Name: in vitro tumor cell rechallenge for predictive evaluation of chimeric antigen receptor t cell antitumor function
Uploaded: 2019-02-27T15:00:00
Duration: 8 min 4 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Tumor Cell Rechallenge For Predictive Evaluation of Chimeric Antigen Receptor T Cell Antitumor Function at JoVE.com

Detta arbete stöds av bidrag från California Institute för regenerativ medicin (CIRM) grant TR3-05641 och NIH grants P30 CA33572 (kärnor). D.W. stöds av NCI gemenskap 1F99CA234923-01.

Våra IRB kräver inte översyn av detta protokoll. Vi tar emot kasserade färska glioblastoma tumörprover från staden av hopp patologi institutionen som är kodade och vårt laboratorium inte kan få tillgång till nyckeln. Vi får exemplaren med data bara på tidigare behandling och sjukdom tillstånd vid tiden för biopsi/resektion, utan identifierande data.
1. Media förberedelse
<ol><li>Förbered neurala stamceller för odling primära GBM cellinjer: DMEM:F12, 1:50 B27, 5 µg/mL heparin och 2 mmol/L L-glutamin; kompletteras med 20 ng/mL epidermal tillväxtfaktor (EGF) och 20 ng/mL basic fibroblast tillväxtfaktor (FGF) två gånger i veckan (se Tabell för material).</li>
	<li>Förbered T cell: VIVO X-15 som innehåller 10% fetalt kalvserum (FCS); kompletteras med 70 IU/mL rhIL-2 och 0,5 ng/mL rhIL-15 varje 48 timmar (se Tabell för material).</li>
	<li>Förbereda samtidig kulturmassmedia: ta neurala stamceller media utan EGF och FGF tillägg och lägga till 10% FCS.</li>
	<li>Förbereda FACS färgning lösning (FSS): HBSS, 2% FCS, NaN3 (0,5 g/500 mL).</li>
</ol>2. beredning av GBM tumörceller
<ol><li>Skörda låg-passage GBM tumör sfärer (TSs) genom centrifugering vid 300 x g i 4 min och Kassera supernatanten. Obs: GBM tumör sfärer (TSs) genereras från resected tumörer som tidigare beskrivits22,23,24, och underhålls i neurala stamceller media, i inkubatorer med 5% CO2 vid 37 ° C.</li>
	<li>Pre varma samtidig kulturmassmedia i 37 ° C vattenbad.</li>
	<li>Tillsätt 1 mL kall accutase till GBM TSs, dissociera TSs genom pipettering för 30-60 s och stoppa dissociation genom att tillsätta 5 mL varm samtidig kulturmassmedia. Obs: GBM TSs bör inte hållas på accutase för mer än 5 min.</li>
	<li>Skörda GBM celler genom centrifugering vid 300 x g i 4 min, Kassera supernatanten och återsuspendera cellerna i 2 mL co kulturmassmedia.</li>
	<li>Bestämma cellkoncentrationen använder en cell livskraft räknare. Obs: Cellernas viabilitet måste vara > 70%.</li>
</ol>3. beredning av CAR T-celler
<ol><li>Mindre än 24 h innan analysen, ta 100 µL av odlade CAR T-celler i ett flöde flödescytometri rör och tillsätt 2 mL av FSS. Obs: CAR T-celler var genereras som tidigare beskrivits11,21 och odlade i T-cell media.</li>
	<li>Centrifugering vid 300 x g i 4 min och Kassera supernatanten.</li>
	<li>Tillsätt 2 mL av FSS att tvätta cellerna, Centrifugera vid 300 x g i 4 min, och Kassera supernatanten.</li>
	<li>Färga celler med lämpliga antikropp att ange bil uttryck vid 4 ° C i 30 min. Obs: Till exempel om en IL13Rα2-riktade bil beskrivs tidigare25 används, sedan fläcken med anti-IL13 antikroppar.</li>
	<li>Tvätta två gånger med 2 mL FSS och analysera bil exn använder en flödescytometer.</li>
	<li>Fastställa de bil % på T-celler som använder strategin usenets visas i figur 1B.</li>
	<li>På dagen för samtidig kultur, skörda alla CAR T-celler genom centrifugering vid 300 x g i 4 min, Kassera supernatanten och återsuspendera cellerna i 2 mL co kulturmassmedia.</li>
	<li>Bestämma cellkoncentrationen använder en cell livskraft räknare. Obs: Cellernas viabilitet måste vara > 70%.</li>
</ol>4. Ställ in tumör — T Cell samarbete kultur
<ol><li>Späd tumörceller till en koncentration av 0,16 miljoner/mL med samtidig kulturmassmedia.</li>
	<li>Baserat på bil %, späd CAR T-celler till en koncentration av 0,04 miljoner bil+ celler/mL med samtidig kulturmassmedia. Obs: Till exempel, om bilen är 50% och T-cellkoncentrationen är 0,4 miljoner/mL, sedan göra en spädningen 1:5 att få en slutlig koncentration på 0,04 miljoner bil+ celler/mL.</li>
	<li>Pipettera 100 µL utspädda tumörceller i varje brunn 96 brunnar platt-botten vävnadsodling platta.</li>
	<li>Pipettera 100 µL utspädda CAR T-celler i varje brunn som innehåller tumörceller och blanda väl. Obs: Varje tumör-T cell samarbete kultur kommer att analyseras på 4 punkter. 4-6 replikat kan krävas vid varje gång punkt baserat på olika analys, men < 3 replikat per tidpunkt rekommenderas inte; se tabell 1 för ett representativt platemap.</li>
	<li>Upprätthålla plattan i en 37 ° C, 5% CO2 inkubator.</li>
</ol>5. tumör Cell återinsättning
Obs: Återinsättning sker vid 2, 4 och 6 dagar efter den inledande samarbete kultur setup (figur 1A).
<ol><li>Skörda och separera GBM TSs som beskrivs ovan (steg 2.1-2.6).</li>
	<li>Återsuspendera GBM celler vid en koncentration på 0,64 miljoner/mL.</li>
	<li>Bestämma samtidig kultur brunnarna som behöver återinsättning (se tabell 1) och ta försiktigt bort 50 µL media från toppen av varje brunn.</li>
	<li>Tillsätt 50 µL av GBM cellsuspension i varje brunn och blanda väl, sedan satte plattan tillbaka in i en 37 ° C, 5% CO2 inkubator.</li>
</ol>6. skörda prover och Flow flödescytometrisk analys
Obs: Prover kommer att skördas på 1, 3, 5 och 7 dagar efter den inledande samarbete kultur setup, med 1, 2, 3 och 4 rundor av tumör utmaning, respektive.
<ol><li>Pre varma 0,05% trypsin-EDTA-lösning i 37 ° C vattenbad.</li>
	<li>Fastställa de brunnar som behöver skörd och överföra media till en ny runda-bottenplatta med 96 brunnar.</li>
	<li>Överför med pipett 50 μl av trypsin-EDTA i brunnar smälta kvarvarande tumörceller vid 37 ° C i 5 min.</li>
	<li>I Mikroskop, bekräfta cellerna har lösgjort från botten.</li>
	<li>Pipettera runt väl botten för att resuspendera fristående celler och sedan överföra trypsin-EDTA innehållande fristående celler till de motsvarande brunnarna i den runda-bottenplattan med 96 brunnar.</li>
