+antigen+receptor+T+cells+are+associated+with+clinical+outcomes+in+NHL.">Preinfusion polyfunctional anti-CD19 chimeric antigen receptor T cells are associated with clinical outcomes in NHL.</a> Blood. 132 (8), 804-814 (2018).</li><li>Garcia-Diaz, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interferon+Receptor+Signaling+Pathways+Regulating+PD-L1+and+PD-L2+Expression.">Interferon Receptor Signaling Pathways Regulating PD-L1 and PD-L2 Expression.</a> Cell Reports. 19 (6), 1189-1201 (2017).</li><li>Walker, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+Antigen+and+Receptor+Densities+Regulate+Efficacy+of+a+Chimeric+Antigen+Receptor+Targeting+Anaplastic+Lymphoma+Kinase.">Tumor Antigen and Receptor Densities Regulate Efficacy of a Chimeric Antigen Receptor Targeting Anaplastic Lymphoma Kinase.</a> Molecular Therapy. 25 (9), 2189-2201 (2017).</li><li>Fraietta, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determinants+of+response+and+resistance+to+CD19+chimeric+antigen+receptor+(CAR)+T+cell+therapy+of+chronic+lymphocytic+leukemia.">Determinants of response and resistance to CD19 chimeric antigen receptor (CAR) T cell therapy of chronic lymphocytic leukemia.</a> Nature Medicine. 24 (5), 563-571 (2018).</li><li>Fraietta, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disruption+of+TET2+promotes+the+therapeutic+efficacy+of+CD19-targeted+T+cells.">Disruption of TET2 promotes the therapeutic efficacy of CD19-targeted T cells.</a> Nature. 558 (7709), 307-312 (2018).</li></ol>

La construcción de coche descrita en este trabajo han sido autorizados por Mustang Bio., Inc., para la cual S.J.F. y C.E.B. reciben pago de regalías. Otros autores no declaran conflictos de interés.

Este ensayo de desafío repetitivo tumor células proporciona un enfoque conveniente para evaluar la potencia funcional de células T coche, usando un setup in vitro que recapitula la carga tumoral alta relacionada con modelos de tumores in vivo. Durante este ensayo de 7 días, las células T auto someterse a cuatro rondas de desafío de tumor (cultura Co inicial y rechallenge x 3), creando un ambiente donde agotado de las células T pueden perder su capacidad para responder al desafío del tumor a pesar de una respuesta inicial potente. Eliminación de células de tumor y la expansión de células T auto representan dos lecturas fundamentales que se pueden adquirir de este ensayo, mientras que los fenotipos de las células de T del coche pueden ser analizados fácilmente por la coloración superficiales o intracelulares marcadores que indican activación de la célula de T, agotamiento o memoria. Este ensayo también es conveniente combinar con el análisis imparcial de coche T células transcriptoma proteoma o fósforo-proteoma21,26y polifuncionalidad de la célula de T que se ha adoptado para predecir la respuesta clínica27. Además, las células del tumor se pueden también probar su respuesta adaptativa contra la inmunidad de células T como citoquinas secreción28. Puesto que las muestras se cosechan en varios puntos del tiempo, este análisis permite no sólo estática, sino también un análisis dinámico del comportamiento de la célula T coche cuando responde al exceso de número de las células tumorales.
El ensayo es particularmente potente en comparación de la potencia de efector de las células de T del coche contra el mismo antígeno pero con diferentes diseños o procesos de fabricación. Hemos utilizado este test para identificar que CD4+ coche T células eran capaces de mediar la superior función de generador de efectos a largo plazo que CD8 células de+ 21. También ha demostrado que esa eficacia in vivo del coche se correlacionó con la citotoxicidad en momentos posteriores (D5-D7) durante este ensayo, destacando aún más la necesidad de utilizar desafío tumor repetitivas para evaluación in vitro de células de T del coche. Aunque las células GBM fueron utilizadas como el ejemplo de las células de blanco aquí, este análisis podrían adoptar fácilmente a una combinación de tumor de la célula de T diferentes. En particular, comportamiento de la célula T de coche también puede variar al antígeno diferentes densidades e Ingeniería de las células de cáncer para expresar distintos niveles de antígenos específicos proporcionados la herramienta para investigar acontecimientos secuenciales moleculares al auto reconocimiento29. Por lo tanto, este análisis también pueden ser explotada para examinar el patrón de activación de ciertas células de T automóvil contra diferentes blancos.
Puesto que la viabilidad de las células objetivo y expansión de células T del coche son dos lecturas iniciales de este ensayo, es crítico que todas las culturas del co empezar con viable (> 70%) tumor y las células de T. Al realizar los procesos de nueva provocación, la acción de los medios de aspiración (paso de 5.3) no debe molestar a tumor y células de T en la parte inferior de los pozos, a fin de no introducir variaciones innecesarias de recuentos de las células. Al realizar este análisis en líneas de células suspensión blanco, se recomienda cosechar células restantes por centrifugación antes de rechallenge de tumor de la célula.
Una limitación de este ensayo es que los parámetros de configuración (e: t ratios de co-cultivo inicial y rechallenge) necesita ser ajustado en base a diferentes combinaciones de CAR-tumor. Por ejemplo, si las células tumorales expresan un nivel considerable de moléculas inmuno inhibidora (por ejemplo, PD-L1), un cociente más alto de e: t se recomienda teniendo en cuenta que el general matar a eficiencia se deteriora en comparación con las células del tumor PD-L1-bajo. Antes de aplicar el ensayo de nuevas combinaciones de coche-tumor, se recomienda un estudio piloto para determinar las condiciones óptimas, que generalmente permite que las células T coche más potentes en el ensayo para eliminar > 80% de las células del tumor en el punto final. Puesto que es necesario contacto directo célula-célula respecto mediada por células T a los coches, si las células del tumor eran marcados con fluorescencia, luego el panel de análisis cytometric del flujo debe ajustarse en consecuencia (por ejemplo, si las células del tumor eran marcados con GFP, entonces cualquier conjugado FITC anticuerpos no deberían utilizarse).
La actividad clínica de las células de T automóvil contra neoplasias de células B ha llevado a dos medicamentos aprobados por la FDA. Sin embargo, la respuesta ha mostrado una variación sustancial en diferentes pacientes27,30,31, que fue aclarada a correlacionar con las propiedades fenotípicas de los productos de coche30. Este ensayo de desafío tumor repetitivo in vitro más proporciona un enfoque para probar funcionalmente la potencia de efector del coche además de la caracterización fenotípica y la polifuncionalidad del cytokine producción y permite la detección de un mayor rendimiento de productos clínicos en comparación con modelos in vivo del tumor conservando la fidelidad predictiva. En general, este análisis podrían utilizarse para la prueba funcional de la célula de T para el diseño de células de T automóvil, desarrollo preclínico y clínico.

