Name: colorimetric analysis of alkaline phosphatase activity in s. aureus biofilm
Uploaded: 2019-04-12T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Colorimetric Analysis of Alkaline Phosphatase Activity in S. aureus Biofilm at JoVE.com

ونحن نشكر وليام Rainey هاربر كلية وجامعة إلينوي في شيكاغو لمرفق لإجراء هذه التجارب. كما نشكر "مؤسسة ماكجرو هيل" على دعمها السخي.

1-إعداد متوسطة
<ol><li>تحضير 1 لتر من مرق الصويا تريبتيك (TSB): إضافة إلى 1 لتر من الماء المقطر، 15 غرام خلاصة البنكرياس الكازين، 5 غ خلاصة بابيك فول الصويا، والجيل الثالث 3g من كلوريد الصوديوم، 2.5 غرام من سكر العنب و 2.5 غرام من فوسفات ديبوتاسيوم. تعقيمها قبل الاستخدام.</li>
	<li>إضافة لاجار الصويا تريبتي...

<ol>
	<li>Coleman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+mechanism+of+alkaline+phosphatase.">Structure and mechanism of alkaline phosphatase.</a> Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 21, 441-483 (1992).</li><li>Sharma, U., Pal, D., Prasad, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alkaline+Phosphatase:+An+Overview.">Alkaline Phosphatase: An Overview.</a> Indian Journal of Clinical Biochemistry. 29 (3), 269-278 (2014).</li><li>Mitchell, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+frequencies+of+elevated+alkaline+phosphatase+activity+and+rickets+exist+in+extremely+low+birth+weight+infants+despite+current+nutritional+support.">High frequencies of elevated alkaline phosphatase activity and rickets exist in extremely low birth weight infants despite current nutritional support.</a> Boston Medical Center Pediatrics. 9, 47 (2009).</li><li>Fawley, J., Gourlay, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+alkaline+phosphatase:+A+summary+of+its+role+in+clinical+disease.">Intestinal alkaline phosphatase: A summary of its role in clinical disease.</a> Journal of Surgical Research. 202 (1), 225-234 (2016).</li><li>Derman, A. I., Beckwith, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Escherichia+coli+Alkaline+Phosphatase+Localized+to+the+Cytoplasm+Slowly+Acquires+Enzymatic+Activity+in+Cells+Whose+Growth+Has+Been+Suspended:+a+Caution+for+Gene+Fusion+Studies.">Escherichia coli Alkaline Phosphatase Localized to the Cytoplasm Slowly Acquires Enzymatic Activity in Cells Whose Growth Has Been Suspended: a Caution for Gene Fusion Studies.</a> Journal of Bacteriology. 177 (13), 3764-3770 (1995).</li><li>Danikowski, K. M., Cheng, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alkaline+Phosphatase+Activity+of+Staphylococcus+aureus+grown+in+Biofilm+and+Suspension+Cultures.">Alkaline Phosphatase Activity of Staphylococcus aureus grown in Biofilm and Suspension Cultures.</a> Current Microbiology. 75, 1226-1230 (2018).</li><li>Okabayashi, K., Futai, M., Mizuno, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+of+Acid+and+Alkaline+Phosphatases+in+Staphylococcus+aureus.">Localization of Acid and Alkaline Phosphatases in Staphylococcus aureus.</a> Japanese Journal of Microbiology. 18 (4), 287-294 (1974).</li><li>Cheng, K. J., Costerton, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alkaline+Phosphatase+Activity+of+Rumen+Bacteria.">Alkaline Phosphatase Activity of Rumen Bacteria.</a> Applied and Environmental Microbiology. , 586-590 (1997).</li><li>Berezhetskyy, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphatase+conductometric+biosensor+for+heavy-metal+ions+determination.">Phosphatase conductometric biosensor for heavy-metal ions determination.</a> Innovation and Research in Biomedical Engineering. 29 (2-3), 136-140 (2008).</li><li>Park, E. J., Kang, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+bacterial+alkaline+phosphatase+assay+for+rapid+monitoring+of+bacterial+counts+on+spinach.">The use of bacterial alkaline phosphatase assay for rapid monitoring of bacterial counts on spinach.</a> Journal of Food Science. 73 (5), M236-M238 (2008).</li><li>Barber, M., Kuper, S. W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+Staphylococcus+pyogenes+by+the+phosphatase+reaction.">Identification of Staphylococcus pyogenes by the phosphatase reaction.