	<li>Centrifugera runda 96 brunnar-bottenplattan på 300 x g, 4 ° C i 4 min, sedan Kassera supernatanten.</li>
	<li>Tillsätt 200 µL per brunn av FSS att tvätta de celler, Centrifugera vid 300 x g, 4 ° C under 4 minuter och sedan Kassera supernatanten.</li>
	<li>Återsuspendera cellerna i 100 µL per brunn FSS innehållande antikroppar (se Tabell för material), och fläcken celler vid 4 ° C i 30 min.</li>
	<li>Tillsätt 100 µL per brunn FSS till celler, Centrifugera 300 x g, 4 ° C i 4 min, sedan Kassera supernatanten.</li>
	<li>Tillsätt 200 µL per brunn av FSS att tvätta de celler, Centrifugera vid 300 x g, 4 ° C under 4 minuter och sedan Kassera supernatanten.</li>
	<li>Återsuspendera cellerna med 100-200 µL per brunn av FSS med 500 ng/mL DAPI, sedan analysera prover med flödescytometri.</li>
</ol>7. funktionella och Phen Otypic analys av CAR T-celler
<ol><li>Hämta datan arkivera från flödescytometer och utfärda utegångsförbud för alla live (DAPI-) celler (figur 1C).</li>
	<li>Kvantifiera tumörceller genom gating CD45– befolkning och CAR T-celler av gating CD45+, bil + befolkningen (figur 1C). Obs: Om tumörcellerna uttrycker CD45 (e.g. Raji lymfomceller), anti-CD3 färgning kan användas för att göra åtskillnad mellan T-celler från tumörceller.</li>
	<li>Rita tumör cell och bil T cell nummer genom tid kursen.</li>
	<li>Identifiera T cellaktivering genom samtidig uttryck för 4-1BB och CD69. Obs: Dessa yta markörer kan användas för att analysera T cell aktivering 6-24 h post inledande samarbete kultur.</li>
	<li>Identifiera T cell utmattning av uttrycket av PD-1, LAGG-3 och TIM-3.</li>
	<li>Identifiera status för T-cellen minne genom uttryck för CD45RO och CD62L.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Porter, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chimeric+antigen+receptor+T+cells+persist+and+induce+sustained+remissions+in+relapsed+refractory+chronic+lymphocytic+leukemia.">Chimeric antigen receptor T cells persist and induce sustained remissions in relapsed refractory chronic lymphocytic leukemia.</a> Science Translational Medicine. 7 (303), (2015).</li><li>Brentjens, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD19-targeted+T+cells+rapidly+induce+molecular+remissions+in+adults+with+chemotherapy-refractory+acute+lymphoblastic+leukemia.">CD19-targeted T cells rapidly induce molecular remissions in adults with chemotherapy-refractory acute lymphoblastic leukemia.</a> Science Translational Medicine. 5 (177), (2013).</li><li>Grupp, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chimeric+antigen+receptor-modified+T+cells+for+acute+lymphoid+leukemia.">Chimeric antigen receptor-modified T cells for acute lymphoid leukemia.</a> The New England Journal of Medicine. 368 (16), 1509-1518 (2013).</li><li>Lee, D. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cells+expressing+CD19+chimeric+antigen+receptors+for+acute+lymphoblastic+leukaemia+in+children+and+young+adults:+a+phase+1+dose-escalation+trial.">T cells expressing CD19 chimeric antigen receptors for acute lymphoblastic leukaemia in children and young adults: a phase 1 dose-escalation trial.</a> The Lancet. 385 (9967), 517-528 (2015).</li><li>Yong, C. S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CAR+T-cell+therapy+of+solid+tumors.">CAR T-cell therapy of solid tumors.</a> Immunology and Cell Biology. 95 (4), 356-363 (2017).</li><li>Barrett, D. M., Singh, N., Porter, D. L., Grupp, S. A., June, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chimeric+antigen+receptor+therapy+for+cancer.">Chimeric antigen receptor therapy for cancer.</a> Annual Review of Medicine. 65, 333-347 (2014).</li><li>Priceman, S. J., Forman, S. J., Brown, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Smart+CARs+engineered+for+cancer+immunotherapy.">Smart CARs engineered for cancer immunotherapy.</a> Current Opinion in Oncology. 27 (6), 466-474 (2015).</li><li>Fesnak, A. D., June, C. H., Levine, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineered+T+cells:+the+promise+and+challenges+of+cancer+immunotherapy.">Engineered T cells: the promise and challenges of cancer immunotherapy.</a> Nature Reviews Cancer. 16 (9), 566-581 (2016).</li><li>Esensten, J. H., Bluestone, J. A., Lim, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+Therapeutic+T+Cells:+From+Synthetic+Biology+to+Clinical+Trials.">Engineering Therapeutic T Cells: From Synthetic Biology to Clinical Trials.</a> Annual Review of Pathology. 12, 305-330 (2017).</li><li>Lim, W. A., June, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Principles+of+Engineering+Immune+Cells+to+Treat+Cancer.">The Principles of Engineering Immune Cells to Treat Cancer.</a> Cell. 168 (4), 724-740 (2017).</li><li>Brown, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+IL13Ralpha2-Targeted+Chimeric+Antigen+Receptor+T+Cells+for+Improved+Anti-tumor+Efficacy+against+Glioblastoma.">Optimization of IL13Ralpha2-Targeted Chimeric Antigen Receptor T Cells for Improved Anti-tumor Efficacy against Glioblastoma.</a> Molecular Therapy. , (2017).</li><li>Long, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=4-1BB+costimulation+ameliorates+T+cell+exhaustion+induced+by+tonic+signaling+of+chimeric+antigen+receptors.">4-1BB costimulation ameliorates T cell exhaustion induced by tonic signaling of chimeric antigen receptors.</a> Nature Medicine. 21 (6), 581-590 (2015).</li><li>Cherkassky, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+CAR+T+cells+with+cell-intrinsic+PD-1+checkpoint+blockade+resist+tumor-mediated+inhibition.">Human CAR T cells with cell-intrinsic PD-1 checkpoint blockade resist tumor-mediated inhibition.</a> The Journal of Clinical Investigation. 126 (8), 3130-3144 (2016).