Name: colorimetric analysis of alkaline phosphatase activity in s. aureus biofilm
Uploaded: 2019-04-12T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Colorimetric Analysis of Alkaline Phosphatase Activity in S. aureus Biofilm at JoVE.com

אנו מודים ויליאם רייני הארפר המכללה, אוניברסיטת אילינוי בשיקגו במתקן לערוך ניסויים אלה. אנו מודים גם היסוד מקגרו היל על תמיכתם הנדיבה.

1. הכנה בינונית
<ol><li>להכנת 1 ליטר של ציר סויה Tryptic (TSB): לתוך 1 L של מים מזוקקים, להוסיף 15 גרם של הלבלב תקציר של קזאין, 5 גר' papaic תקציר של ארוחה סויה, דור 3 של נתרן כלורי, 2.5 גר' דקסטרוז ו- 2.5 גר' dipotassium פוספט. לעקר לפני השימוש.</li>
	<li>עבור Tryptic סויה אגר (TSA), להוסיף 15 גרם של אגר 1 ליטר של TSB, החיטוי. אז תן לזה לה...

<ol>
	<li>Coleman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+mechanism+of+alkaline+phosphatase.">Structure and mechanism of alkaline phosphatase.</a> Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 21, 441-483 (1992).</li><li>Sharma, U., Pal, D., Prasad, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alkaline+Phosphatase:+An+Overview.">Alkaline Phosphatase: An Overview.</a> Indian Journal of Clinical Biochemistry. 29 (3), 269-278 (2014).</li><li>Mitchell, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+frequencies+of+elevated+alkaline+phosphatase+activity+and+rickets+exist+in+extremely+low+birth+weight+infants+despite+current+nutritional+support.">High frequencies of elevated alkaline phosphatase activity and rickets exist in extremely low birth weight infants despite current nutritional support.</a> Boston Medical Center Pediatrics. 9, 47 (2009).</li><li>Fawley, J., Gourlay, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+alkaline+phosphatase:+A+summary+of+its+role+in+clinical+disease.">Intestinal alkaline phosphatase: A summary of its role in clinical disease.</a> Journal of Surgical Research. 202 (1), 225-234 (2016).</li><li>Derman, A. I., Beckwith, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Escherichia+coli+Alkaline+Phosphatase+Localized+to+the+Cytoplasm+Slowly+Acquires+Enzymatic+Activity+in+Cells+Whose+Growth+Has+Been+Suspended:+a+Caution+for+Gene+Fusion+Studies.">Escherichia coli Alkaline Phosphatase Localized to the Cytoplasm Slowly Acquires Enzymatic Activity in Cells Whose Growth Has Been Suspended: a Caution for Gene Fusion Studies.</a> Journal of Bacteriology. 177 (13), 3764-3770 (1995).</li><li>Danikowski, K. M., Cheng, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alkaline+Phosphatase+Activity+of+Staphylococcus+aureus+grown+in+Biofilm+and+Suspension+Cultures.">Alkaline Phosphatase Activity of Staphylococcus aureus grown in Biofilm and Suspension Cultures.</a> Current Microbiology. 75, 1226-1230 (2018).</li><li>Okabayashi, K., Futai, M., Mizuno, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+of+Acid+and+Alkaline+Phosphatases+in+Staphylococcus+aureus.">Localization of Acid and Alkaline Phosphatases in Staphylococcus aureus.</a> Japanese Journal of Microbiology. 18 (4), 287-294 (1974).</li><li>Cheng, K. J., Costerton, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alkaline+Phosphatase+Activity+of+Rumen+Bacteria.">Alkaline Phosphatase Activity of Rumen Bacteria.</a> Applied and Environmental Microbiology. , 586-590 (1997).</li><li>Berezhetskyy, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphatase+conductometric+biosensor+for+heavy-metal+ions+determination.">Phosphatase conductometric biosensor for heavy-metal ions determination.</a> Innovation and Research in Biomedical Engineering. 29 (2-3), 136-140 (2008).</li><li>Park, E. J., Kang, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+bacterial+alkaline+phosphatase+assay+for+rapid+monitoring+of+bacterial+counts+on+spinach.">The use of bacterial alkaline phosphatase assay for rapid monitoring of bacterial counts on spinach.</a> Journal of Food Science. 73 (5), M236-M238 (2008).</li><li>Barber, M., Kuper, S. W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+Staphylococcus+pyogenes+by+the+phosphatase+reaction.">Identification of Staphylococcus pyogenes by the phosphatase reaction.