Inmunoterapia con receptor antígeno quimérico (coche)-Ingeniería de las células T ha visto resultados prometedores contra células B neoplasias malignas1,2,3,4, mientras que el potencial de la focalización de otros tumores sigue bajo la rigurosa investigación5,6,7. Grandes progresos para optimizar la construcción automóvil, proceso de fabricación y pacientes regímenes de pre-infusión6,7,8, y enfoques de la nueva biología sintética se esperan que aumenten sus persistencia, la seguridad y el tumor especificidad9,10. Sin embargo, ha sido difícil y trabajosa para evaluar adecuadamente el potencial terapéutico de las células de T automóvil para orientar la mejor opción para la traducción clínica. El modelo más establecido evaluar la función de la célula de T del coche es en ratones inmunodeficientes xenoinjertos de tumores humanos, por el que las células de T automóvil son examinadas para la eficacia antitumoral y comparadas al celular valorada dosis11,12 , 13 , 14 , 15. estos estudios murinos in vivo son intensivas y desperdiciador de tiempo, sobre todo cuando gran número de parámetros de detección. Estudios más, en vivo pueden ser refrenados por la accesibilidad de las cepas de ratón, instalaciones de cuidado de los animales y técnicas de manejo de animales. Por lo tanto, es necesario desarrollar más convenientes ensayos in vitro que permite lecturas rápidas de la actividad del efector, que también fielmente reflejan la función antitumoral in vivo de estas células T.
Los métodos convencionales para determinar la citotoxicidad de las células T in vitro se han centrado en la detección de degranulación, producción de citoquinas y la capacidad de lisar las células de la blanco marcado con radioisótopos (es decir, ensayos de liberación de cromo). Mientras que estos ensayos son de caracter informativos para la definición de coche T célula especificidad y reconocimiento objetivo redireccionado, a menudo no reflejan el potencial antitumoral in vivo de ingeniería T células12,13,16. En algunos casos, en vitro matando a actividad en ensayos a corto plazo demostró una correlación inversa con función antitumoral in vivo16. Tal inconsistencia es probablemente el resultado de las relaciones de alta efectoras: objetivo (e: t) utilizado en estos ensayos in vitro y por lo tanto la incapacidad para diferenciar los productos de células T del coche que son propensos al agotamiento17. Por el contrario, durante la erradicación del tumor in vivo T las células generalmente responden contra las cargas grandes del tumor, por lo que requiere múltiples rondas de muerte y posteriormente conducir células T diferenciación y agotamiento18,19, 20, que es una de las principales barreras contra la separación efectiva del tumor por coche T células12,13. Mientras tanto, más a corto plazo ensayos in vitro de la matanza también hacen no lectura diferencias en la proliferación de células T, mientras que en coche T célula tratado pacientes la capacidad de expansión de células T auto esta fuertemente correlacionada con respuestas clínicas4. Así, el ensayo in vitro adecuado tendría que recapitular las condiciones de carga del tumor alto, inducción de agotamiento de la célula de T y permite la lectura de la expansión de células T.
Aquí, describimos una estrategia para evaluar las células de T de coche para tumor repetitiva muerte potencial, con un ensayo simple cocultivo in vitro. Parámetros de actividad diferentes células de T effector pueden examinar simultáneamente, incluyendo la matanza de la célula blanco, expansión de células T auto y fenotipos asociados de memoria o agotamiento. Los resultados generados a partir de este análisis se correlacionan bien con el efecto antitumoral in vivo de células T auto y pueden ser aprovechados para evaluar la potencia de los productos de células T del coche. Mientras se describe un ensayo para evaluar las células de T de coche orientada a IL13Ra2 contra primaria GBM líneas21, puede ser adaptado fácilmente a cualquier plataforma de célula de T del coche.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1084px;" width="1083">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:451px;">0.05% Trypsin/0.53mM EDTA in HBSS w/o Calcium and Magnesium</td>
			<td style="width:123px;">Corning</td>
			<td style="width:344px;">MT25051CI</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:451px;">1M Hepes</td>
			<td style="width:123px;">Irvine Scientific</td>
			<td style="width:344px;">9319</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:451px;">200 mM L-Glutamine</td>
			<td style="width:123px;">Cambrex Bio Science</td>
			<td style="width:344px;">17-605E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:451px;">4&#39;,6-diamidino-2-phenylindole, dihydrochloride (DAPI) - FluoroPure grade</td>
			<td style="width:123px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:344px;">D21490</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:451px;">Accutase</td>
			<td style="width:123px;">Innovative Cell Technologies</td>
			<td style="width:344px;">AT104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:451px;">Aldesleukin Proleukin (rhIL-2)</td>
			<td style="width:123px;">Novartis Oncology</td>
			<td style="width:344px;">NDC 0078-0495-61</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Anti-CD137, PE</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555956</td>
			<td>4B4-1</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Anti-CD19, PE-Cy7</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>557835</td>
