Name: colorimetric analysis of alkaline phosphatase activity in s. aureus biofilm
Uploaded: 2019-04-12T15:00:00
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Nous remercions William Rainey Harper College et l’Université de l’Illinois à Chicago pour l’installation de procéder à ces expériences. Nous remercions également McGraw Hill Foundation pour leur soutien généreux.

1. préparation moyenne
<ol><li>Préparer 1 L de bouillon de soja tryptique (BST) : dans 1 L d’eau distillée, ajouter 15 g de hydrolysât de caséine, 5 g de papaique de farine de soja, 3 g de chlorure de sodium, 2,5 g de dextrose et 2,5 g de phosphate dipotassique. Stériliser avant usage.</li>
	<li>Pour Trypticase Soy Agar (TSA), ajouter 15 g d’agar à 1 L de TSB, autoclave. Puis laissez-le refroidir à température ambiante. Ensuite, verser à un ratio de 20 mL par boîte de pétri (100 x 15 mm).</li>
	<li>Mil...

<ol>
	<li>Coleman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+mechanism+of+alkaline+phosphatase.">Structure and mechanism of alkaline phosphatase.</a> Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 21, 441-483 (1992).</li><li>Sharma, U., Pal, D., Prasad, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alkaline+Phosphatase:+An+Overview.">Alkaline Phosphatase: An Overview.</a> Indian Journal of Clinical Biochemistry. 29 (3), 269-278 (2014).</li><li>Mitchell, M. 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C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biofilms:+an+emergent+form+of+bacterial+life.">Biofilms: an emergent form of bacterial life.</a> Nature Reviews Microbiology. 14, 563-575 (2016).</li><li>Hoiby, N., Bjarnsholt, T., Givskov, M., Molin, S., Ciofu, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibiotic+resistance+of+bacterial+biofilms.">Antibiotic resistance of bacterial biofilms.</a> International Journal of Antimicrobial Agents. 35, 322-332 (2010).</li><li>Ito, A., Taniuchi, A., May, T., Kawata, K., Okabe, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+antibiotic+resistance+of+Escherichia+coli+in+mature+biofilms.">Increased antibiotic resistance of Escherichia coli in mature biofilms.</a> Applied and Environmental Microbiology. 75, 4093-4100 (2009).</li><li>Witherow, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Ten-Week+Biochemistry+Lab+Project+Studying+Wild-Type+and+Mutant+Bacterial+Alkaline+Phosphatase.">A Ten-Week Biochemistry Lab Project Studying Wild-Type and Mutant Bacterial Alkaline Phosphatase.</a> Biochemistry and Molecular Biology Education. 44 (6), (2016).</li><li>Henthorn, P., Zervos, P., Raducha, M., Harris, H., Kadesch, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+a+human+placental+alkaline+phosphatase+gene+in+transfected+cells:+Use+as+a+reporter+for+studies+of+gene+expression.">Expression of a human placental alkaline phosphatase gene in transfected cells: Use as a reporter for studies of gene expression.</a> Proceedings of the National Academy of Science USA. 85, 6324-6346 (1988).</li><li>Horney, B. 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W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+Characterization+of+Extracellular+Alkaline+Phosphatase+from+an+Alkalophilic+Bacterium.">Purification and Characterization of Extracellular Alkaline Phosphatase from an Alkalophilic Bacterium.</a> Agricultural and Biological Chemistry. 52 (7), 1643-1647 (1988).</li></ol>

Dans notre test, nous avons utilisé des pNPP comme le substrat de l’ALP. Il s’agit d’une solution de travail conçue pour ELISA et aucune dilution n’est nécessaire. Après hydrolyse par ALP, un produit jaune se développe et peut être mesuré à 405 nm. À la fin de la réaction enzymatique, nous avons brièvement centrifugé la plaque 96 puits et transféré le surnageant sur une plaque bien 96 fraîches pour mesurer l’absorbance à l’aide du lecteur de plaques. Nous avons constaté que cette étape suppl...