</a> The Journal of Pathology and Bacteriology. 63, 65-68 (1951).</li><li>Wolf, P. L., Von der Muehll, E., Ludwick, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+test+to+differentiate+Serratia+from+Enterobacter.">A new test to differentiate Serratia from Enterobacter.</a> American Journal of Clinical Pathology. 56, 241-243 (1972).</li><li>Rangam, C. M., Katdare, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphatase+activity+of+Staphylococci+as+an+indication+of+their+pathogenicity.">Phosphatase activity of Staphylococci as an indication of their pathogenicity.</a> Indian Journal of Medical Science. 8, 610-613 (1954).</li><li>Flemming, H. -. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biofilms:+an+emergent+form+of+bacterial+life.">Biofilms: an emergent form of bacterial life.</a> Nature Reviews Microbiology. 14, 563-575 (2016).</li><li>Hoiby, N., Bjarnsholt, T., Givskov, M., Molin, S., Ciofu, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibiotic+resistance+of+bacterial+biofilms.">Antibiotic resistance of bacterial biofilms.</a> International Journal of Antimicrobial Agents. 35, 322-332 (2010).</li><li>Ito, A., Taniuchi, A., May, T., Kawata, K., Okabe, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+antibiotic+resistance+of+Escherichia+coli+in+mature+biofilms.">Increased antibiotic resistance of Escherichia coli in mature biofilms.</a> Applied and Environmental Microbiology. 75, 4093-4100 (2009).</li><li>Witherow, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Ten-Week+Biochemistry+Lab+Project+Studying+Wild-Type+and+Mutant+Bacterial+Alkaline+Phosphatase.">A Ten-Week Biochemistry Lab Project Studying Wild-Type and Mutant Bacterial Alkaline Phosphatase.</a> Biochemistry and Molecular Biology Education. 44 (6), (2016).</li><li>Henthorn, P., Zervos, P., Raducha, M., Harris, H., Kadesch, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+a+human+placental+alkaline+phosphatase+gene+in+transfected+cells:+Use+as+a+reporter+for+studies+of+gene+expression.">Expression of a human placental alkaline phosphatase gene in transfected cells: Use as a reporter for studies of gene expression.</a> Proceedings of the National Academy of Science USA. 85, 6324-6346 (1988).</li><li>Horney, B. S., Farmer, A. J., Honor, D. J., MacKenzie, A., Burton, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agarose+gel+electrophoresis+of+alkaline+phosphatase+isoenzymes+in+the+serum+of+hyperthyroid+cats.">Agarose gel electrophoresis of alkaline phosphatase isoenzymes in the serum of hyperthyroid cats.</a> Veterinary Clinical Pathology. 23 (3), 98-102 (1994).</li><li>Farley, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+Skeletal+Alkaline+Phosphatase+in+Osteoporotic+Serum+by+Wheat+Germ+Agglutinin+Precipitation,+Heat+Inactivation,+and+a+Two-Site+Immunoradiometric+Assay.">Quantification of Skeletal Alkaline Phosphatase in Osteoporotic Serum by Wheat Germ Agglutinin Precipitation, Heat Inactivation, and a Two-Site Immunoradiometric Assay.</a> Clinical Chemistry. 40 (9), 1749-1756 (1994).</li><li>O&#8217;Toole, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtiter+Dish+Biofilm+Formation+Assay.">Microtiter Dish Biofilm Formation Assay.</a> Journal of Visualized Experience. , (2011).</li><li>Nomoto, M., Ohsawa, M., Wang, H. L., Chen, C. C., Yeh, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+Characterization+of+Extracellular+Alkaline+Phosphatase+from+an+Alkalophilic+Bacterium.">Purification and Characterization of Extracellular Alkaline Phosphatase from an Alkalophilic Bacterium.</a> Agricultural and Biological Chemistry. 52 (7), 1643-1647 (1988).</li></ol>

في أعمالنا المقايسة، استخدمنا بنب الركيزة الب. هذا حل عمل المصممة لإليزا ولا تمييع المسبق. بعد التحلل من حزب العمال الأسترالي، يطور منتج أصفر ويمكن أن يقاس في 405 نانومتر. في نهاية رد فعل الانزيمية، نحن بإيجاز تثفيل 96 لوحة جيدا ونقل المادة طافية إلى صفيحة جيدا 96 جديدة لقياس امتصاص استخدام قا...