			<td>SJ25C1</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Anti-CD3, PERCP</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>340663</td>
			<td>SK7</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Anti-CD4, FITC</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>340133</td>
			<td>SK3</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Anti-CD45, PERCP</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>340665</td>
			<td>2D1</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Anti-CD45RO, PE</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>561137</td>
			<td>UCHL1</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Anti-CD62L, APC</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>559772</td>
			<td>DREG-56</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Anti-CD69, APC</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>340560</td>
			<td>L78</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Anti-CD8, APC-Cy7</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>348793</td>
			<td>SK1</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Anti-IL-13, PE</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>340508</td>
			<td>JES10-5A2</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Anti-LAG-3, PE</td>
			<td>eBiosciences</td>
			<td>12-2239-41</td>
			<td>3DS223H</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Anti-PD-1, APC-Cy7</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>329921</td>
			<td>EH12.2H7</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Anti-TIM-3, APC</td>
			<td>eBiosciences</td>
			<td>17-3109-42</td>
			<td>F38-2E2</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:451px;">B-27 Serum-Free Supplement (50X)</td>
			<td style="width:123px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:344px;">17504-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:451px;">Corning 96 Well Clear Flat Bottom Polystyrene TC-Treated Microplates, Individually Wrapped, with Lid, Sterile (Product #3596)</td>
			<td style="width:123px;">Corning Life Sciences</td>
			<td style="width:344px;">3596</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:451px;">Defined fetal bovine serum,HI IR</td>
			<td style="width:123px;">Hyclone Labs</td>
			<td style="width:344px;">SH30070.03IH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:451px;">DMEM F-12 50:50 (1X) w/o Glutamine</td>
			<td style="width:123px;">MediaTech, Inc.</td>
			<td style="width:344px;">15-090-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:451px;">DMEM High Gluc w/o L-Glu, Na Pyr 1 L</td>
			<td style="width:123px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:344px;">11960051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:451px;">DMEM-Ham&#39;s F12 50:50 Mixture with L-glutamine and 15 mM HEPES</td>
			<td style="width:123px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:344px;">MT10092CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:451px;">HBSS</td>
			<td style="width:123px;">Irvine Scientific</td>
			<td style="width:344px;">9224</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:451px;">Heat-Inactivated FCS</td>
			<td style="width:123px;">Hyclone</td>
			<td style="width:344px;">SH30070.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:451px;">Heparin Sodium(1,000 U/ml)</td>
			<td style="width:123px;">American Pharmaceutical</td>
			<td style="width:344px;">401811B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:451px;">MACSQuant</td>
			<td style="width:123px;">Milteni Biotech Inc.</td>
			<td style="width:344px;">BIS013220&#160;</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PBS 1X W/CA &#38; MG</td>
			<td>Irvine Scientific</td>
			<td>9236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:451px;">PBS with 1MM EDTA (No Ca2+ or Mg2+)</td>
			<td style="width:123px;">VWR Scientific Products</td>
			<td style="width:344px;">PB15009A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:451px;">Recombinant human EGF</td>
			<td style="width:123px;">R&#38;D Systems</td>
			<td style="width:344px;">236-EG-200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:451px;">Recombinant human FGF</td>
			<td style="width:123px;">R&#38;D Systems</td>
			<td style="width:344px;">233-FB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:451px;">rhIL-15 Working Dilution (10 ng/&#181;L)</td>
			<td style="width:123px;">CellGenix, US Operations</td>
			<td style="width:344px;">tF0297</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="45">
			<td height="45" style="height:45px;width:451px;">Sodium Azide (NaN3)</td>
			<td style="width:123px;">Sigma</td>
			<td style="width:344px;">S8032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:451px;">Sorvall ST40R</td>
			<td style="width:123px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:344px;">41693700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:451px;">TC-HEPES BUFFER (1M) SOLN 100ML&#160;</td>
			<td style="width:123px;">IRVINE SCIENTIFIC CORP</td>
			<td style="width:344px;">6472</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:451px;">Tecnol Procedure Mask</td>
			<td style="width:123px;">Kimberly-Clark</td>
			<td style="width:344px;">47117</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:451px;">X-VIVO 15</td>
			<td style="width:123px;">Lonza</td>
			<td style="width:344px;">BW04-744Q</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro tumor cell rechallenge for predictive evaluation of chimeric antigen receptor t cell antitumor function

