Name: colorimetric analysis of alkaline phosphatase activity in s. aureus biofilm
Uploaded: 2019-04-12T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Colorimetric Analysis of Alkaline Phosphatase Activity in S. aureus Biofilm at JoVE.com

हम विलियम Rainey हार्पर कॉलेज और शिकागो में इलिनोइस विश्वविद्यालय की सुविधा के लिए इन प्रयोगों का संचालन करने के लिए धन्यवाद । हम भी उनके उदार समर्थन के लिए McGraw हिल फाउंडेशन धंयवाद ।

१. मध्यम तयारी
<ol><li>तैयार 1 Tryptic सोया शोरबाट की एल (TSB): आसुत जल के 1 एल में, अग्नाशय के casein के पचाने के 15 ग्राम, सोयाबीन भोजन, सोडियम क्लोराइड के 3 ग्राम, डेक्सट्रोज के २.५ ग्राम, और dipotassium फॉस्फेट की २.५ ग्राम के 5 ग्राम ?...

<ol>
	<li>Coleman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+mechanism+of+alkaline+phosphatase.">Structure and mechanism of alkaline phosphatase.</a> Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 21, 441-483 (1992).</li><li>Sharma, U., Pal, D., Prasad, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alkaline+Phosphatase:+An+Overview.">Alkaline Phosphatase: An Overview.</a> Indian Journal of Clinical Biochemistry. 29 (3), 269-278 (2014).</li><li>Mitchell, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+frequencies+of+elevated+alkaline+phosphatase+activity+and+rickets+exist+in+extremely+low+birth+weight+infants+despite+current+nutritional+support.">High frequencies of elevated alkaline phosphatase activity and rickets exist in extremely low birth weight infants despite current nutritional support.</a> Boston Medical Center Pediatrics. 9, 47 (2009).</li><li>Fawley, J., Gourlay, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+alkaline+phosphatase:+A+summary+of+its+role+in+clinical+disease.">Intestinal alkaline phosphatase: A summary of its role in clinical disease.</a> Journal of Surgical Research. 202 (1), 225-234 (2016).</li><li>Derman, A. I., Beckwith, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Escherichia+coli+Alkaline+Phosphatase+Localized+to+the+Cytoplasm+Slowly+Acquires+Enzymatic+Activity+in+Cells+Whose+Growth+Has+Been+Suspended:+a+Caution+for+Gene+Fusion+Studies.">Escherichia coli Alkaline Phosphatase Localized to the Cytoplasm Slowly Acquires Enzymatic Activity in Cells Whose Growth Has Been Suspended: a Caution for Gene Fusion Studies.</a> Journal of Bacteriology. 177 (13), 3764-3770 (1995).</li><li>Danikowski, K. M., Cheng, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alkaline+Phosphatase+Activity+of+Staphylococcus+aureus+grown+in+Biofilm+and+Suspension+Cultures.">Alkaline Phosphatase Activity of Staphylococcus aureus grown in Biofilm and Suspension Cultures.</a> Current Microbiology. 75, 1226-1230 (2018).</li><li>Okabayashi, K., Futai, M., Mizuno, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+of+Acid+and+Alkaline+Phosphatases+in+Staphylococcus+aureus.">Localization of Acid and Alkaline Phosphatases in Staphylococcus aureus.</a> Japanese Journal of Microbiology. 18 (4), 287-294 (1974).</li><li>Cheng, K. J., Costerton, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alkaline+Phosphatase+Activity+of+Rumen+Bacteria.">Alkaline Phosphatase Activity of Rumen Bacteria.</a> Applied and Environmental Microbiology. , 586-590 (1997).</li><li>Berezhetskyy, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphatase+conductometric+biosensor+for+heavy-metal+ions+determination.">Phosphatase conductometric biosensor for heavy-metal ions determination.</a> Innovation and Research in Biomedical Engineering. 29 (2-3), 136-140 (2008).</li><li>Park, E. J., Kang, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+bacterial+alkaline+phosphatase+assay+for+rapid+monitoring+of+bacterial+counts+on+spinach.">The use of bacterial alkaline phosphatase assay for rapid monitoring of bacterial counts on spinach.</a> Journal of Food Science. 73 (5), M236-M238 (2008).</li><li>Barber, M., Kuper, S. W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+Staphylococcus+pyogenes+by+the+phosphatase+reaction.">Identification of Staphylococcus pyogenes by the phosphatase reaction.