وأعرب الفوسفاتيز القلوية (حزب العمال الأسترالي) هو أوبيكويتوسلي في كل خلايا بدائية وحقيقية النواة1. فإنه يمكن تحفيز التحلل الأدينوزين من جزيئات مختلفة مثل النيوكليوتيدات والقلويات، استرات الفوسفات والبروتينات أو أملاحه من حامض الفوسفوريك. في البشر، وألب حقيقية النواة الحالية في العديد من الأنسجة بما فيها الكبد والعظام و الأمعاء والمشيمة2. وهي تلعب أدواراً هامة في الفسفرة البروتين ونمو الخلايا، والمبرمج، وعمليات الخلايا الجذعية، فضلا عن تمعدن الهيكل العظمى العادي. الب حقيقية النواة أيضا مؤشر مصل رئيسية لوجود أمراض في العظام والكبد والأنسجة/الأجهزة الأخرى عند ارتفاع3،4.
تم الكشف عن الب بدائية في مجموعة متنوعة من الخلايا البكتيرية، بما في ذلك كولاي5و المذهبة س.6،7 وبعض البكتريا الكرش الشائعة في التربة8. وقد استخدمت البكتيرية الب النشاط بيوسينسور في الكشف عن مبيدات الآفات والمعادن الثقيلة9 والتلوث البكتيري10. وقد استخدمت التعبير التأسيسي لحزب العمال الأسترالي لتحديد العنقوديات11 والتفريق بين السراتية عن12. ومن المقترح كذلك أن التأسيسي الب الإنتاج يرتبط بالقدرة الإمراضية في العنقوديات13. على الرغم من أن حزب العمال الأسترالي ودرست في إعدادات مختلفة3،4، بعد قليل يقال للدالة في الثقافات الأغشية الحيوية والنشاط.
وتم توثيق بيوفيلم لحياة بكتيرية تعمل بشكل مختلف بالمقارنة نظيره الخلايا البكتيرية الشرانق14. في المذهبة س.، تم التعرف على تشكيل بيوفيلم في مجموعة متنوعة من الظروف السريرية وحسابات لمقاومة المضادات الحيوية والتهاب مزمن15،16. أبلغ العديد من الجزيئات التي يمكن العثور عليها في مصفوفة بيوفيلم مثل السكريات والبروتينات والأحماض النووية والدهون، ولكن هذه الآلية لتشكيل بيوفيلم ليست مفهومة تماما14. لفهم دور الب في تشكيل بيوفيلم، مثقف الأغشية الحيوية في المذهبة س. في 96 زراعة الأنسجة ولوحات، وقياس النشاط الب باستخدام الفقرة--نيتروفينيلفوسفاتي (بنب).
بنب جزيء هو ركيزة جاهزة للاستخدام لحزب العمال الأسترالي، وقد استخدمت على نطاق واسع لقياس الب النشاط6،،من1718. يستند هذا الفحص اللونية تحويل فوسفات نيتروفينيل الفقرة (بنب) إلى الفقرة-نيتروفينول أسفر عن منتج ملونة في 405 نانومتر. مقارنة بسائر الإنزيم الب التقليدية، مثل [اغروس] هلام التفريد19، جرثومة القمح أجلوتينين (WGA) هطول الأمطار، ووغ-[هبلك]20، هذا التحليل محددة للغاية، حساسة، سهلة للتكاثر، ومعظم الأهم من ذلك، يسمح لارتفاع سرعة النقل.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>VWR</td>
			<td>9002-18-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Centrifuge</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>5810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gluose</td>
			<td>VWR</td>
			<td>50-99-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH pellets</td>
			<td>VWR</td>
			<td>SS0550-500GR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Para-nitrophenylphosphate (pNPP)&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7998-100ML</td>
			<td>Typical concentrations of pNPP liquid substrates, often used in enzyme-linked immunesorbent assays (ELISA), range between 10 to 50 mM. Similar to most ready-to-use pNPP liquid substrates like the one used here, the exact pNPP concentration is not disclosed due to its proprietary nature.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X PBS, pH7.4. 
			173 mM NaCl, 
			2.7 mM KCl, 
			8 mM Na2HPO4, 
			2 mM KH2PO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P3288-1VL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate Reader</td>
			<td>Biotek</td>
			<td>ELx808</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S. aureus</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>ATCC25923</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptic Soy Agar&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 15g / L TSB</td>
			<td>VWR</td>
			<td>9002-18-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptic Soy Broth:&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; g/L 
			Pancreatic Digest of Casein............ 15.0 
			Papaic Digest of Soyben Meal.........5.00 
			Sodium chloride.............................. 3.00 
			Dextrose........................................&#160; 2.50 
			Dipotassium phosphate..................2.50</td>
			<td>VWR</td>
			<td>90006-098</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well tissue culture plates</td>
			<td>BD</td>
			<td>6902D09</td>
			<td>U shaped bottom</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