Phosphatase alcaline (ALP) est partout exprimée dans les deux cellules procaryotes et eucaryotes1. Il peut catalyser l’hydrolyse de monophosphate de différentes molécules telles que les nucléotides, les protéines, les alcaloïdes, les esters de phosphate et anhydrides d’acide phosphorique. Chez l’homme, ALP eucaryote est présent dans de nombreux tissus, y compris le foie, les os, les intestins et placenta2. Il joue un rôle important dans la phosphorylation des protéines, la croissance cellulaire, l’apoptose, cellules souches processus ainsi que la minéralisation squelettique normale. ALP eucaryote est également un indicateur clé de sérum pour la présence de maladies dans les os, le foie et autres tissus/organes lorsque élevé3,4.
Procaryote ALP a été détectée dans une variété de cellules bactériennes, y compris e. coli5,6,de S. aureus7 et certaines bactéries du rumen commune dans les sols8. L’activité bactérienne ALP a été utilisée comme un biocapteur dans la détection des pesticides, métaux lourds,9 et10de la contamination bactérienne. L’expression constitutive de l’ALP a été utilisée pour identifier des staphylocoques11 et pour différencier Serratia Enterobacter12. Il est également suggéré que constitutive production ALP est corrélée à la pathogénicité à staphylocoques13. Bien que l’ALP a été étudiée dans différents contextes3,4, encore peu est inédite pour son activité et sa fonction dans les cultures de biofilms.
Un biofilm a été documenté pour avoir une vie bactérienne fonctionne différemment par rapport à son homologue de cellule bactérienne libres14. Chez S. aureus, la formation de biofilm a été identifiée dans une variété de conditions cliniques et représente la résistance aux antibiotique et l’inflammation chronique15,16. De nombreuses molécules avaient été signalés dans une matrice de biofilm tels que les polysaccharides, protéines, acides nucléiques et les lipides, mais le mécanisme de formation de biofilm n’est pas entièrement compris14. Pour comprendre le rôle de l’ALP dans la formation de biofilm, nous cultivées biofilms de Staphylococcus aureus dans les plaques de 96 puits de culture tissulaire et mesuré l’activité ALP à l’aide de para-nitrophénylphosphate (pNPP).
La molécule pNPP est un substrat prêt à l’emploi pour ALP et a été largement utilisé pour mesurer l’activité ALP6,17,18. Ce dosage colorimétrique est basé sur la conversion de para-nitrophényl phosphate (pNPP) en para-nitrophénol aboutissant à un produit coloré à 405 nm. Par rapport aux autre essai ALP classique, tels que l’agarose gel électrophorèse19, précipitations agglutinine (WGA) de germe de blé, et WGA-HPLC20, ce test est très spécifique, sensible, facile à reproduire et la plupart important, permet pour la grande débit.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>VWR</td>
			<td>9002-18-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Centrifuge</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>5810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gluose</td>
			<td>VWR</td>
			<td>50-99-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH pellets</td>
			<td>VWR</td>
			<td>SS0550-500GR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Para-nitrophenylphosphate (pNPP)&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7998-100ML</td>
			<td>Typical concentrations of pNPP liquid substrates, often used in enzyme-linked immunesorbent assays (ELISA), range between 10 to 50 mM. Similar to most ready-to-use pNPP liquid substrates like the one used here, the exact pNPP concentration is not disclosed due to its proprietary nature.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X PBS, pH7.4. 
			173 mM NaCl, 
			2.7 mM KCl, 
			8 mM Na2HPO4, 
			2 mM KH2PO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P3288-1VL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate Reader</td>
			<td>Biotek</td>
			<td>ELx808</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S. aureus</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>ATCC25923</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptic Soy Agar&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 15g / L TSB</td>
			<td>VWR</td>
			<td>9002-18-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptic Soy Broth:&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; g/L 
			Pancreatic Digest of Casein............ 15.0 
			Papaic Digest of Soyben Meal.........5.00 
			Sodium chloride.............................. 3.00 
			Dextrose........................................&#160; 2.50 
			Dipotassium phosphate..................2.50</td>
			<td>VWR</td>
			<td>90006-098</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well tissue culture plates</td>
			<td>BD</td>
			<td>6902D09</td>
			<td>U shaped bottom</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

colorimetric analysis of alkaline phosphatase activity in s. aureus biofilm

Phosphatase alcaline (ALP) est une enzyme commune exprimée dans les cellules procaryotes et eucaryotes. Elle catalyse l’hydrolyse des monoesters de phosphate de nombreuses molécules à pH basique et joue un rôle indispensable dans le métabolisme du phosphate. Chez l’homme, ALP eucaryote est l’un des signaux enzymatiques le plus souvent utilisés dans le diagnostic des maladies diverses, telles que la cholestase et le rachitisme. Dans S. aureus, ALP est détectée exclusivement sur la membrane cellulaire ; Elle est également exprimée en une forme sécrétoire ainsi. Pourtant, on connaît mal son rôle dans la formation de biofilm.
Le but de ce manuscrit est de développer un test rapide et fiable pour mesurer l’activité ALP en biofilm de S. aureus ne nécessitant pas l’isolement de la protéine. À l’aide de p-nitrophényl phosphate (pNPP) comme substrat, nous avons mesuré l’activité ALP dans S. aureus biofilm formé en plaques 96 puits vitroplants. L’activité était basée sur la formation du produit soluble réaction mesurée par 405 absorbance nm. La nature à haut rendement de la méthode de plaque 96 puits vitroplants fournit une méthode sensible et reproductible pour les tests d’activité ALP. Les mêmes expérimental mis en place peuvent être étendus pour mesurer les autres extracellulaires marqueurs moléculaires associés à la formation de biofilm.

Figure 1 montre un résultat représentatif de l’activité ALP de biofilm cultures de S. aureus en plaques de 96 puits de culture tissulaire. 75 μl de solution de pNPP disponibles dans le commerce a été ajouté à chaque puits et incubé à température ambiante. Après une incubation de différentes époques (0 min, 15 min, 30 min, 45 min, 60 min et 75 min, respectivement) 75 μL de 5 M NaOH a été ajouté pour arrêter la réaction. Le produi...