</a> The Journal of Pathology and Bacteriology. 63, 65-68 (1951).</li><li>Wolf, P. L., Von der Muehll, E., Ludwick, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+test+to+differentiate+Serratia+from+Enterobacter.">A new test to differentiate Serratia from Enterobacter.</a> American Journal of Clinical Pathology. 56, 241-243 (1972).</li><li>Rangam, C. M., Katdare, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphatase+activity+of+Staphylococci+as+an+indication+of+their+pathogenicity.">Phosphatase activity of Staphylococci as an indication of their pathogenicity.</a> Indian Journal of Medical Science. 8, 610-613 (1954).</li><li>Flemming, H. -. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biofilms:+an+emergent+form+of+bacterial+life.">Biofilms: an emergent form of bacterial life.</a> Nature Reviews Microbiology. 14, 563-575 (2016).</li><li>Hoiby, N., Bjarnsholt, T., Givskov, M., Molin, S., Ciofu, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibiotic+resistance+of+bacterial+biofilms.">Antibiotic resistance of bacterial biofilms.</a> International Journal of Antimicrobial Agents. 35, 322-332 (2010).</li><li>Ito, A., Taniuchi, A., May, T., Kawata, K., Okabe, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+antibiotic+resistance+of+Escherichia+coli+in+mature+biofilms.">Increased antibiotic resistance of Escherichia coli in mature biofilms.</a> Applied and Environmental Microbiology. 75, 4093-4100 (2009).</li><li>Witherow, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Ten-Week+Biochemistry+Lab+Project+Studying+Wild-Type+and+Mutant+Bacterial+Alkaline+Phosphatase.">A Ten-Week Biochemistry Lab Project Studying Wild-Type and Mutant Bacterial Alkaline Phosphatase.</a> Biochemistry and Molecular Biology Education. 44 (6), (2016).</li><li>Henthorn, P., Zervos, P., Raducha, M., Harris, H., Kadesch, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+a+human+placental+alkaline+phosphatase+gene+in+transfected+cells:+Use+as+a+reporter+for+studies+of+gene+expression.">Expression of a human placental alkaline phosphatase gene in transfected cells: Use as a reporter for studies of gene expression.</a> Proceedings of the National Academy of Science USA. 85, 6324-6346 (1988).</li><li>Horney, B. S., Farmer, A. J., Honor, D. J., MacKenzie, A., Burton, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agarose+gel+electrophoresis+of+alkaline+phosphatase+isoenzymes+in+the+serum+of+hyperthyroid+cats.">Agarose gel electrophoresis of alkaline phosphatase isoenzymes in the serum of hyperthyroid cats.</a> Veterinary Clinical Pathology. 23 (3), 98-102 (1994).</li><li>Farley, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+Skeletal+Alkaline+Phosphatase+in+Osteoporotic+Serum+by+Wheat+Germ+Agglutinin+Precipitation,+Heat+Inactivation,+and+a+Two-Site+Immunoradiometric+Assay.">Quantification of Skeletal Alkaline Phosphatase in Osteoporotic Serum by Wheat Germ Agglutinin Precipitation, Heat Inactivation, and a Two-Site Immunoradiometric Assay.</a> Clinical Chemistry. 40 (9), 1749-1756 (1994).</li><li>O&#8217;Toole, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtiter+Dish+Biofilm+Formation+Assay.">Microtiter Dish Biofilm Formation Assay.</a> Journal of Visualized Experience. , (2011).</li><li>Nomoto, M., Ohsawa, M., Wang, H. L., Chen, C. C., Yeh, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+Characterization+of+Extracellular+Alkaline+Phosphatase+from+an+Alkalophilic+Bacterium.">Purification and Characterization of Extracellular Alkaline Phosphatase from an Alkalophilic Bacterium.</a> Agricultural and Biological Chemistry. 52 (7), 1643-1647 (1988).</li></ol>

ב- assay שלנו, השתמשנו pNPP כמו המצע אלפ. זהו הפתרון עובד המיועד אליסה, דילול לא נדרש. לאחר הידרוליזה על ידי ALP, מוצר צהוב מפתחת, ניתן למדוד-405 ננומטר. בסוף התגובה אנזימטיות, אנו בקצרה centrifuged את הצלחת היטב 96, להעביר את תגובת שיקוע צלחת טריים טוב 96 כדי למדוד את ספיגת באמצעות קורא צלחת. מצאנו כי צנטריפו...