colorimetric analysis of alkaline phosphatase activity in s. aureus biofilm

الفوسفاتيز القلوية (حزب العمال الأسترالي) إنزيم مشتركة المعرب عنها في الخلايا بدائية النواة وحقيقية النواة على حد سواء. أنه يحفز التحلل المائي للفوسفات مونوستيرس من العديد من الجزيئات في الأس الهيدروجيني القاعدي ويلعب دوراً لا غنى عنه في استقلاب الفوسفات. في البشر، وألب حقيقية النواة واحدة من الإشارات الانزيمية الأكثر استخداماً في تشخيص الأمراض المختلفة، مثل ركود صفراوي والكساح. في س. تم الكشف عن المكوّرات، الب حصرا على غشاء الخلية؛ وأعربت هو أيضا كنموذج افرازية، وكذلك. ومع ذلك، يعرف الكثير عن وظيفتها في تشكيل بيوفيلم.
والغرض من هذه المخطوطة هو القيام مقايسة سريعة ويمكن الاعتماد عليها لقياس نشاط حزب العمال الأسترالي في المذهبة س. بيوفيلم التي لا تتطلب عزل البروتين. استخدام الفوسفات p-نيتروفينيل (بنب) كركيزة، قمنا بقياس نشاط حزب العمال الأسترالي في المذهبة س. بيوفيلم شكلت في لوحات زراعة الأنسجة 96-جيدا. نشاط يستند تشكيل رد فعل للذوبان المنتج تقاس 405 نانومتر امتصاص. طبيعة إنتاجية عالية الأسلوب لوحة 96 زراعة الأنسجة جيدا يوفر طريقة حساسة واستنساخه لفحوصات نشاط حزب العمال الأسترالي. كما يمكن توسيع نفس تجريبي إعداد لقياس المؤشرات الجزيئية خارج الخلية الأخرى المتصلة بتشكيل بيوفيلم.

ويبين الشكل 1 نتيجة نشاط حزب العمال الأسترالي من الثقافات بيوفيلم في المذهبة س. ممثل في 96 زراعة الأنسجة ولوحات. ميكروليتر 75 من الحلول المتاحة تجارياً بنب أضيفت إلى كل خير والمحتضنة في درجة حرارة الغرفة. بعد حضانة للأوقات المختلفة (0 دقيقة، 15 دقيقة، 30 د?...

Watch this Scientific Journal Video about Colorimetric Analysis of Alkaline Phosphatase Activity in S. aureus Biofilm at JoVE.com

Colorimetric Analysis of Alkaline Phosphatase Activity in S. aureus Biofilm

في هذه المخطوطة، قمنا بإنشاء أسلوب عالية إنتاجية تحديد مقدار النشاط الفوسفاتيز القلوية في المذهبة س. بيوفيلم الثقافة من لوحة زراعة الأنسجة 96-جيدا

قياس الألوان "التحليل من القلوية الفوسفاتيز النشاط" في المذهبة س. بيوفيلم

Alkaline phosphatase (ALP) is a common enzyme expressed in both prokaryotic and eukaryotic cells. It catalyzes the hydrolysis of phosphate monoesters from ...