</li><li>Priceman, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Co-stimulatory+signaling+determines+tumor+antigen+sensitivity+and+persistence+of+CAR+T+cells+targeting+PSCA++metastatic+prostate+cancer.">Co-stimulatory signaling determines tumor antigen sensitivity and persistence of CAR T cells targeting PSCA+ metastatic prostate cancer.</a> Oncoimmunology. 7 (2), 1380764 (2018).</li><li>Eyquem, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+a+CAR+to+the+TRAC+locus+with+CRISPR/Cas9+enhances+tumour+rejection.">Targeting a CAR to the TRAC locus with CRISPR/Cas9 enhances tumour rejection.</a> Nature. 543 (7643), 113-117 (2017).</li><li>Gattinoni, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acquisition+of+full+effector+function+in+vitro+paradoxically+impairs+the+in+vivo+antitumor+efficacy+of+adoptively+transferred+CD8++T+cells.">Acquisition of full effector function in vitro paradoxically impairs the in vivo antitumor efficacy of adoptively transferred CD8+ T cells.</a> The Journal of Clinical Investigation. 115 (6), 1616-1626 (2005).</li><li>Malandro, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonal+Abundance+of+Tumor-Specific+CD4(+)+T+Cells+Potentiates+Efficacy+and+Alters+Susceptibility+to+Exhaustion.">Clonal Abundance of Tumor-Specific CD4(+) T Cells Potentiates Efficacy and Alters Susceptibility to Exhaustion.</a> Immunity. 44 (1), 179-193 (2016).</li><li>Gattinoni, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt+signaling+arrests+effector+T+cell+differentiation+and+generates+CD8++memory+stem+cells.">Wnt signaling arrests effector T cell differentiation and generates CD8+ memory stem cells.</a> Nature Medicine. 15 (7), 808-813 (2009).</li><li>Klebanoff, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Central+memory+self/tumor-reactive+CD8++T+cells+confer+superior+antitumor+immunity+compared+with+effector+memory+T+cells.">Central memory self/tumor-reactive CD8+ T cells confer superior antitumor immunity compared with effector memory T cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (27), 9571-9576 (2005).</li><li>Gattinoni, L., Klebanoff, C. A., Restifo, N. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paths+to+stemness:+building+the+ultimate+antitumour+T+cell.">Paths to stemness: building the ultimate antitumour T cell.</a> Nature Reviews Cancer. 12 (10), 671-684 (2012).</li><li>Wang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glioblastoma-targeted+CD4++CAR+T+cells+mediate+superior+antitumor+activity.">Glioblastoma-targeted CD4+ CAR T cells mediate superior antitumor activity.</a> JCI Insight. 3 (10), (2018).</li><li>Kahlon, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+recognition+and+killing+of+glioblastoma+multiforme+by+interleukin+13-zetakine+redirected+cytolytic+T+cells.">Specific recognition and killing of glioblastoma multiforme by interleukin 13-zetakine redirected cytolytic T cells.</a> Cancer Research. 64 (24), 9160-9166 (2004).</li><li>Brown, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recognition+and+killing+of+brain+tumor+stem-like+initiating+cells+by+CD8++cytolytic+T+cells.">Recognition and killing of brain tumor stem-like initiating cells by CD8+ cytolytic T cells.</a> Cancer Research. 69 (23), 8886-8893 (2009).</li><li>Lee, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+stem+cells+derived+from+glioblastomas+cultured+in+bFGF+and+EGF+more+closely+mirror+the+phenotype+and+genotype+of+primary+tumors+than+do+serum-cultured+cell+lines.">Tumor stem cells derived from glioblastomas cultured in bFGF and EGF more closely mirror the phenotype and genotype of primary tumors than do serum-cultured cell lines.</a> Cancer Cell. 9 (5), 391-403 (2006).</li><li>Brown, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regression+of+Glioblastoma+after+Chimeric+Antigen+Receptor+T-Cell+Therapy.">Regression of Glioblastoma after Chimeric Antigen Receptor T-Cell Therapy.</a> The New England Journal of Medicine. 375 (26), 2561-2569 (2016).</li><li>Salter, A. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphoproteomic+analysis+of+chimeric+antigen+receptor+signaling+reveals+kinetic+and+quantitative+differences+that+affect+cell+function.">Phosphoproteomic analysis of chimeric antigen receptor signaling reveals kinetic and quantitative differences that affect cell function.</a> Science Signaling. 11 (544), (2018).</li><li>Rossi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preinfusion+polyfunctional+anti-CD19+chimeric+antigen+receptor+T+cells+are+associated+with+clinical+outcomes+in+NHL.">Preinfusion polyfunctional anti-CD19 chimeric antigen receptor T cells are associated with clinical outcomes in NHL.</a> Blood. 132 (8), 804-814 (2018).</li><li>Garcia-Diaz, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interferon+Receptor+Signaling+Pathways+Regulating+PD-L1+and+PD-L2+Expression.">Interferon Receptor Signaling Pathways Regulating PD-L1 and PD-L2 Expression.</a> Cell Reports. 19 (6), 1189-1201 (2017).</li><li>Walker, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+Antigen+and+Receptor+Densities+Regulate+Efficacy+of+a+Chimeric+Antigen+Receptor+Targeting+Anaplastic+Lymphoma+Kinase.">Tumor Antigen and Receptor Densities Regulate Efficacy of a Chimeric Antigen Receptor Targeting Anaplastic Lymphoma Kinase.</a> Molecular Therapy. 25 (9), 2189-2201 (2017).</li><li>Fraietta, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determinants+of+response+and+resistance+to+CD19+chimeric+antigen+receptor+(CAR)+T+cell+therapy+of+chronic+lymphocytic+leukemia.">Determinants of response and resistance to CD19 chimeric antigen receptor (CAR) T cell therapy of chronic lymphocytic leukemia.</a> Nature Medicine. 24 (5), 563-571 (2018).</li><li>Fraietta, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disruption+of+TET2+promotes+the+therapeutic+efficacy+of+CD19-targeted+T+cells.">Disruption of TET2 promotes the therapeutic efficacy of CD19-targeted T cells.</a> Nature. 558 (7709), 307-312 (2018).</li></ol>