</a> The Journal of Pathology and Bacteriology. 63, 65-68 (1951).</li><li>Wolf, P. L., Von der Muehll, E., Ludwick, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+test+to+differentiate+Serratia+from+Enterobacter.">A new test to differentiate Serratia from Enterobacter.</a> American Journal of Clinical Pathology. 56, 241-243 (1972).</li><li>Rangam, C. M., Katdare, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphatase+activity+of+Staphylococci+as+an+indication+of+their+pathogenicity.">Phosphatase activity of Staphylococci as an indication of their pathogenicity.</a> Indian Journal of Medical Science. 8, 610-613 (1954).</li><li>Flemming, H. -. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biofilms:+an+emergent+form+of+bacterial+life.">Biofilms: an emergent form of bacterial life.</a> Nature Reviews Microbiology. 14, 563-575 (2016).</li><li>Hoiby, N., Bjarnsholt, T., Givskov, M., Molin, S., Ciofu, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibiotic+resistance+of+bacterial+biofilms.">Antibiotic resistance of bacterial biofilms.</a> International Journal of Antimicrobial Agents. 35, 322-332 (2010).</li><li>Ito, A., Taniuchi, A., May, T., Kawata, K., Okabe, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+antibiotic+resistance+of+Escherichia+coli+in+mature+biofilms.">Increased antibiotic resistance of Escherichia coli in mature biofilms.</a> Applied and Environmental Microbiology. 75, 4093-4100 (2009).</li><li>Witherow, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Ten-Week+Biochemistry+Lab+Project+Studying+Wild-Type+and+Mutant+Bacterial+Alkaline+Phosphatase.">A Ten-Week Biochemistry Lab Project Studying Wild-Type and Mutant Bacterial Alkaline Phosphatase.</a> Biochemistry and Molecular Biology Education. 44 (6), (2016).</li><li>Henthorn, P., Zervos, P., Raducha, M., Harris, H., Kadesch, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+a+human+placental+alkaline+phosphatase+gene+in+transfected+cells:+Use+as+a+reporter+for+studies+of+gene+expression.">Expression of a human placental alkaline phosphatase gene in transfected cells: Use as a reporter for studies of gene expression.</a> Proceedings of the National Academy of Science USA. 85, 6324-6346 (1988).</li><li>Horney, B. S., Farmer, A. J., Honor, D. J., MacKenzie, A., Burton, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agarose+gel+electrophoresis+of+alkaline+phosphatase+isoenzymes+in+the+serum+of+hyperthyroid+cats.">Agarose gel electrophoresis of alkaline phosphatase isoenzymes in the serum of hyperthyroid cats.</a> Veterinary Clinical Pathology. 23 (3), 98-102 (1994).</li><li>Farley, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+Skeletal+Alkaline+Phosphatase+in+Osteoporotic+Serum+by+Wheat+Germ+Agglutinin+Precipitation,+Heat+Inactivation,+and+a+Two-Site+Immunoradiometric+Assay.">Quantification of Skeletal Alkaline Phosphatase in Osteoporotic Serum by Wheat Germ Agglutinin Precipitation, Heat Inactivation, and a Two-Site Immunoradiometric Assay.</a> Clinical Chemistry. 40 (9), 1749-1756 (1994).</li><li>O&#8217;Toole, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtiter+Dish+Biofilm+Formation+Assay.">Microtiter Dish Biofilm Formation Assay.</a> Journal of Visualized Experience. , (2011).</li><li>Nomoto, M., Ohsawa, M., Wang, H. L., Chen, C. C., Yeh, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+Characterization+of+Extracellular+Alkaline+Phosphatase+from+an+Alkalophilic+Bacterium.">Purification and Characterization of Extracellular Alkaline Phosphatase from an Alkalophilic Bacterium.</a> Agricultural and Biological Chemistry. 52 (7), 1643-1647 (1988).</li></ol>

हमारी परख में, हम ALP सब्सट्रेट के रूप में pNPP का इस्तेमाल किया । यह एलिसा के लिए बनाया गया एक काम समाधान है और कोई कमजोर पड़ने की जरूरत नहीं है । एएलपी द्वारा hydrolysis के बाद, एक पीले उत्पाद विकसित करता है और ४०५ ए?...