قدم هذا البروتوكول طريقة سهلة وموثوق بها لقياس نشاط الفوشطات القلوية في ثقافة S.aureus biofilm. وسوف تساعدنا على فهم وظيفة ALP في تشكيل بيو فيلم. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي الإنتاجية العالية.أنها حساسة جدا وسهلة لأداء. وإظهار الإجراء سيكون كيفن دانيكوفسكي، وهو طالب سابق من كلية هاربر. لإعداد TSB، إضافة هضم البنكرياس من الهاسين، هضم بابايك من وجبة فول الصويا، كلوريد الصوديوم، ديكستروز، والفوسفات ثنائيوتاسيوم في الماء المقطر.تغطية القارورة مع رقائق الألومنيوم ووضعها في الأوتوكلاف لتعقيم قبل الاستخدام. لإعداد TSA، إضافة أجار إلى TSB ووضعها في الأوتوكلاف للتعقيم. ثم ندعه يبرد إلى درجة حرارة الغرفة.بعد ذلك، صب في طبق بيتري بنسبة 20 ملليلتر لكل طبق. لإعداد بيو فيلم ثقافة المتوسطة، إضافة الجلوكوز إلى TSB autoclaved لتحقيق تركيز 10 غراما للتر الواحد. باستخدام مجموعة الترشيح فراغ، الترشيح الحل مع 0.2 ميكرومتر المسام مرشح الحجم.لتطعيم, استخدام حلقة تطعيم تعقيم لاختيار مستعمرة واحدة الفردية من اريوس Staph من طبق بيتري ووضعها في أنبوب الثقافة مليئة 10 ملليلتر من TSB. وضع أنبوب في الحاضنة لتنمو بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية. مع micropipette، رسم 100 ميكرولترات من ثقافة بين عشية وضحاها ونقلها إلى أنبوب الثقافة مليئة 10 ملليلتر من TSB مع الجلوكوز لتخفيف نسبة 1:100 حجم.دوامة بلطف لخلط لتركيز ثابت. استخدام micropipette لنقل 200 ميكرولترات من الثقافة المخففة في ما مجموعه 18 آبار من لوحة بئر واحدة 96. احتضان لوحة 96 بئر في 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة لتشكيل بيو فيلم.للحصول على أفضل تشكيل بيو فيلم من S.aureus، فمن الأفضل لاختيار شقة أو مستديرة أسفل 96 لوحة جيدا. بعد ذلك ، إمالة قليلا لوحة لdedeant ة من قبل الطموح من حافة كل بئر. غسل كل جيدا مع 1X PBS.وضع لوحة في جهاز الطرد المركزي لتدور لمدة خمس دقائق في 8،000 الثورات في الدقيقة الواحدة وdesant من قبل الطموح. إضافة 75 ميكرولترات من الركيزة ALP المخزن تتكون من PNPP المتاحة تجاريا إلى كل بئر واستخدام جهاز توقيت لتسجيل كل نقطة زمنية في ثلاث ية. بعد كل وقت حضانة، إضافة 75 ميكرولترات من خمسة هيدروكسيد الصوديوم الضرس إلى كل من الآبار الثلاثة لوقف رد الفعل.جهاز طرد مركزي لمدة خمس دقائق في 800 الثورات في الدقيقة. استخدام ماصة لنقل 100 ميكرولترات من السوبر إلى لوحة 96 بئر جديدة لقياس القياسات الحرارية. استخدام قارئ لوحة 96 جيدا لقياس امتصاص كل بئر في 405 نانومتر.استخدم آبار النقطة الزمنية التي تستغرق 30 دقيقة للتحكم في الضوضاء الخلفية. كرر التجربة بأكملها في ثلاث لوحات 96 جيدا. يطور هذا البروتوكول فحصًا سريعًا وموثوقًا لقياس نشاط ALP في S.aureus biofilm الذي لا يتطلب عزلًا للبروتين.تظهر النتيجة التمثيلية لنشاط ALP اتجاهًا متزايدًا لمدة تصل إلى 75 دقيقة. بعد 75 دقيقة، لم يلاحظ أي زيادة في نشاط ALP. من المهم جداً إنشاء ثقافة بيو فيلم جيدة وقد يستغرق الأمر عددًا غير قليل من التجارب لإتقانها.يمكنك تأكيد تشكيل بيو فيلم عن طريق إجراء فحص البنفسج الكريستال كما ذكرت سابقا من قبل لنا والآخرين أو يمكنك قبل علاج لوحة مع البلازما البشرية لتسهيل تشكيل بيو فيلم. بعد تطويره، يمكنك فحص مثبطات ALP المحتملة التي قد تتداخل تكوين بيو فيلم. وستوفر النتيجة معلومات مهمة نحو إدارة الأفلام البيولوجية في المجال الطبي.خمسة صوديوم هيدروكسيد الصوديوم الضرس قد تكون خطرة في حالة الاتصال. تأكد من ارتداء معدات الحماية الشخصية عند التعامل معها.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Colorimetric Analysis of Alkaline Phosphatase Activity in S. aureus Biofilm