Den bil bygga beskrivs i detta arbete har licensierats av Mustang Bio., Inc., som S.J.F. och C.E.B. får royalty-betalningar. Alla andra författare förklarar inga potentiella intressekonflikter.

Denna repetitiva tumör cell utmaning analys ger en bekväm metod för att utvärdera bil T cell funktionell styrka, med en in vitro-setup som recapitulates hög tumör bördan är associerad med Invivo tumör modeller. Under denna 7-dagars test, CAR T-celler genomgår fyra rundor av tumör utmaning (inledande samarbete kultur och 3 x återinsättning), att skapa en miljö där utmattad T-celler kan förlora sin kapacitet att bemöta tumör utmaning trots en potent första svar. Tumör cell eliminering och bil T cell expansion representerar två grundläggande avläsning som kan förvärvas från denna analys, medan fenotyperna av CAR T-celler kan enkelt analyseras genom färgning ytan eller intracellulära markörer som indikerar T-cellsaktivering, utmattning och/eller minne. Denna analys är också praktiskt att kombinera med icke-partisk analys av bil T celler transkriptom proteomet eller fosfor-proteomet21,26och T-cell polyfunctionality som har antagits för att förutsäga kliniska svar27. Tumörceller kan dessutom också testas för deras adaptiv respons mot T-cell immunitet såsom cytokin sekretion28. Eftersom proverna skördas vid flera tidpunkter, möjliggör denna analys inte bara statisk, men också dynamisk analys av bil T cell beteende när du svarar på överskjutande antalet tumörceller.
Analysen är särskilt kraftfull i jämföra effektor styrkan av CAR T-celler som inriktning samma antigen men med olika mönster eller tillverkningsprocesser. Vi har använt denna analys för att identifiera att CD4+ bil T celler skulle kunna medla överlägsen långsiktig effektor funktion än CD8+ celler21. Det visades också att i vivo BILHYRA effekten var korrelerad med Cytotoxiciteten vid senare tidpunkter (D5-D7) under denna analys, ytterligare belyser nödvändigheten av att använda repetitiva tumör utmaning för in vitro-bil T cell utvärdering. Även om GBM celler användes som exempel av målceller här, kunde denna analys antas enkelt till en annan T-cell-tumör kombination. Särskilt, kan bil T cell beteende också variera vid olika antigen tätheter och engineering cancerceller att uttrycka olika nivåer av riktade antigener som verktyget för att undersöka sekventiell molekylära händelser vid bil erkännande29. Denna analys kan därför också utnyttjas för att granska mönstret för aktivering av vissa CAR T-celler mot olika mål.
Sedan målet cellernas viabilitet och bil T cell expansion är två upfront avläsning av denna analys, är det viktigt att alla samtidig kulturer börja med livskraftiga (> 70%) tumör och T-celler. När du utför återinsättning processerna, bör åtgärden av utvärderingsenheten media (steg 5.3) inte störa tumör och T-celler i botten av brunnarna, för att inte införa onödiga variationer av celler räknas. När du utför denna analys på suspension mål cellinjer, rekommenderas det att skörda resterande celler genom centrifugering före tumör cell återinsättning.
En begränsning av denna analys är att inställningsparametrar (E:T förhållandet mellan inledande samarbete kultur och återinsättning) måste anpassas utifrån olika bil-tumör kombinationer. Till exempel, om tumörcellerna uttrycker en betydande nivå av immuno-hämmande molekyler (t.ex. PD-L1), högre E:T förhållande rekommenderas med tanke på att övergripande döda effektivitet är nedsatt jämfört med PD-L1-low tumörceller. Innan analysen till nya bil-tumör kombinationer, en pilotstudie rekommenderas att fastställa optimala förutsättningar, som tillåter vanligtvis de mest potenta CAR T-celler som testas i analysen att eliminera > 80% av tumörcellerna vid slutpunkten. Eftersom direkta cell-cell kontakt behövs för bil T cell-medierad dödande, om tumörcellerna var fluorescens-märkt, sedan panelen i flödet flödescytometrisk analys måste justeras (t.ex. om tumörcellerna var GFP-märkta, sedan alla FITC-konjugerad antikroppar bör inte användas).
Den kliniska aktiviteten av CAR T-celler mot B-cell maligniteter har lett till två FDA-godkända läkemedel. Svaret har emellertid visat stor variation mellan olika patienter27,30,31, som var klarlagd korrelera med de bil produkter30fenotypiska egenskaper. Denna in vitro-repetitiva tumör utmaning analys ytterligare innehåller en metod för att testa funktionellt bil effektor styrkan utöver de fenotypiska karakteriseringar och polyfunctionality cytokin produktion och möjliggör högre genomströmning screening av kliniska produkter i jämförelse med Invivo tumör modeller bibehållen prediktiva trohet. Sammantaget skulle denna analys kunna användas för T-cell funktionstest för bil T cell design, preklinisk och klinisk utveckling.