El campo de la terapia con linfocitos T antígeno quimérico del receptor (CAR) está avanzando rápidamente con mejoras en diseño, métodos de ingeniería genética y optimizaciones de fabricación. Un reto para estos esfuerzos de desarrollo, sin embargo, ha sido el establecimiento de ensayos in vitro que firme selección de los productos de células T coche óptima para el éxito terapéutico en vivo. Ensayos in vitro estándar tumor-lisis a menudo no reflejan el verdadero potencial antitumoral de las células de T automóvil debido al tiempo de la cultura Co relativamente corto y alto célula de T al cociente de los tumor. Aquí, describimos un método de cultivo in vitro de co evaluar T coche celular recursiva matando a potencial alto tumor celular carga. En este ensayo, función citotóxica a largo plazo y capacidad proliferativa de las células de T automóvil se examinan en vitro más de 7 días con objetivos de tumor adicional administradas la cultura Co todos los días. Este ensayo se puede acoplar con activación de células T perfila, agotamiento y fenotipos de la memoria. Usando este análisis, nos hemos distinguido con éxito las diferencias fenotípicas y funcionales de CD4+ y CD8+ coche T células contra el glioblastoma (GBM), reflejando su diferencial actividad antitumoral in vivo en ortotópico modelos de xenoinjerto. Este método proporciona un enfoque fácil para evaluar la potencia de la célula de T coche y aclarar las variaciones funcionales a través de diferentes productos de células T del coche.

