Longitudinale Intravital beeldvorming van hersen tumor Celgedrag in reactie op een invasieve chirurgische biopsie

Dit protocol stelt de gebruiker in staat om de impact van invasieve chirurgische ingrepen die in de kliniek worden gebruikt op tumorcelgedrag, zoals migratie, invasie en proliferatie, te bestuderen. Deze methode maakt het op unieke wijze mogelijk om dezelfde tumor voor en na een invasieve procedure te visualiseren, waardoor een inzicht wordt geboden dat kan worden gemist in een niet-longitudinale benadering. Na bevestiging van een gebrek aan respons op teen knijpen in een verdoofde volwassen muis, monteer de muis op een stereotactisch frame en zet het hoofd vast met een neusklem en twee oorbalken.

Gebruik een verwarmingslamp om de lichaamstemperatuur te behouden en breng zalf aan op de ogen van het dier. Met behulp van een scherpe schaar scheer je de vacht op de schedel van de ogen naar de basis van de schedel en gebruik je 70% ethanol om de blootgestelde huid te steriliseren. Snijd de huid op een cirkelvormige manier, en gebruik een wattenstaafje om weg te schrapen de blootgestelde periosteum.

Behandel het chirurgische gebied met een druppelocaïne en een concentratie van 1:100, 000 tot 000 epinephrinum gedurende vijf minuten voordat u de overtollige oplossing met een wattenstaafje verwijdert. Gebruik cyanoacrylaatlijm om de randen van de huid aan de schedel te hechten en plaats het stereotactische frame onder een dissectie-stereomicroscoop met een 4x vergroting. Boor vervolgens voorzichtig een oppervlakkige, vijf millimeter diameter, cirkelvormige groef over het rechter pariëtale bot.

En breng een druppel cortex buffer aan op de groef. Gebruik dunne tangen om de botflap op te tillen om het hersenoppervlak te visualiseren en gebruik gebogen, taps toelopende, zeer fijne puntkrachten om de dura mater te verwijderen. Als bloeding optreedt, gebruik dan een absorbeerbare gelatine spons om hemostase te bereiken.

Voor tumorcel injectie, belasting ongeveer drie microliters van de cellen in een vijf microliter gas-strakke spuit uitgerust met een punt stijl twee naald. Bevestig de naald op de stereotaxic manipulator arm, en verwijder de cortex buffer uit het blootgestelde weefsel. Plaats de punt van de spuit in het midden van de craniotomie en steek de naald op een diepte van 0,5 millimeter van het oppervlak van de schedel.

Voeg vervolgens een druppel cortexbuffer toe aan de craniotomie en gebruik een microsyruitpompinjector om de cellen te leveren met een snelheid van 250 tot 400 nanoliter per minuut. Ter voorbereiding van de craniale beeldvorming venster, vervang de cortex buffer met een druppel siliconen olie naar de craniotomie site om luchtbellen onder het raam te voorkomen. Verzegel de blootgestelde hersenen met een zes millimeter coverslip, en breng cyanoacrylaat lijm tussen de coverslip en de schedel.

Gebruik vervolgens fijne pincet om de coverslip voorzichtig tegen de schedel te drukken. Plaats de muis op het juiste experimentele moment in een beeldvormingsdoos en stel de 25x-waterdoelstelling in op de laagste z-positie. Voeg een grote druppel water toe aan het doel en breng de beeldvormbox over in de 37 graden Celsius donkere klimaatkamer van de microscoop.

Breng het doel naar de craniale beeldvorming venster coverslip totdat het waterdruppel raakt de coverslip. En met behulp van de epifluorescentie modus, observeer de tumor door het oculair om de cellen in beeld te brengen. Stem de laser af op de juiste golflengte en selecteer de live-modus.