Immunterapi med chimära antigen receptorn (bil)-bearbetade T celler har sett lovande resultat mot B-cell maligniteter1,2,3,4, medan potentialen för att rikta andra tumörer fortsätter att vara under noggrann undersökning5,6,7. Stora framsteg har gjorts för att optimera bilen konstruktion, tillverkningsprocessen och patienten före infusion regimer6,7,8, och romanen syntetisk biologi metoder väntas öka sin uthållighet, säkerhet och tumör specificitet9,10. Det har dock varit svårt och arbetsintensiva att korrekt bedöma den terapeutiska potentialen hos CAR T-celler för att vägleda det bästa valet för kliniska översättning. Den mest etablerade modellen hittills för att utvärdera bil T cell-funktion är i nedsatt immunförsvar möss med mänskliga tumör xenograft, whereby CAR T-celler undersöks för antitumöreffekt effekt och jämfört titrerad cell doser11,12 , 13 , 14 , 15. dessa murina studier är arbetskrävande och tidsödande, speciellt när screening stort antal parametrar. Ytterligare, Invivo studier kan vara fastspända med tillgängligheten till mus stammar, Djurvård faciliteter och djur-hanteringstekniker. Därför finns det ett behov att utveckla bekvämare in vitro-analyser som möjliggör snabb avläsning av effektor aktivitet, vilket också troget återspeglar Invivo antitumöreffekt funktionen av dessa T-celler.
Konventionella metoder för att bestämma cytotoxiciteten hos T-celler in vitro-har fokuserat på upptäckt av degranulering, cytokin produktion och förmåga att lysera radioisotop-märkt målcellerna (dvs krom utgåva analyser). Medan dessa analyser är informativ för att definiera bil T cell specificitet och omdirigerade prismalås, misslyckas de ofta med att återspegla Invivo antitumöreffekt potentialen av bakåtkompilerade T celler12,13,16. I vissa fall i vitro visade döda aktivitet i kortsiktiga analyser en omvänd korrelation med Invivo antitumöreffekt funktion16. Sådan inkonsekvens är sannolikt resultatet av hög effektor: mål (E:T) nyckeltal används i dessa in vitro-testmetoder, och därför oförmåga för att skilja bil T cell produkter som är benägna att utmattning17. Däremot under Invivo tumör utrotning T svarar celler vanligtvis mot stor tumör bördor, vilket kräver flera rundor av döda och därefter köra T cell differentiering och utmattning18,det19, 20, som är en av de största hindren mot effektiva tumör clearance av bil T celler12,13. Under tiden, mest kortsiktiga in vitro-dödande analyser också göra inte avläsningen skillnader i T cellproliferation, medan bil T cell behandlade patienter kapacitet för bil T cell expansion är starkt korrelerad med kliniska svar4. Således, den lämpliga in vitro-test skulle behöva sammanfatta villkoren för hög tumör börda, induktion av T-cell utmattning, och möjliggör utläsningen av T-cell expansion.
Här beskriver vi en strategi för att utvärdera CAR T-celler för repetitiva tumör dödande potential med en enkel in vitro-samtidig kultur-analysen. Olika T-cell effector aktivitetsparametrarna kan undersökas samtidigt, inklusive målet cellen dödande, bil T cell expansion och minne - eller utmattning-associerade fenotyper. De resultat som genereras från denna analys korrelerar väl med Invivo antitumöreffekt effekten av CAR T-celler och kan utnyttjas för att bedöma styrkan av bil T cell produkter. Medan vi beskriva ett test för att utvärdera IL13Ra2-riktade CAR T-celler mot primära GBM linjerna21, kan den lätt anpassas till någon bil T cell plattform.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1084px;" width="1083">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:451px;">0.05% Trypsin/0.53mM EDTA in HBSS w/o Calcium and Magnesium</td>
			<td style="width:123px;">Corning</td>
			<td style="width:344px;">MT25051CI</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:451px;">1M Hepes</td>
			<td style="width:123px;">Irvine Scientific</td>
			<td style="width:344px;">9319</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:451px;">200 mM L-Glutamine</td>
			<td style="width:123px;">Cambrex Bio Science</td>
			<td style="width:344px;">17-605E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:451px;">4&#39;,6-diamidino-2-phenylindole, dihydrochloride (DAPI) - FluoroPure grade</td>
			<td style="width:123px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:344px;">D21490</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:451px;">Accutase</td>
			<td style="width:123px;">Innovative Cell Technologies</td>
			<td style="width:344px;">AT104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:451px;">Aldesleukin Proleukin (rhIL-2)</td>
			<td style="width:123px;">Novartis Oncology</td>
			<td style="width:344px;">NDC 0078-0495-61</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Anti-CD137, PE</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555956</td>
			<td>4B4-1</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Anti-CD19, PE-Cy7</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>557835</td>
			<td>SJ25C1</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Anti-CD3, PERCP</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>340663</td>
			<td>SK7</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Anti-CD4, FITC</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>340133</td>
			<td>SK3</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Anti-CD45, PERCP</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>340665</td>
			<td>2D1</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Anti-CD45RO, PE</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>561137</td>
			<td>UCHL1</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Anti-CD62L, APC</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>559772</td>
			<td>DREG-56</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Anti-CD69, APC</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>340560</td>
			<td>L78</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Anti-CD8, APC-Cy7</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>348793</td>
			<td>SK1</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Anti-IL-13, PE</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>340508</td>
			<td>JES10-5A2</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Anti-LAG-3, PE</td>
			<td>eBiosciences</td>
			<td>12-2239-41</td>
			<td>3DS223H</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Anti-PD-1, APC-Cy7</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>329921</td>
			<td>EH12.2H7</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Anti-TIM-3, APC</td>
			<td>eBiosciences</td>
			<td>17-3109-42</td>
			<td>F38-2E2</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:451px;">B-27 Serum-Free Supplement (50X)</td>
			<td style="width:123px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:344px;">17504-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:451px;">Corning 96 Well Clear Flat Bottom Polystyrene TC-Treated Microplates, Individually Wrapped, with Lid, Sterile (Product #3596)</td>
			<td style="width:123px;">Corning Life Sciences</td>
			<td style="width:344px;">3596</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:451px;">Defined fetal bovine serum,HI IR</td>
			<td style="width:123px;">Hyclone Labs</td>
			<td style="width:344px;">SH30070.03IH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:451px;">DMEM F-12 50:50 (1X) w/o Glutamine</td>
			<td style="width:123px;">MediaTech, Inc.</td>
			<td style="width:344px;">15-090-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:451px;">DMEM High Gluc w/o L-Glu, Na Pyr 1 L</td>
			<td style="width:123px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:344px;">11960051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:451px;">DMEM-Ham&#39;s F12 50:50 Mixture with L-glutamine and 15 mM HEPES</td>
			<td style="width:123px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:344px;">MT10092CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:451px;">HBSS</td>
			<td style="width:123px;">Irvine Scientific</td>
			<td style="width:344px;">9224</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:451px;">Heat-Inactivated FCS</td>
			<td style="width:123px;">Hyclone</td>
			<td style="width:344px;">SH30070.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:451px;">Heparin Sodium(1,000 U/ml)</td>
			<td style="width:123px;">American Pharmaceutical</td>
			<td style="width:344px;">401811B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:451px;">MACSQuant</td>
			<td style="width:123px;">Milteni Biotech Inc.</td>
			<td style="width:344px;">BIS013220&#160;</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PBS 1X W/CA &#38; MG</td>
			<td>Irvine Scientific</td>
			<td>9236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:451px;">PBS with 1MM EDTA (No Ca2+ or Mg2+)</td>
			<td style="width:123px;">VWR Scientific Products</td>
			<td style="width:344px;">PB15009A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:451px;">Recombinant human EGF</td>
			<td style="width:123px;">R&#38;D Systems</td>
			<td style="width:344px;">236-EG-200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:451px;">Recombinant human FGF</td>
			<td style="width:123px;">R&#38;D Systems</td>
			<td style="width:344px;">233-FB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:451px;">rhIL-15 Working Dilution (10 ng/&#181;L)</td>
			<td style="width:123px;">CellGenix, US Operations</td>
			<td style="width:344px;">tF0297</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="45">
			<td height="45" style="height:45px;width:451px;">Sodium Azide (NaN3)</td>
			<td style="width:123px;">Sigma</td>
			<td style="width:344px;">S8032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:451px;">Sorvall ST40R</td>
			<td style="width:123px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:344px;">41693700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:451px;">TC-HEPES BUFFER (1M) SOLN 100ML&#160;</td>
			<td style="width:123px;">IRVINE SCIENTIFIC CORP</td>
			<td style="width:344px;">6472</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:451px;">Tecnol Procedure Mask</td>
			<td style="width:123px;">Kimberly-Clark</td>
			<td style="width:344px;">47117</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:451px;">X-VIVO 15</td>
			<td style="width:123px;">Lonza</td>
			<td style="width:344px;">BW04-744Q</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro tumor cell rechallenge for predictive evaluation of chimeric antigen receptor t cell antitumor function