Usando el análisis descrito anteriormente, nos hemos distinguido la potencia diferencial efectoras y matando dinámica mediada por CD4+ y CD8+ coche T las células. Los resultados presentados aquí ilustran la diferencia entre CD4+ y CD8+ coche T células, generadas a partir de un donante sano independiente de nuestra anterior publicación21.
A través de un ensayo estándar de la degranulación, pudimos observar que ambos CD4+ y CD8+ coche T igualmente se convirtió en activan las células contra células GBM que expresan el antígeno específico, como lo indica la expresión de CD107a y citoquinas intracelulares (Figura 2A). Sin embargo, usando el ensayo de desafío de tumor repetitiva, encontró que CD4+ pero no CD8+ coche T las células exhiben la capacidad de matar de múltiples asaltos (figura 2B). CD4+ coche T las células también logra mejor expansión en comparación con las células CD8 + durante este ensayo (figura 2C). La diferencia de expansión entre subconjuntos de células T del coche sólo se observaron de D3 después de dos rondas de desafío de tumor (1:12 e: t), mientras que la diferencia de citotoxicidad se observó comenzando en D5 después de tres rondas de desafío de tumor (1:20 e: t), indicando que ensayos a corto plazo no pudieron aclarar las diferencias en la potencia de diferentes productos de células T del coche. Cuando el 1:1 mezcla CD4+ y CD8+ coche T células se aplicaron a este ensayo, se encontraron para superar a CD8+ pero no CD4+ coche T células de citotoxicidad a largo plazo (figura 2B). La expansión de CD8+ coche T las células fue inducida por el CD4 Co aplicado+ de las células, mientras que los CD4+ expansión de células T auto fue inhibida en presencia de CD8+ las células (figura 2C).
Para explicar el mecanismo que distingue la actividad efectora entre CD4+ y CD8 células+ T coche, primero confirmamos que 24 h después de la inicial Co cultura, ambos CD4+ y CD8+ coche T células eran comparable activada (figura 3 A). Mientras tanto, como se indica por la expresión CD45RO y CD62L, ambos CD4+ y CD8+ coche T las células demostraron una transición de la central de la memoria (CD45RO+, CD62L+) a memoria efectoras (CD45RO+, CD62L–) fenotipo durante el desafío de tumor repetitiva (figura 3B). A continuación, caracterizamos las células en D3 de este ensayo, un tiempo antes de que los subconjuntos de células T auto comenzaron a mostrar diferencia funcional. Agotamiento de la célula de t fue marcada por la expresión conjunta de receptores inhibitorios PD-1, LAG-3 y TIM-315,21, que demostró que CD8+ coche T las células eran más propensas al agotamiento en comparación con CD4+ coche T células () Figura 3 C). Además, no se observaron diferencias en CD8+ agotamiento de la célula T coche en la presencia/ausencia de CD4 Co aplicado+ las células (figura 3C), indicando que inducida por CD4 CD8+ expansión de células T del coche no es asociado con una mejor función efectora.
Juntos, los resultados de este análisis identificaron que CD4+ coche T células CD8 superaron+ células específicamente en citotoxicidad a largo plazo. A pesar de la citotoxicidad a corto plazo similar (1-3 días, una vez rechallenged), CD4+ coche T células efectoras sostenida función reto tumor repetitivo, mientras que los CD8+ las células se convirtieron en agotado y no controlar el crecimiento de células tumorales. Cuando se mezclaron los dos subconjuntos, CD4+ coche T células facilitaron la expansión de CD8 células+ T coche, pero el estado de agotamiento de CD8+ las células no fueron mejoradas, dando por resultado la falta de efecto sinérgico entre los dos grupos. Similar diferencia entre CD4+ y CD8+ coche T las células fue visto en un modelo in vivo como se describió anteriormente21. De hecho, CD8+ coche T células eran capaces de mediar separación a corto plazo de tumor pero seguido con antígeno positivo repetición; en contraste, CD4+ tratamiento de células de T automóvil dio como resultado a largo plazo de la erradicación de tumor21, que es una reminiscencia de su potencial de homicidio repetitivo usando el análisis in vitro del rechallenge.