Longitudinell Intravital avbildning av hjärntumör cell beteende som svar på en invasiv kirurgisk biopsi

Detta protokoll gör det möjligt för användaren att studera effekterna av invasiva kirurgiska ingrepp som används i kliniken på tumörcellsbeteenden, såsom migration, invasion och spridning. Denna metod tillåter unikt visualisering av samma tumör före och efter en invasiv förfarande, vilket ger en insikt som kan missas i en icke-longitudinell strategi. Efter att ha bekräftat en brist på svar på tå nypa i en sövd vuxen mus, montera musen på en stereotaktisk ram och säkra huvudet med en näsa klämma och två öronstänger.

Använd en värmelampa för att bevara kroppstemperaturen, och applicera salva på djurets ögon. Med hjälp av vass sax, raka pälsen på skallen från ögonen till skallbasen, och använd 70%etanol för att sterilisera den exponerade huden. Skär huden i ett cirkulärt sätt, och använd en bomullspinne för att skrapa bort den exponerade periosteum.

Behandla det kirurgiska området med en droppe 1%lidokain, och en 1:100, 000 koncentration av adrenalin i fem minuter innan du tar bort överflödig lösning med en bomullspinne. Använd cyanoakrylatlim för att hålla hudens kanter till skallen, och placera stereotaktisk ram under en dissektion stereomikroskop med en 4x förstoring. Därefter borra försiktigt en ytlig, fem millimeter diameter, cirkulär spår över rätt parietalt ben.

Och applicera en droppe cortexbuffert på spåret. Använd tunna tång för att lyfta benfliken för att visualisera hjärnytan, och använd böjda, avsmalnande, mycket fina punkttång för att ta bort dura mater. Om blödning uppstår, använd en absorberbar gelatin svamp för att uppnå hemostas.

För tumörcellsinjektion, ladda ungefär tre mikroliter av cellerna i en fem mikroliter gas-tight spruta utrustad med en punkt stil två nål. Fixa nålen på den stereotaxiska manipulatorarmen, och ta bort cortexbufferten från den exponerade vävnaden. Placera sprutans spets i mitten av kraniotomi och stick in nålen på 0,5 millimeters djup från skallens yta.

Lägg sedan till en droppe cortexbuffert till kraniotomi, och använd en microsyringe pumpinjektor för att leverera cellerna med en 250 till 400 nanoliter per minuthastighet. För att förbereda kranial bildtagningsfönstret, byt ut cortexbufferten med en droppe silikonolja till kraniotomiplatsen för att undvika luftbubblor under fönstret. Försegla den exponerade hjärnan med en sex millimeters täckplatta, och applicera cyanoakrylatlim mellan täckplattan och skallen.

Använd sedan fin pincett för att försiktigt trycka täckskydden mot skallen. Vid lämplig experimentell tidspunkt placerar du musen med framsidan upp i en bildbox, och ställer in 25x-vattenmålet på lägsta z-läge. Tillsätt en stor droppe vatten till målet, och överföra avbildningslådan i mikroskopets 37 graders Celsius mörka klimatkammare.

Ta målet till kranial bildruta täck tills vattendroppsen vidrör täckplattan. Och med hjälp av epifluorescensläget, observera tumören genom okularet för att få cellerna i fokus. Ställ in lasern på rätt våglängd och välj live-läge.

Efter att ha valt flera positioner av intresse för bildbehandling, spela in sina koordinater i programvaran. Definiera en z-stack för varje position för att förvärva maximal volym av tumörceller utan att kompromissa med tumörcellens upplösning, med stegstorleken mellan bilderna som är inställda på tre mikrometer. Sedan förvärva bilder av tumörvolymen på olika positioner var 20 minuter i två timmar, lägga till vatten till målet före varje bild förvärv.

Efter den sista bilden förvärvas, överföra musen till en värmedyna med övervakning tills full återhämtning. En dag efter den första bildtagningssessionen, säkra den sövda musen i stereotaxic ramen som visats, och använda en aceton-indränkt bomullspinne för att torka kanterna på täcket tills limmet mjukas. Skjut en 25 gauge nål under täcket och använda tunna spets tämja för att lyfta den, och hydrat kraniotomy med färska cortex buffert.

Punktera tumören till en millimeter djup med en 25 gauge nål, stoppa någon blödning med en steril gelatin svamp, och försegla hjärnans yta med färsk silikonolja. Limma sedan en ny sex millimeter coverslip över såret. För bildanalys öppnar du LIF-filen för tidsfördröjning i programmet för mikroskopprogram och väljer fliken Process, Processverktyg och Merge.

Markera den första bilden av tidssekvensen och klicka först. Markera den andra bilden av tidssekvensen och klicka på andra. Välj t för tid i Sammanfoga dimensioner och klicka sedan på använd.

En ny fil med två tidspunkter kommer att genereras. Efter att ha spårat varje time-lapse-serie för tre på varandra följande z-stackar separat, dra mappen som innehåller timelapse-bilderna till ImageJ. Välj fliken Plugins, Tracking och MtrackJ.

För att spåra varje enskild cell, markera Lägg till och klicka på varje cell vid varje tidpunkt. Klicka sedan på mått, och spara filen för att extrahera måttet på spåren. Migrationen av enskilda tumörceller kan bestämmas genom att spåra migrationsvägen över tiden i olika xy-plan av z-stacken och ritas som en procentandel av de flyttande cellerna före och efter biopsi.

Tumörcellen spridningshastigheten kan kvantifieras baserat på H2B-taggade Dendra2 kondensation vid mitos och ritas som en procentandel av de dela cellerna före och efter biopsi. Jämföra fördelningen av migrationshastighet före och efter biopsi i samma tumör, avslöjar att antalet flyttande celler ökar efter ingreppet, med en associerad minskning av antalet långsamma till nonmigratory celler. I genomsnitt per tumör observeras en 1,75-faldig ökning av andelen flyttande celler när en biopsiliknande skada utförs, jämfört med kontroll, nonbiopsied möss.

Även om andelen flyttande tumörceller så småningom minskar i både kontroll och biopsied möss, biopsied möss uppvisar fortfarande en högre flyttande kapacitet än kontroll möss totalt. Tumör cell proliferative beteende visar också en 1.52-faldig ökning av antalet mitotiska händelser vid biopsi över tiden, i förhållande till nonbiopsied kontroll möss. Notera, ingen induktion av tumör cell migration eller spridning observeras efter kranial bildbehandling fönster ersättning utan biopsi, vilket tyder på att uppsvinget i tumör cell spridning och migration priser är särskilt utlöses av biopsi-liknande skada.

Det är viktigt att arbeta med hög precision och kirurgisk skicklighet under hjärnskålen bildbehandling, implantation, och ersätter steg. Omfattande praxis kan vara nödvändig.