Fältet av chimära antigen receptorn (bil) T-cellterapi går snabbt framåt med förbättringar i bildesign, gen-engineering metoder och tillverkning optimeringar. En utmaning för dessa utvecklingsinsatser, har dock varit upprättandet av in vitro-analyser som kraftfullt kan informera val av de optimala bilen T cell produkterna för Invivo terapeutisk framgång. Standard in vitro-tumör-Lys analyser ofta inte återspeglar den verkliga antitumöreffekt potentialen i bil T-cellerna på grund av relativt kort samtidig Kulturtid och höga T-cell tumör-förhållande. Här beskriver vi en in vitro-samtidig kultur metod för att utvärdera bil T cell rekursiv dödande potential vid hög tumör cell laster. I denna analys, långsiktiga cytotoxiska funktion och proliferativ kapacitet av CAR T-celler undersöks i vitro över 7 dagar med ytterligare tumör mål administreras till samtidig kulturen varannan dag. Denna analys kan kopplas till profilering T cellaktivering, utmattning och minne fenotyper. Med denna analys, vi har framgångsrikt framstående funktionella och fenotypiska skillnader mellan CD4+ och CD8+ CAR T-celler mot Glioblastom (GBM) celler, återspeglar deras differentiell Invivo antitumöraktivitet i ortotop xenograft-modeller. Denna metod ger en lättköpt metod att bedöma bil T cell styrka och att klarlägga de funktionella variationerna över olika produkter för CAR T-celler.

Med den analys som beskrivs ovan, vi har framstående differentiell effektor potens och döda dynamics medieras av CD4+ och CD8+ bil T celler. Resultaten presenteras här illustrera skillnaden mellan CD4+ och CD8+ bil T celler, genereras från en frisk givare som är oberoende av våra tidigare publikation21.
Genom en standard degranulering analys, kunde vi konstatera att både CD4+ och CD8+ bil T celler blev lika aktiverad mot GBM celler som uttrycker riktade antigenet, som anges av uttrycket av CD107a och intracellulära cytokin (Figur 2A). Men med repetitiva tumör utmaning analys, vi fann att CD4+ men inte CD8+ bil T celler uppvisade förmåga att flera-runda dödande (figur 2B). CD4+ CAR T-celler också uppnås bättre expansion i jämförelse med CD8 + celler under denna analys (figur 2C). Skillnaden av utvidgning mellan bil T cell delmängder observerades endast från D3 efter två rundor av tumör utmaning (1:12 E:T), medan skillnaden av cytotoxicitet observerades början på D5 efter tre rundor av tumör utmaning (1:20 E:T), vilket indikerar att kortsiktiga analyser misslyckades att belysa skillnader i styrkan av olika bil T cell produkter. När en 1:1 blandas CD4+ och CD8+ bil T celler tillämpades på denna analys, visar att de överträffar CD8+ men inte CD4+ bil T celler på långsiktiga cytotoxicitet (figur 2B). Utbyggnaden av CD8+ bil T celler var induceras av den co tillämpad CD4+ celler, medan CD4+ bil T cell expansion hämmades i närvaro av CD8+ celler (figur 2C).
Att förklara den mekanism som skiljer effektor aktiviteten mellan CD4+ och CD8+ CAR T-celler, vi först bekräfta att 24 h efter inledande samarbete kultur, både CD4+ och CD8+ bil T celler var comparably aktiverat (figur 3 A). Under tiden, som indikeras av CD45RO och CD62L uttryck, både CD4+ och CD8+ bil T celler visade en övergång från centrala minnes (CD45RO+, CD62L+) till effektor minne (CD45RO+, CD62L–) fenotyp under repetitiva tumör utmaning (figur 3B). Då vi kännetecknas cellerna på D3 av denna analys, en tid innan bilen T cell delmängder började Visa funktionell skillnad. T-cell utmattning präglades av samtidig uttrycket av hämmande receptorer PD-1, LAGG-3 och TIM-315,21, som visade att CD8+ bil T cellerna var mer benägna att utmattning jämfört med CD4+ bil T cells () Figur 3 C). vidare ingen skillnad sågs på CD8+ bil T cell utmattning i närvaro/frånvaro av samtidig tillämpad CD4+ celler (figur 3C), vilket indikerar att CD4-inducerad CD8+ bil T cell expansion är inte i samband med en bättre effektor funktion.
Tillsammans, resultaten från denna analys identifierat att CD4+ bil T cells överglänste CD8+ celler specifikt i långsiktiga cytotoxicitet. Trots liknande kortfristiga Cytotoxiciteten (1-3 dagar, en gång igen), CD4+ bil T cells ihållande effektor funktion vid repetitiva tumör utmaning, medan CD8+ celler blev utmattad och misslyckats med att kontrollera tumör celltillväxt. När två delmängder var blandade, CD4+ bil T celler underlättat utbyggnaden av CD8+ CAR T-celler, men statusen utmattning av CD8+ celler var inte förbättras, vilket resulterar i bristen på synergistisk effekt mellan de två grupperna. Liknande skillnad mellan CD4+ och CD8+ bil T celler sågs i en in vivo-modell som tidigare beskrivits21. Faktiskt, CD8+ bil T celler skulle kunna medla kortsiktiga tumör clearance men följt med antigen-positiv recidiv; i kontrast, CD4+ bil T cell behandling resulterade i långsiktiga tumör utrotning21, som påminner om deras repetitiva dödande potential med in vitro-återinsättning analys.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59275/59275fig1.jpg"> Figur 1 : Schema och analys strategi av repetitiva utmaning assay. (A) Schema och tidslinje för repetitiva tumör utmaning assay. För varje brunn, CAR T-celler först tillsammans odlade med PBT030-2 GBM celler (4.000 bil + celler, 16.000 tumörceller) och åter utmanas med 32.000 tumörceller varannan dag (D2, D4 och D6). Analys av tumör cell bil T cell nummer, samt och bil T cell fenotyp utförs på D1, D3, D5 och D7. (B) Gating strategi för att fastställa bil % T cells innan du ställer in co kulturen. (C) Gating strategi av levande celler, tumörceller och CAR T-celler från repetitiva utmaning-analysen. (D) tumör celler nummer vid olika tidpunkter återinsättning analysens, co odlade med untransduced T-celler. Felstaplar = ±SEM. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59275/59275fig1large.jpg" target="_blank">vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59275/59275fig2.jpg"> Figur 2 : Repetitiva utmaning test avslöjar skillnader i avlivas och proliferativ potens mellan CD4+ och CD8+ bil T celler. (A) degranulering och intracellulära cytokin färgning av CD4+ och CD8+ bil T celler efter 5 h av samtidig kultur med GBM celler (E:T = 1:1). (B) CD4+, CD8+ eller blandade (CD4:CD8 = 1:1) CAR T-celler tillämpades på repetitiva utmaning assay och livskraftiga tumörcellerna kvantifierades. p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001 jämfört med CD4+, med envägs ANOVA med Bonferronis flera jämförelsetester. (C) CD4+ och CD8+ bil T cell expansion under repetitiva tumör utmaning assay. Jämförelse av (vänster till höger) CD4+ vs CD8+, enda delmängd; CD4+ vs CD8+, inom gruppen ”blandade”; CD4+, singel vs blandat; CD8+, singel vs blandat. p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001 använder en oparade Student's t -test. Felstaplar = ±SEM. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59275/59275fig2large.jpg" target="_blank">vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59275/59275fig3.jpg"> Figur 3 : Analys av T-cell fenotyp under repetitiva utmaning assay. (A) 4-1BB och CD69 färgning på CAR T-celler på D1 i analysen. (B) CD45RO och CD62L färgning av CAR T-celler före ansöker om att återinsättning assay (ingång) och på D3 och D7 analysens. (C) samtidig uttryck av PD-1, LAGG-3 och TIM-3 på CAR T-celler på D3 i analysen. (Överst) Gating strategier att identifiera T-celler som uttrycker 1, 2 eller 3 hämmande receptorer. (Botten) Jämförelse av: CD4+ celler (enda delmängd), CD8+ celler (enda delmängd), CD8+ celler (inom gruppen ”blandade”). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59275/59275fig3large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Table 1" src="/files/ftp_upload/59275/59275table1.jpg"> Tabell 1: Representativa plattan karta över återinsättning setup.

Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Tumor Cell Rechallenge For Predictive Evaluation of Chimeric Antigen Receptor T Cell Antitumor Function at JoVE.com

In Vitro Tumor Cell Rechallenge For Predictive Evaluation of Chimeric Antigen Receptor T Cell Antitumor Function

I Vitro tumör Cell återinsättning för förutsägande utvärdering av chimära Antigen receptorn T Cell antitumöreffekt funktion

Här, beskriver vi en metod för in vitro-samtidig kultur att rekursivt utmaning tumör-riktade T-celler, som möjliggör fenotypiska och funktionell analys av antitumöreffekt T-cellsaktivitet.

The field of chimeric antigen receptor (CAR) T cell therapy is rapidly advancing with improvements in CAR design, gene-engineering approaches and ...

Detta protokoll ger en långsiktig, in vitro, funktionell metod för utvärdering av chimeric antigen receptor, eller CAR T-celler, genom repetitiva tumör cell utmaning. Denna teknik är mindre tidskrävande, och mindre arbetsintensiva än in vivo CAR T cell funktion utvärdering samtidigt som man uppnår en korrekt representation av den sanna anti-tumör effekt. Denna in vitro-teknik möjliggör hög genomströmning screening och differentiering av CAR T cell anti-tumör potens.Som har den potentiella ansökan för bedömning av klinisk effektivitet av CAR T cell produkter. Börja med att dissociera glioblastoma tumorspheres från en glioblastoma tumorsphere kultur. Med en milliliter kallacutase, och 30 till 60 sekunder av pipettering.När tumorspheres har störts, stoppa reaktionen med fem milliliter av varmt co-kultur medium. Och pellet tumörcellen suspensioner genom centrifugeringen. Åter avbryta glioblastoma cellerna till en 1,6 gånger 10 till den femte tumörceller per milliliter av färsk kokultur medium koncentration, och späd T-celler skördas från en CAR T cell kultur till lämplig andel av CAR positiva T-celler per milliliter av co-kultur medium koncentration.Därefter lägger du till 100 mikroliter av de utspädda tumörcellerna till varje brunn av en 96 väl platt bottenvävnadskulturplatta. Och 100 mikroliter av CAR T-celler i varje brunn av tumörceller med skonsam blandning. Placera sedan plattan i en 37 grader Celsius, 5% koldioxid inkubator.På dag två, fyra, och sex av kultur, försiktigt bort 50 mikroliter av medium från varje brunn av tumörcellen, T cell samkultur plattan planeras för rechallenge enligt tabellen. Tillsätt sedan 50 mikroliter av färsk glioblastoma cell suspension, beredd som just visat, men med dubbelt cellnumret av den ursprungliga samkultur till varje brunn med mild blandning. Och lämna tillbaka plattan till cellkulturinkubatorn.Dag ett, tre, fem och sju av samkultur, överföra supernatant från varje brunn som skall skördas till en ny 96 väl runda bottenplatta enligt tabellen och lägga till 50 mikroliter av förvörd 0,5% Trypsin EDTA i varje medium utarmat väl. Efter fem minuter vid 37 grader Celsius, bekräfta att cellerna har lossnat från botten av varje brunn genom ljusmikroskopi, och försiktigt pipettera enzymlösningen runt botten av varje brunn för att återanvända cellerna. Innan den fristående cellupphängningen överförs till de lämpliga motsvarande brunnarna i den nya 96 brunnsplattan.Pellet cellerna genom centrifugering, och tvätta cellerna med 200 mikroliter av fluorescerande aktiverad cellsortering stående lösning, eller FFS per brunn med en andra centrifugering. Åter avbryta pellets i 100 mikroliter av antikroppen cocktail av intresse för 100 mikroliter av SSS per brunn för en 30 minuters inkubation vid fyra grader Celsius. A slutet av inkubationen bort eventuella obundna antikroppar genom sekventiella 100 och 200 microliter FSS tvättar och åter upphäva cellerna i 100 till 200 mikroliter av DAPI nukleära fläcken och FSS.Analysera sedan cellerna enligt standardflödescytometriska analysprotokoll. För funktionella och fenotypiska analys av CAR T-cellerna efter tumör cellen samkultur, hämta datafilerna från flödet cytometer, och gate alla levande DAPI negativa celler. För att kvantifiera tumörcellerna, gate CD45 negativ population.För att kvantifiera CAR T-cellerna grinden CD45 positiva CAR positiv befolkning. Sedan rita tumören och CAR T cell nummer under tiden kursen för experimentet, identifiera T-cell aktivering av co-uttryck för 41BB, och CD69. T-cellutmattning genom uttrycket av PD1, LAG3 och TIM3, och T-cellens minnesstatus LAG3 och TIM3, och T-cellsminnesstatusen av CD45RO och CD62-liganduttryck.av CD45RO, och CD62 ligand uttryck. Både CD4 positiva, och CD8 positiva CAR T celler blir lika aktiveras mot glioblastoma celler som uttrycker målet antigen som anges av deras CD107a och intracellulära cytokin uttryck. Men, som bedöms av repetitiva tumör utmaning SA, CD4 positiva, men inte CD8 positiva, CAR T-celler kan flera runda dödande.CD4 positiva CAR T-celler uppnår också en mer robust expansion. När CD4 positiva, och CD8 positiva CAR T-celler blandas på en ett till ett förhållande, denna cell kombination ut utför CD8 positiva, men inte CD4 positiva CAR T-celler i termer av långsiktig cytotoxicitet. Dessutom är utbyggnaden av CD8 positiva CAR T-celler induceras genom tillägg av CD4 positiva T-celler.Medan CD4 positiva CAR T cell expansion hämmas i närvaro av CDa positiva celler. 24 timmar efter den inledande samkulturen, både CD4 positiva och CD8 positiva CAR T-celler är på samma sätt aktiveras. Under repetitiva tumör utmaning, både CD4 positiva och CD8 positiva CAR T-celler visar en övergång från en CD45RO positiva, CD62 ligan positiva centrala minne fenotyp, till en CD45RO positiva CD62 ligan negativa effector minne fenotyp.CD8 positiva CAR T-celler är också mer benägna att utmattning jämfört med CD4 positiva CAR T-celler som bedöms av deras PD1, LAG3 och TIM3 uttryck efter tre dagar av samkultur. Vidare, inga skillnader observerats i CDa positiva CAR T cell utmattning i närvaro eller avsaknad av CD4 positiva T-celler, vilket tyder på att CD4 inducerad CD8 positiva CAR T cell expansion inte är associerad med en bättre effektor funktion. Denna uppsats kan också kopplas ihop med sortering av T-celler bildar samkulturen för att utföra ytterligare analys på transkriptomer, proteomik, och specifika gener av intresse.Denna repetitiva tumör utmaning kan också användas som en plattform för att undersöka de biologiska händelserna post CAR T cell tumör erkännande.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Target Cell Pre-enrichment and Whole Genome Amplification for Single Cell Downstream Characterization