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59275/59275fig1.jpg"> Figura 1 : Esquema y análisis estrategia de ensayo repetitiva. Esquema (A) y línea de tiempo del ensayo de desafío tumor repetitivos. Para cada bien, las células de T automóvil primero fueron cultivadas conjuntamente con las células PBT030-2 GBM (4.000 coches + células, 16.000 células del tumor) y nuevo desafió con 32.000 células tumorales cada otro día (D2, D4 y D6). Análisis de la célula del tumor y número de células de T automóvil, así como fenotipo de la célula de T del coche se realizan en el D1, D3, D5 y D7. (B) estrategia para determinar el % de coches en T que bloquean las células antes de configurar la cultura de cooperación. (C) estrategia de células vivas, células tumorales y las células de T de coche desde el ensayo repetitiva que bloquean. (D) Tumor células número en distintos momentos del ensayo rechallenge, cultivadas conjuntamente con las células de T untransduced. Barras de error = ±SEM. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59275/59275fig1large.jpg" target="_blank">haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59275/59275fig2.jpg"> Figura 2 : Repetitiva, análisis revela diferencias en potencia de muerte y proliferativa CD4+ y CD8+ coche T células. Degranulación de (A) y tinción intracelular citoquinas de CD4+ y CD8 células+ T coche después de 5 h de co-cultivo con células GBM (e: t = 1:1). (B) CD4+, CD8+ o mixtos (CD4:CD8 = 1:1) las células de T automóvil fueron aplicadas a análisis de repetitiva, y se cuantificaron células tumorales viables. p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001 comparado con CD4+, con ANOVA de una vía de pruebas de comparación múltiple de Bonferroni. (C) CD4+ y CD8+ expansión de células T coche durante ensayo de desafío tumor repetitivos. Comparación de (izquierda a derecha) CD4+ vs CD8+, subconjunto único; CD4+ vs CD8+, dentro del grupo "mixto"; CD4+, solo vs mezclados; CD8+, solo vs mezclados. p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001 utilizando la prueba t de Student de una impar. Barras de error = ±SEM. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59275/59275fig2large.jpg" target="_blank">haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59275/59275fig3.jpg"> Figura 3 : Análisis del fenotipo de la célula de T durante ensayo repetitiva. (A) 4-1BB y CD69 tinción en las células de T automóvil en D1 del ensayo. (B) CD45RO y CD62L de tinción de células T auto antes de aplicar para rechallenge ensayo (de entrada) y en D3 y D7 del ensayo. (C) la expresión de PD-1, LAG-3 y TIM-3 en las células de T automóvil D3 del ensayo. (Top) Estrategias para identificar las células T expresan receptores inhibitorios de 1, 2 o 3 que bloquean. (Parte inferior) Comparación de: CD4+ las células (único subconjunto), CD8+ las células (único subconjunto), CD8 células+ (dentro del grupo "mixto"). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59275/59275fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Table 1" src="/files/ftp_upload/59275/59275table1.jpg"> Tabla 1: Mapa de la placa representativa de configuración rechallenge.

Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Tumor Cell Rechallenge For Predictive Evaluation of Chimeric Antigen Receptor T Cell Antitumor Function at JoVE.com

In Vitro Tumor Cell Rechallenge For Predictive Evaluation of Chimeric Antigen Receptor T Cell Antitumor Function

En Vitro Tumor celular Rechallenge de evaluación predictiva de antígeno quimérico del Receptor de la célula T función antitumoral

Aquí, describimos un método de cultivo in vitro de co para recurrentemente desafío orientada a tumor las células T, que permite el análisis fenotípico y funcional de la actividad de las células T antitumorales.

The field of chimeric antigen receptor (CAR) T cell therapy is rapidly advancing with improvements in CAR design, gene-engineering approaches and ...

Este protocolo proporciona un método funcional a largo plazo, in vitro, para la evaluación del receptor de antígeno quimérico, o células T CAR, a través del desafío repetitivo de las células tumorales. Esta técnica consume menos tiempo y consume menos trabajo que la evaluación de la función de células T CAR in vivo, al tiempo que logra una representación precisa de la verdadera eficacia antitumo tumoral. Esta técnica in vitro permite el cribado de alto rendimiento y la diferenciación de la potencia antitumorátuma de las células T CAR.Que tiene la aplicación potencial para evaluar la eficacia clínica de los productos de células T CAR. Comience por disociar las tumoresferas del glioblastoma de un cultivo de tumoresfera del glioblastoma. Con un mililitro de acutasa fría, y 30 a 60 segundos de pipeteo.Cuando las tumoresferas se hayan interrumpido, detenga la reacción con cinco mililitros de medio de co-cultivo cálido. Y peletiza las suspensiones de células tumorales por centrifugación. Re-suspenda las células del glioblastoma a un 1,6 veces 10 a las quintas células tumorales por mililitro de cocultivo fresco de concentración media, y diluya las células T cosechadas de un cultivo de células T CAR al porcentaje adecuado de células T positivas CAR por mililitro de concentración media de cocultivo.A continuación, agregue 100 microlitros de las células tumorales diluidas a cada pozo de una placa de cultivo de tejido inferior plano de 96 pozos. Y 100 microlitros de células T CAR en cada pozo de células tumorales con mezcla suave. A continuación, coloque la placa en una incubadora de dióxido de carbono de 37 grados Celsius, 5%.En los días dos, cuatro y seis de cultivo, retire cuidadosamente 50 microlitros de medio de cada pozo de la célula tumoral, placa de co-cultivo de células T programada para requellenge de acuerdo con la tabla. Luego, agregue 50 microlitros de suspensión de células de glioblastoma fresco, preparados como se acaba de demostrar, pero con el doble de número de células del co-cultivo inicial a cada pozo con mezcla suave. Y devolver la placa a la incubadora de cultivo celular.Los días uno, tres, cinco y siete de co-cultivo, transfieran el sobrenadante de cada pozo para ser cosechados en una nueva placa inferior bien redonda de 96 según la mesa y agreguen 50 microlitros de precalentado 0.5%Trypsin EDTA en cada medio bien agotado. Después de cinco minutos a 37 grados Celsius, confirme que las células se han separado de la parte inferior de cada pozo por microscopía de luz, y pipetee suavemente la solución enzimática alrededor de la parte inferior de cada pozo para resuspender las células. Antes de transferir la suspensión de celda separada a los pozos correspondientes apropiados de la nueva placa de 96 pozos.Pelecila las células por centrifugación, y lave las células con 200 microlitros de fluorescentes activados solución de clasificación celular, o FFS por pozo con un segundo centrifugación. Re-suspenda los pellets en 100 microlitros del cóctel de anticuerpos de interés en 100 microlitros de SSS por pozo para una incubación de 30 minutos a cuatro grados centígrados. Al final de la incubación se elimina cualquier anticuerpo no consolidado mediante lavados secuenciales de 100 y 200 microlitroS FSS y re-suspender las células en 100 a 200 microlitros de la mancha nuclear DAPI y FSS.Luego, analice las células de acuerdo con los protocolos de análisis citométrico de flujo estándar. Para el análisis funcional y fenotípico de las células T CAR después del co-cultivo de células tumorales, recupere los archivos de datos del citómetro de flujo y puerta a todas las células negativas DAPI vivas. Para cuantificar las células tumorales, atenen la población negativa CD45.Para cuantificar los células T CAR puerta la población positiva CD45 CAR positiva. A continuación, trazar el tumor y los números de células T CAR a lo largo del curso del experimento, identificando la activación de la célula T por la coexpresión de 41BB, y CD69. El agotamiento de la célula T por la expresión de PD1, LAG3 y TIM3, y el estado de memoria de la célula T LAG3 y TIM3, y el estado de la memoria de la célula T por CD45RO, y la expresión de ligando CD62.por CD45RO, y CD62 ligand expression. Tanto las células T CAR positivas CD4 como las células T positivas CD8 se activan por igual contra las células del glioblastoma que expresan el antígeno objetivo según lo indicado por su expresión de CD107a y citoquina intracelular. Sin embargo, según lo evaluado por el desafío de tumor repetitivo SA, CD4 positivo, pero no CD8 positivo, células T CAR son capaces de matar múltiples rondas.Los células T de CAR positivas CD4 también logran una expansión más robusta. Cuando las células T CAR POSITIVAs CD4 se mezclan en una proporción de uno a uno, esta combinación de células realiza células T CAR CD8 positivas, pero no CD4 positivas en términos de citotoxicidad a largo plazo. Además, la expansión de los células T DE COCHE POSITIVAs CD8 es inducida por la adición de células T positivas CD4.Mientras que la expansión positiva de la célula T CAR CD4 se inhibe en presencia de células positivas CDa. 24 horas después del co-cultivo inicial, las células CD4 positivas de CAR T se activan de forma similar. Durante el desafío del tumor repetitivo, las células CD4 positivas de CAR T demuestran una transición de un fenotipo de memoria central positivo de ligan CD45RO, ligan CD62, a un fenotipo de memoria de efecto negativo CD62 positivo CD45RO.Las células T positivas de CAR CD8 también son más propensas al agotamiento en comparación con las células T de CAR positivas CD4 evaluadas por su expresión PD1, LAG3 y TIM3 después de tres días de co-cultivo. Además, no se observan diferencias en el agotamiento positivo de las células T CDa en el CAR en presencia o ausencia de células T positivas CD4, lo que indica que la expansión de células T CD8 positivas cd8 inducida por CD4 no está asociada con una mejor función del efector. Este ensayo también se puede combinar con la clasificación de las células T que forman el cocultivo para realizar análisis adicionales sobre transcriptomas, proteómicas y genes específicos de interés.Este desafío tumoral repetitivo también podría utilizarse como plataforma para investigar los eventos biológicos después del reconocimiento del tumor de la célula T CAR.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Target Cell Pre-enrichment and Whole Genome Amplification for Single Cell Downstream Characterization