אלקליין פוספטאז (ALP) מתבטא ubiquitously בשני תאי האיקריוטים prokaryotic ו-1. זה יכול לעודד את הידרוליזה של monophosphate של מולקולות שונות כגון נוקלאוטידים, חלבונים, אלקלואידים, אסטרים פוספט ו- anhydrides של חומצה זרחתית. בבני אדם, ALP האיקריוטים קיים ברקמות רבות, כולל הכבד, עצם, המעי ו השליה2. זה משחק תפקידים חשובים זירחון חלבונים, צמיחת תאים, אפופטוזיס, תהליכים בתאי גזע, כמו גם מינרליזציה השלד נורמלי. ALP האיקריוטים הוא גם מחוון מפתח נסיוב לנוכחות של מחלות עצם, כבד, ובאיברים אחרים רקמות/כאשר מוגבה3,4.
Prokaryotic ALP זוהתה במגוון של תאים חיידקיים, כולל e. coli5,6, S. aureus7 וכמה חיידקים שכיחים של כרס מעלי גרה קרקעות8. פעילות ALP חיידקי שימשה ביוסנסור זיהוי חומרי הדברה, מתכות כבדות9 ו זיהום בקטריאלי10. הביטוי המכונן של ALP שימש כדי לזהות Staphylococci11 וכדי להבדיל בסרישיה Enterobacter12. בהמשך הוא הציע כי ייצור ALP המכונן הוא מתואם עם פתוגניות staphylococci13. למרות ALP נחקרה הגדרות שונות3,4, עדיין מעט הוא דיווח על הפעילות שלה פונקציה בתרבויות biofilms.
ממבנה biofilm תועד חיים חיידקי מתפקדת באופן שונה לעומת שלו עמיתו של תא החיידק אל-אווירני עצמאי14. ב- S. aureus, היווצרות biofilm זוהתה במגוון תנאים קליניים וחשבונות עמידות לאנטיביוטיקה, דלקת כרונית15,16. דווח כי הרבה מולקולות להימצא במטריצה biofilm כגון סוכרים, חלבונים, חומצות גרעין, ליפידים, אך המנגנון של ביופילמים אינו מובן במלואו14. כדי להבין את התפקיד של ALP ב ביופילמים, אנו תרבותי S. aureus biofilms ב 96 תרביות רקמה טוב צלחות, מדדו את הפעילות ALP באמצעות פארא-nitrophenylphosphate (pNPP).
כבר בשימוש נרחב כדי למדוד ALP פעילות6,17,18, והיא מצע מוכן לשימוש עבור ALP pNPP המולקולה. זה וזמינותו ערכי צבע מוחלטים המבוסס על ההמרה של פוספט פארא-nitrophenyl (pNPP) כדי פארא-nitrophenol וכתוצאה מכך מוצר צבעוניים-405 ננומטר. לעומת אחרים assay ALP קונבנציונליים, כגון agarose ג'ל אלקטרופורזה19, משקעים agglutinin (WGA) נבט חיטה, WGA-HPLC20, וזמינותו הזה הוא מאוד ספציפי, רגיש, קל, והם הכי חשוב, מאפשר גבוהה תפוקה.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>VWR</td>
			<td>9002-18-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Centrifuge</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>5810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gluose</td>
			<td>VWR</td>
			<td>50-99-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH pellets</td>
			<td>VWR</td>
			<td>SS0550-500GR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Para-nitrophenylphosphate (pNPP)&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7998-100ML</td>
			<td>Typical concentrations of pNPP liquid substrates, often used in enzyme-linked immunesorbent assays (ELISA), range between 10 to 50 mM. Similar to most ready-to-use pNPP liquid substrates like the one used here, the exact pNPP concentration is not disclosed due to its proprietary nature.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X PBS, pH7.4. 
			173 mM NaCl, 
			2.7 mM KCl, 
			8 mM Na2HPO4, 
			2 mM KH2PO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P3288-1VL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate Reader</td>
			<td>Biotek</td>
			<td>ELx808</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S. aureus</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>ATCC25923</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptic Soy Agar&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 15g / L TSB</td>
			<td>VWR</td>
			<td>9002-18-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptic Soy Broth:&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; g/L 
			Pancreatic Digest of Casein............ 15.0 
			Papaic Digest of Soyben Meal.........5.00 
			Sodium chloride.............................. 3.00 
			Dextrose........................................&#160; 2.50 
			Dipotassium phosphate..................2.50</td>
			<td>VWR</td>
			<td>90006-098</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well tissue culture plates</td>
			<td>BD</td>
			<td>6902D09</td>
			<td>U shaped bottom</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