Quantification of Global Diastolic Function by Kinematic Modeling-based Analysis of Transmitral Flow via the Parametrized Diastolic Filling Formalism

الكمي لالعالمي الانبساطي وظيفة عن طريق تحليل يستند النمذجة-الحركية من Transmitral التدفق عبر الشكلية ملء Parametrized الانبساطي

Quantitative cardiac function assessment remains a challenge for physiologists and clinicians.&#160;Although historically invasive methods have comprised ...

Protocol for Biofilm Streamer Formation in a Microfluidic Device with Micro-pillars

بروتوكول لتشكيل بيوفيلم الملون في جهاز ميكروفلويديك مع مايكرو الأركان

Several bacterial species possess the ability to attach to surfaces and colonize them in the form of thin films called biofilms. Biofilms that grow in ...

Real-time Visualization and Analysis of Chondrocyte Injury Due to Mechanical Loading in Fully Intact Murine Cartilage Explants

التصور في الوقت الحقيقي وتحليل للإصابة تشوندروسيتي بسبب تحميل الميكانيكية في Explants الغضاريف موريني سليمة تماما

Homeostasis of articular cartilage depends on the viability of resident cells (chondrocytes). Unfortunately, mechanical trauma can induce widespread ...

A Zebrafish Embryo Model for In Vivo Visualization and Intravital Analysis of Biomaterial-associated Staphylococcus aureus Infection

A Zebrafish Embryo Model for In Vivo Visualization and Intravital Analysis of Biomaterial-associated Staphylococcus aureus Infection

نموذج الجنين الزرد بالتصور فيفو و المرتبطة "تحليل إينترافيتال لمادة بيولوجية" المكوّرات العنقودية الذهبية العدوى

Biomaterial-associated infection (BAI) is a major cause of the failure of biomaterials/medical devices. Staphylococcus aureus is one of the major ...

High-resolution Patterned Biofilm Deposition Using pDawn-Ag43

عالي الاستبانة "منقوشة استخدام الترسيب بيوفيلم" بدون-Ag43

Spatial structure and patterning play an important role in bacterial biofilms. Here we demonstrate an accessible method for culturing E. coli biofilms ...

Measuring Global Cellular Matrix Metalloproteinase and Metabolic Activity in 3D Hydrogels

قياس أية مصفوفة الخلوية العالمية والنشاط الأيضي في الهلاميات المائية 3D

Three-dimensional (3D) cell culture systems often more closely recapitulate in vivo cellular responses and functions than traditional two-dimensional (2D) ...

Home-Based Monitor for Gait and Activity Analysis

جهاز مراقبة منزلي لتحليل مشية والنشاط

Current outcomes in neuromuscular disorder clinical trials include motor function scales, timed tests, and strength measures performed by trained clinical ...

Substructure Analyzer: A User-Friendly Workflow for Rapid Exploration and Accurate Analysis of Cellular Bodies in Fluorescence Microscopy Images

محلل البنية الفرعية: سير عمل سهل الاستخدام للاستكشاف السريع والتحليل الدقيق للأجسام الخلوية في صور المجهر الفلوري

The last decade has been characterized by breakthroughs in fluorescence microscopy techniques illustrated by spatial resolution improvement but also in ...

Electric and Magnetic Field Devices for Stimulation of Biological Tissues

أجهزة المجال الكهربائي والمغناطيسي لتحفيز الأنسجة البيولوجية

Electric fields (EFs) and magnetic fields (MFs) have been widely used by tissue engineering to improve cell dynamics such as proliferation, migration, ...