Mål Cell före berikning och hela genomet förstärkning för enstaka Cell nedströms karakterisering

Rare target cells can be isolated from a high background of non-target cells using antibodies specific for surface proteins of target cells. A recently ...

A Syngeneic Mouse B-Cell Lymphoma Model for Pre-Clinical Evaluation of CD19 CAR T Cells

Syngena mus B-cells lymfom modell för preklinisk utvärdering av CD19 CAR T-celler

The astonishing clinical success of CD19 chimeric antigen receptor (CAR) T-cell therapy has led to the approval of two second generation chimeric antigen ...

Real Time Detection of In Vitro Tumor Cell Apoptosis Induced by CD8+ T Cells to Study Immune Suppressive Functions of Tumor-infiltrating Myeloid Cells

Real Time Detection of In Vitro Tumor Cell Apoptosis Induced by CD8+ T Cells to Study Immune Suppressive Functions of Tumor-infiltrating Myeloid Cells

Realtid upptäcka i Vitro tumör Cell apoptos induceras av CD8+ T celler att studera suppressiv immunförsvaret av tumör-infiltrera myeloida celler

Potentiation of the tumor-killing ability of CD8+ T cells in tumors, along with their efficient tumor infiltration, is a key element of successful ...

Flow Cytometric Analysis of Mitochondrial Reactive Oxygen Species in Murine Hematopoietic Stem and Progenitor Cells and MLL-AF9 Driven Leukemia

Flödescytometrisk analys av mitokondriella reaktiva syreradikaler i murina hematopoietiska Stem och progenitorceller och MLL-AF9 driven leukemi

We present a flow cytometric approach for analyzing mitochondrial ROS in various live bone marrow (BM)-derived stem and progenitor cell populations from ...

Manufacturing Chimeric Antigen Receptor (CAR) T Cells for Adoptive Immunotherapy

Manufacturing Chimeric Antigen Receptor CAR T Cells for Adoptive Immunotherapy

Tillverkning chimeric antigen receptor (bil) T celler för adoptiv immunterapi

Adoptive immunotherapy holds promise for the treatment of cancer and infectious disease. We describe a simple approach to transduce primary human T cells ...

Using Human Induced Pluripotent Stem Cells for the Generation of Tumor Antigen-specific T Cells

Använda humana inducerade pluripotenta stamceller för generering av tumör antigen-specifika T-celler

The generation and expansion of functional T cells in vitro can lead to a broad range of clinical applications. One such use is for the treatment of ...

Generation of Orthotopic Pancreatic Tumors and Ex vivo Characterization of Tumor-Infiltrating T Cell Cytotoxicity

Generation of Orthotopic Pancreatic Tumors and Ex vivo Characterization of Tumor-Infiltrating T Cell Cytotoxicity

Generering av ortotopisk Pankreastumörer och ex vivo karakterisering av tumörinfiltrerande T-cell cytotoxicitet

In vivo models of pancreatic cancer provide invaluable tools for studying disease dynamics, immune infiltration and new therapeutic strategies. The ...

In Vitro Evaluation of Oncogenic Transformation in Human Mammary Epithelial Cells

In Vitro Utvärdering av Oncogenic Transformation i mänskliga mammary Epitelial celler

Tumorigenesis is a multi-step process in which cells acquire capabilities&#160;that allow their growth, survival, and dissemination under hostile ...

Dynamic Imaging of Chimeric Antigen Receptor T Cells with [18F]Tetrafluoroborate Positron Emission Tomography/Computed Tomography

Dynamic Imaging of Chimeric Antigen Receptor T Cells with [18F]Tetrafluoroborate Positron Emission Tomography/Computed Tomography

Dynamisk avbildning av chimeriska antigenreceptor T-celler med [18F]Tetrafluorborate Positron Emission Tomography/Computed Tomography

T cells genetically engineered to express chimeric antigen receptors (CAR) have shown unprecedented results in pivotal clinical trials for patients with B ...

Evaluation of the In vivo Antitumor Activity of Polyanhydride IL-1&#945; Nanoparticles

Evaluation of the In vivo Antitumor Activity of Polyanhydride IL-1ÃƒÅ½Ã‚Â± Nanoparticles

Utvärdering av in vivo antitumöraktivitet av polyanhydrid IL-1α nanopartiklar

Cytokine therapy is a promising immunotherapeutic strategy that can produce robust antitumor immune responses in cancer patients. The proinflammatory ...