colorimetric analysis of alkaline phosphatase activity in s. aureus biofilm

אלקליין פוספטאז (ALP) הוא אנזים נפוצות הביע בתאים prokaryotic והן האיקריוטים. זה ה מזרז הידרוליזה של פוספט monoesters של מולקולות רבות ב- pH בסיסי והוא ממלא תפקיד חיוני בחילוף החומרים פוספט. בבני אדם, ALP האיקריוטים הוא אחד האותות אנזימטי שנמצאות בשימוש תכוף ביותר באבחון מחלות שונות, כגון לחסימת מרה תוך כבדית, רככת. ב- S. aureus, ALP מזוהה באופן בלעדי על קרום התא; זה מתבטא גם כטופס הפרשה גם כן. ובכל זאת, מעט מאוד ידוע על תפקודו של ביופילמים.
מטרתו של כתב יד זה היא לפתח וזמינותו מהיר ואמין למדידת פעילות ALP biofilm S. aureus שאינה דורשת בידוד חלבון. באמצעות פוספט p-nitrophenyl (pNPP) כמו מצע, מדדנו פעילות ALP biofilm S. aureus שהוקמה בשנת 96-ובכן תרביות רקמה צלחות. הפעילות מבוססת על היווצרות של המוצר מסיסים התגובה נמדד על ידי ספיגת 405 ננומטר. מהות השיטה צלחת 96 תרביות רקמה טוב תפוקה גבוהה מספק שיטה לשחזור והרגיש ALP פעילות מבחני. ניתן להאריך אותו הדבר הניסיונית להגדיר גם למדוד סמנים מולקולריים חוץ-תאית אחרים הקשורים ביופילמים.

איור 1 מציג תוצאה נציג של ALP פעילות מתרבויות biofilm של S. aureus 96 צלחות טוב תרביות רקמה. 75 μL של פתרון זמין מסחרית pNPP נוספה כל טוב, מודגרות בטמפרטורת החדר. לאחר דגירה לזמנים שונים (מינימום 0, 15 דקות, 30 דקות, 45 min, 60 דקות ו- 75 דקות, בהתאמה) μL 75 של 5 M NaOH נוספה כדי לעצור ...

Watch this Scientific Journal Video about Colorimetric Analysis of Alkaline Phosphatase Activity in S. aureus Biofilm at JoVE.com

Colorimetric Analysis of Alkaline Phosphatase Activity in S. aureus Biofilm

כתב יד זה, הקמנו שיטה תפוקה גבוהה לכמת פעילות פוספטאז אלקליין בתרבות biofilm S. aureus באמצעות גלופה תרביות רקמה 96-ובכן

ערכי צבע מוחלטים ניתוח אלקליין פוספטאז פעילות ב- S. aureus Biofilm

Alkaline phosphatase (ALP) is a common enzyme expressed in both prokaryotic and eukaryotic cells. It catalyzes the hydrolysis of phosphate monoesters from ...