Destino celular genoma pre-enriquecimiento y toda amplificación sola célula caracterización aguas abajo

Rare target cells can be isolated from a high background of non-target cells using antibodies specific for surface proteins of target cells. A recently ...

Investigación

Investigación sobre el cáncer

A Syngeneic Mouse B-Cell Lymphoma Model for Pre-Clinical Evaluation of CD19 CAR T Cells

Un modelo con ratones Syngeneic células B linfoma de evaluación preclínica de las células de T automóvil CD19

The astonishing clinical success of CD19 chimeric antigen receptor (CAR) T-cell therapy has led to the approval of two second generation chimeric antigen ...

Real Time Detection of In Vitro Tumor Cell Apoptosis Induced by CD8+ T Cells to Study Immune Suppressive Functions of Tumor-infiltrating Myeloid Cells

Real Time Detection of In Vitro Tumor Cell Apoptosis Induced by CD8+ T Cells to Study Immune Suppressive Functions of Tumor-infiltrating Myeloid Cells

Tiempo real detección de Vitro Tumor de la célula apoptosis inducida por CD8+ T las células para el estudio de las funciones inmunológicas de supresores de Tumor infiltrante de células mieloides

Potentiation of the tumor-killing ability of CD8+ T cells in tumors, along with their efficient tumor infiltration, is a key element of successful ...

Flow Cytometric Analysis of Mitochondrial Reactive Oxygen Species in Murine Hematopoietic Stem and Progenitor Cells and MLL-AF9 Driven Leukemia

Análisis citométrico de flujo de especies de oxígeno reactivo mitocondrial en células hematopoyéticas de la muriña y células progenitoras y leucemia impulsada por MLL-AF9

We present a flow cytometric approach for analyzing mitochondrial ROS in various live bone marrow (BM)-derived stem and progenitor cell populations from ...

Manufacturing Chimeric Antigen Receptor (CAR) T Cells for Adoptive Immunotherapy

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Fabricación de células T del receptor de antígeno quimérico (CAR) para inmunoterapia adoptiva

Adoptive immunotherapy holds promise for the treatment of cancer and infectious disease. We describe a simple approach to transduce primary human T cells ...

Using Human Induced Pluripotent Stem Cells for the Generation of Tumor Antigen-specific T Cells

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The generation and expansion of functional T cells in vitro can lead to a broad range of clinical applications. One such use is for the treatment of ...

Generation of Orthotopic Pancreatic Tumors and Ex vivo Characterization of Tumor-Infiltrating T Cell Cytotoxicity

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In vivo models of pancreatic cancer provide invaluable tools for studying disease dynamics, immune infiltration and new therapeutic strategies. The ...

In Vitro Evaluation of Oncogenic Transformation in Human Mammary Epithelial Cells

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Tumorigenesis is a multi-step process in which cells acquire capabilities&#160;that allow their growth, survival, and dissemination under hostile ...

Dynamic Imaging of Chimeric Antigen Receptor T Cells with [18F]Tetrafluoroborate Positron Emission Tomography/Computed Tomography

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Imágenes dinámicas de células T receptoras de antígeno quimérico con [18F]Tomografía por emisión de positrones tetrafluoroborato/Tomografía computarizada

T cells genetically engineered to express chimeric antigen receptors (CAR) have shown unprecedented results in pivotal clinical trials for patients with B ...

Evaluation of the In vivo Antitumor Activity of Polyanhydride IL-1&#945; Nanoparticles

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Cytokine therapy is a promising immunotherapeutic strategy that can produce robust antitumor immune responses in cancer patients. The proinflammatory ...