Na het selecteren van verschillende posities van belang voor beeldvorming, registreren hun coördinaten in de software. Definieer een z-stack voor elke positie om het maximale volume van tumorcellen te verwerven zonder afbreuk te doen aan de resolutie van de tumorcel, met de stapgrootte tussen afbeeldingen ingesteld op drie micrometers. Verwerf vervolgens gedurende twee uur elke 20 minuten beelden van het tumorvolume op verschillende posities, waardoor water aan de doelstelling wordt toegevoegd vóór elke beeldverwerving.

Nadat de laatste afbeelding is verkregen, breng je de muis over naar een verwarmingskussen met bewaking tot volledig herstel. Een dag na de eerste beeldvormingssessie beveiligt u de verdoofde muis in het stereotaxic-frame zoals aangetoond en gebruikt u een met aceton doordrenkt wattenstaafje om de randen van de coverslip af te vegen totdat de lijm wordt verzacht. Schuif een naald van 25 meter onder de coverslip en gebruik dunne punt tangen om het op te tillen, en hydrateren de craniotomie met verse cortex buffer.

Prik de tumor tot een diepte van een millimeter met een naald van 25 meter, stop elke bloeding met een steriele gelatinespons en sluit het oppervlak van de hersenen af met verse siliconenolie. Lijm dan een nieuwe zes millimeter coverslip over de wond. Open voor beeldanalyse het time-lapse LIF-bestand in het microscoopsoftwareprogramma en selecteer het tabblad Proces, Proceshulpprogramma's en Samenvoegen.

Selecteer de eerste afbeelding van de tijdsequentie en klik eerst. Selecteer de tweede afbeelding van de tijdsequentie en klik op de tweede. Selecteer in Afmetingen samenvoegen t voor tijd en klik vervolgens op Toepassen.

Er wordt een nieuw bestand met twee tijdpunten gegenereerd. Nadat u elke time-lapse-serie voor drie opeenvolgende z-stacks afzonderlijk hebt bijgehouden, sleept u de map met de time-lapse-afbeeldingen naar ImageJ. Selecteer het tabblad Plug-ins, Tracking en MtrackJ.

Als u elke afzonderlijke cel wilt bijhouden, selecteert u Toevoegen en klikt u op elke cel op elk tijdstip. Klik vervolgens op meten en sla het bestand op om de maat van de tracks te extraheren. De migratie van individuele tumorcellen kan worden bepaald door het migratiepad in de loop van de tijd te volgen in verschillende xy-vlakken van de z-stack en uitgezet als een percentage van de migrerende cellen pre en post biopsie.

De tumorcel proliferatie tarief kan worden gekwantificeerd op basis van H2B-tagged Dendra2 condensatie op mitose en uitgezet als een percentage van de delende cellen pre en post biopsie. Het vergelijken van de verdeling van de migratiesnelheid voor en na de biopsie in dezelfde tumor, toont aan dat het aantal migratiecellen toeneemt na de interventie, met een bijbehorende afname van het aantal langzame tot niet-migrerende cellen. Gemiddeld per tumor wordt een 1,75-voudige toename van het percentage trekcellen waargenomen wanneer een biopsie-achtige verwonding wordt uitgevoerd, in vergelijking met controle, niet-gebiopte muizen.

Hoewel het percentage trekkende tumorcellen uiteindelijk afneemt in zowel controle- als bioptmuizen, vertonen bioptmuizen nog steeds een hogere migratiecapaciteit dan controlemuizen in het algemeen. Tumorcelproliferative gedrag toont ook een 1.52-voudige toename van het aantal mitotische gebeurtenissen op biopsie na verloop van tijd, ten opzichte van niet-gebiopte controle muizen. Van nota, wordt geen inductie van tumorcelmigratie of proliferatie waargenomen na schedelbeeldvormingsvenstervervanging zonder biopsie, wat erop wijst dat de impuls in de proliferatie van tumorcellen en migratietarieven specifiek door de biopsie-als verwonding wordt veroorzaakt.

Het is belangrijk om te werken met hoge precisie en chirurgische vaardigheid tijdens de craniale beeldvorming, implantatie, en vervanging stappen. Uitgebreide praktijk kan nodig zijn.