פרוטוקול זה הציג שיטה קלה ואמינה למדידת פעילות פוספטזה אלקלים בתרבות הביופילם של S.aureus. זה יעזור לנו להבין את הפונקציה של ALP בהיווצרות ביופילם. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא תפוקה גבוהה.זה מאוד רגיש וקל לביצוע. הפגנת ההליך תהיה קווין דניקובסקי, סטודנט לשעבר ממג' הארפר. כדי להכין TSB, להוסיף תקציר הלבלב של קזין, עיכול פפאי של ארוחת סויה, נתרן כלורי, דקסטרוז, דיפוטאסיום פוספט לתוך מים מזוקקים.מכסים את הבקבוק בנייר אלומיניום ומכניסים אותו לתקלה אוטומטית כדי לעקר לפני השימוש. כדי להכין TSA, להוסיף אגר TSB ולשים אותו autoclave עבור עיקור. ואז לתת לו להתקרר לטמפרטורת החדר.לאחר מכן, יוצקים אותו לתוך צלחת פטרי ביחס של 20 מיליליטר למנה. כדי להכין מדיום תרבות ביופילם, להוסיף גלוקוז TSB autoclaved כדי להשיג את הריכוז של 10 גרם לליטר. בעזרת ערכת סינון ואקום, מסננים את הפתרון באמצעות מסנן בגודל נקבוביות בגודל 0.2 מיקרומטר.כדי לחסן, להשתמש בלולאת חיסון מעוקרת כדי לבחור מושבה בודדת אחת של Aureus Staph מצלחת פטרי ולמקם אותו בצינור התרבות מלא 10 מיליליטר של TSB. שים את הצינור באינקובטור לגדול לילה ב 37 מעלות צלזיוס. עם micropipette, לצייר 100 microliters של תרבות הלילה ולהעביר אותו צינור תרבות מלא 10 מיליליטר של TSB עם גלוקוז עבור דילול יחס נפח 1:100.מערבולת בעדינות לערבב לריכוז עקבי. השתמש micropipette להעביר 200 microliters של תרבות מדוללת לתוך סך של 18 בארות מצלחת אחת 96 באר. דגירה צלחת 96 גם ב 37 מעלות צלזיוס במשך 24 שעות עבור היווצרות ביופילם.עבור היווצרות biofilm הטוב ביותר של S.aureus, עדיף לבחור שטוח או עגול התחתון 96 צלחת היטב. לאחר מכן, להטות מעט את הצלחת כדי decant supernatant על ידי שאיפה מקצה כל באר. לשטוף כל באר עם 1X PBS.שים את הצלחת בצנטריפוגה להסתובב במשך חמש דקות ב 8, 000 מהפכות לדקה ולפענח את העל טבעי על ידי שאיפה. הוסף 75 מיקרוליטרים של מצע ALP במאגר המורכב PNPP זמין מסחרית לכל באר ולהשתמש טיימר כדי להקליט כל נקודת זמן ב- triplicate. לאחר כל נקודת זמן דגירה, להוסיף 75 microliters של חמישה נתרן הידרוקסיד טוחן לכל אחת משלוש בארות כדי לעצור את התגובה.צנטריפוגה הצלחת במשך חמש דקות ב 800 מהפכות לדקה. השתמש פיפטה להעביר 100 microliters של על טבעי לתוך צלחת באר 96 חדש למדידה קלורימטרית. השתמש בקורא 96 צלחות היטב כדי למדוד את הספיגה של כל באר ב 405 ננומטר.השתמשו בארות נקודת הזמן של 30 דקות כדי לשלוט ברעשי רקע. חזור על הניסוי כולו בשלוש 96 צלחות באר. פרוטוקול זה מפתחת תדהמה מהירה ואמינה למדידת פעילות ALP בביופילם S.aureus שאינו דורש בידוד חלבונים.התוצאה הייצוגית של פעילות ALP מראה מגמה מוגברת של עד 75 דקות. לאחר 75 דקות, לא נצפתה עלייה בפעילות ALP. חשוב מאוד להקים תרבות ביופילם טובה וזה עלול לקחת לא מעט ניסויים כדי לשלוט.אתה יכול לאשר היווצרות ביופילם על ידי ביצוע בדיקת קריסטל סגול כפי שדווח בעבר על ידינו ואחרים או שאתה יכול מראש לטפל בצלחת עם פלזמה אנושית כדי להקל על היווצרות ביופילם. לאחר התפתחותו, אתה יכול לסנן מעכבי ALP פוטנציאליים שעלולים להפריע היווצרות biofilm. התוצאה תספק מידע חשוב לניהול ביופילם בתחום הרפואי.חמישה נתרן הידרוקסיד דיוח עלול להיות מסוכן במקרה של מגע. הקפד ללבוש ציוד מגן אישי בעת הטיפול.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Colorimetric Analysis of Alkaline Phosphatase Activity in S. aureus Biofilm