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Colorimetric Analysis of Alkaline Phosphatase Activity in S. aureus Biofilm

Dans ce manuscrit, nous avons mis en place une méthode de haut débit afin de quantifier l’activité de la phosphatase alcaline dans la culture de biofilm de S. aureus de plaque 96 puits vitroplants

Analyse colorimétrique d’activité Phosphatase alcaline dans le Biofilm de S. aureus

Alkaline phosphatase (ALP) is a common enzyme expressed in both prokaryotic and eukaryotic cells. It catalyzes the hydrolysis of phosphate monoesters from ...

Ce protocole a présenté une méthode facile et fiable pour mesurer l’activité alcalinisée de phosphatase dans la culture de biofilm de S.aureus. Il nous aidera à comprendre la fonction d’ALP dans la formation de biofilms. Le principal avantage de cette technique est le débit élevé.Il est très sensible et facile à exécuter. Kevin Danikowski, un ancien élève du Harper College, démontrera la procédure. Pour préparer le BST, ajouter le digest pancréatique de la caséine, la digestion papaique de la farine de soja, le chlorure de sodium, le dextrose et le phosphate de dipotassium dans l’eau distillée.Couvrir le flacon de papier d’aluminium et le mettre dans un autoclave pour stériliser avant utilisation. Pour préparer une TSA, ajouter une agar au BST et la mettre dans l’autoclave pour la stérilisation. Ensuite, laissez-le refroidir à température ambiante.Ensuite, versez-le dans la boîte de Pétri à un rapport de 20 millilitres par plat. Pour préparer un milieu de culture biofilm, ajouter du glucose au BST autoclavé pour atteindre la concentration de 10 grammes par litre. À l’aide d’un kit de filtration sous vide, filtrer la solution à l’aide d’un filtre de la taille d’un pore de 0,2 micromètre.Pour inoculer, utilisez une boucle d’inoculation stérilisée pour choisir une colonie individuelle de Staphylocoque dans la boîte de Pétri et la placer dans le tube de culture rempli de 10 millilitres de BST. Mettez le tube dans l’incubateur pour croître pendant la nuit à 37 degrés Celsius. Avec une micropipette, dessiner 100 microlitres de la culture du jour au lendemain et le transférer dans un tube de culture rempli de 10 millilitres de BST avec du glucose pour une dilution de ratio de volume de 1:100.Vortex doucement pour mélanger pour une concentration constante. Utilisez une micropipette pour transférer 200 microlitres de culture diluée dans un total de 18 puits à partir d’une plaque de puits de 96. Incuber la plaque de puits 96 à 37 degrés Celsius pendant 24 heures pour la formation de biofilms.Pour la meilleure formation de biofilm de S.aureus, il est préférable de choisir une plaque de puits à fond plat ou rond 96. Après cela, inclinez légèrement la plaque pour décanter le surnatant par aspiration du bord de chaque puits. Lavez-les bien avec 1X PBS.Mettez la plaque dans la centrifugeuse pour tourner pendant cinq minutes à 8000 tours par minute et décanter le supernatant par aspiration. Ajouter 75 microlitres de substrat ALP tamponné composé de PNPP disponible dans le commerce à chaque puits et utiliser une mise à jour pour enregistrer chaque point de temps en triplicate. Après chaque point de temps d’incubation, ajouter 75 microlitres de cinq hydroxyde de sodium molaire à chacun des trois puits pour arrêter la réaction.Centrifuger la plaque pendant cinq minutes à 800 révolutions par minute. Utilisez une pipette pour transférer 100 microlitres de supernatant dans une nouvelle plaque de puits 96 pour la mesure calorimétrique. Utilisez un lecteur de plaques de puits de 96 puits pour mesurer l’absorption de chaque puits à 405 nanomètres.Utilisez les puits de point de temps de 30 minutes pour contrôler le bruit de fond. Répétez l’expérience dans trois plaques de puits 96. Ce protocole développe un essai rapide et fiable pour mesurer l’activité d’ALP dans le biofilm de S.aureus qui ne nécessite pas l’isolement de protéine.Le résultat représentatif de l’activité ALP montre une tendance accrue jusqu’à 75 minutes. Après 75 minutes, aucune augmentation de l’activité d’ALP n’a été observée. Il est très important d’établir une bonne culture biofilm et il peut prendre pas mal d’essais à maîtriser.Vous pouvez confirmer la formation de biofilms en effectuant l’analyse de violette cristalline comme précédemment rapporté par nous et d’autres ou vous pouvez pré-traiter la plaque avec du plasma humain pour faciliter la formation de biofilms. Après son développement, vous pouvez dépister les inhibiteurs potentiels de l’ALP qui pourraient interférer avec la formation de biofilms. Le résultat fournira des informations importantes sur la gestion des biofilms dans le domaine médical.Cinq hydroxyde de sodium molaire peuvent être dangereux en cas de contact. Assurez-vous de porter de l’équipement de protection individuelle lors de la manipulation.

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