Quantification of Global Diastolic Function by Kinematic Modeling-based Analysis of Transmitral Flow via the Parametrized Diastolic Filling Formalism

כימות של פונקציה הגלובלית הדיאסטולי על ידי ניתוח המבוסס על דוגמנות Kinematic של Transmitral זרימה באמצעות הפורמליזם מילוי Parametrized הדיאסטולי

Quantitative cardiac function assessment remains a challenge for physiologists and clinicians.&#160;Although historically invasive methods have comprised ...

Protocol for Biofilm Streamer Formation in a Microfluidic Device with Micro-pillars

פרוטוקול ליצירת biofilm Streamer במכשיר microfluidic עם מיקרו עמודים

Several bacterial species possess the ability to attach to surfaces and colonize them in the form of thin films called biofilms. Biofilms that grow in ...

Real-time Visualization and Analysis of Chondrocyte Injury Due to Mechanical Loading in Fully Intact Murine Cartilage Explants

ויזואליזציה בזמן אמת וניתוח Chondrocyte לפציעה בגלל העמסה מכנית ב Explants הסחוס מאתר באופן מלא ללא פגע

Homeostasis of articular cartilage depends on the viability of resident cells (chondrocytes). Unfortunately, mechanical trauma can induce widespread ...

A Zebrafish Embryo Model for In Vivo Visualization and Intravital Analysis of Biomaterial-associated Staphylococcus aureus Infection

A Zebrafish Embryo Model for In Vivo Visualization and Intravital Analysis of Biomaterial-associated Staphylococcus aureus Infection

מודל העובר דג זברה, ויזואליזציה Vivo, ניתוח Intravital של Biomaterial-הקשורים Staphylococcus aureus זיהום

Biomaterial-associated infection (BAI) is a major cause of the failure of biomaterials/medical devices. Staphylococcus aureus is one of the major ...

High-resolution Patterned Biofilm Deposition Using pDawn-Ag43

ברזולוציה גבוהה בדוגמת באמצעות התצהיר Biofilm pDawn-Ag43

Spatial structure and patterning play an important role in bacterial biofilms. Here we demonstrate an accessible method for culturing E. coli biofilms ...

Measuring Global Cellular Matrix Metalloproteinase and Metabolic Activity in 3D Hydrogels

מדידת הסלולר העולמי מטריקס מטאלו-פרוטאינאז ופעילות מטבולית Hydrogels תלת-ממד

Three-dimensional (3D) cell culture systems often more closely recapitulate in vivo cellular responses and functions than traditional two-dimensional (2D) ...

Home-Based Monitor for Gait and Activity Analysis

צג מבוסס על בסיס לניתוח הילוך ופעילות

Current outcomes in neuromuscular disorder clinical trials include motor function scales, timed tests, and strength measures performed by trained clinical ...

Substructure Analyzer: A User-Friendly Workflow for Rapid Exploration and Accurate Analysis of Cellular Bodies in Fluorescence Microscopy Images

מנתח מבנה משנה: זרימת עבודה ידידותית למשתמש לחקר מהיר וניתוח מדויק של גופים סלולריים בתמונות מיקרוסקופ פלואורסצנטית

The last decade has been characterized by breakthroughs in fluorescence microscopy techniques illustrated by spatial resolution improvement but also in ...

Electric and Magnetic Field Devices for Stimulation of Biological Tissues

התקני שדה חשמליים ומגנטיים לגירוי רקמות ביולוגיות

Electric fields (EFs) and magnetic fields (MFs) have been widely used by tissue engineering to improve cell dynamics such as proliferation, migration, ...