क्षारीय फॉस्फेट (एएलपी) को दोनों प्रोक्योटिक और यूक्योटिक कोशिकाओं में व्यक्त किया जाता है । यह विभिन्न अणुओं जैसे न्यूक्लियोटिड्स, प्रोटीन, एल्कलॉइड, फॉस्फेट एस्टर और फॉस्फोरिक अम्ल के एन्हाइड्राइडों से मोनोफॉस्फेट के जल अपघटन को उत्प्रेरित कर सकता है । मनुष्यों में, यूक्योटिक एएलपी जिगर, अस्थि, आंत और अपरा2सहित कई ऊतकों में मौजूद है । यह प्रोटीन फॉस्फोरिलेशन, कोशिका वृद्धि, अपोप्टोसिस, स्टेम सेल प्रक्रियाओं के साथ-साथ सामान्य कंकाल खनिजीकरण में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है । यूकेयोटिक एएलपी हड्डी में रोगों की उपस्थिति के लिए एक महत्वपूर्ण सीरम संकेतक भी है, जिगर, और अन्य ऊतकों/
प्रोक्योटिक एएलपी में विभिन्न प्रकार के जीवाणु कोशिकाओं का पता लगाया गया है, जिनमें ई.कोलाई5, एस. ऑरियस6,7 और मिट्टी में कुछ सामान्य रूमेन बैक्टीरिया शामिल हैं । बैक्टीरियल alp गतिविधि कीटनाशकों का पता लगाने में एक बायोसेंसर के रूप में इस्तेमाल किया गया है, भारी धातुओं9 और बैक्टीरियल संदूषण10. एएलपी की संवैधानिक अभिव्यक्ति के लिए Staphylococci11 की पहचान और Enterobacter12से serratia अंतर करने के लिए इस्तेमाल किया गया है । यह आगे सुझाव दिया है कि संवैधानिक एएलपी उत्पादन staphylococci13में रोगजनन के साथ सहसंबद्ध है । हालांकि alp अलग सेटिंग्स3,4में अध्ययन किया गया है, अभी तक कम अपनी गतिविधि और biofilms संस्कृतियों में समारोह के लिए सूचना दी है ।
एक biofilm के रूप में अपने मुक्त रहने वाले जीवाणु सेल समकक्ष14की तुलना में एक अलग कार्य बैक्टीरियल जीवन है प्रलेखित किया गया है । एस aureusमें, biofilm के गठन के नैदानिक शर्तों और एंटीबायोटिक प्रतिरोध और जीर्ण सूजन15,16के लिए खातों की एक किस्म में पहचान की गई है । कई अणुओं को एक biofilm मैट्रिक्स जैसे पॉलिसैकेराइड, प्रोटीन, न्यूकलिक एसिड, और लिपिड में पाया जाना सूचित किया गया था, लेकिन biofilm गठन की व्यवस्था पूरी तरह से14समझ में नहीं है । Biofilm गठन में एएलपी की भूमिका को समझने के लिए, हम ९६ में अच्छी तरह से ऊतक संस्कृति प्लेटों में एस aureus biofilm और पैरा-nitrophenylphosphate (pnpp) का उपयोग कर alp गतिविधि मापा ।
अणु pnpp एएलपी के लिए एक तैयार करने के लिए उपयोग सब्सट्रेट है और व्यापक रूप से एएलपी गतिविधि6,17,18को मापने के लिए इस्तेमाल किया गया है । यह वर्णमितीय परख पैरा-नाइट्रोफेनिल फॉस्फेट (पीएनपीपी) के पैरा-नाइट्रोफीनॉल के रूपांतरण पर आधारित है जिसके परिणामस्वरूप ४०५ एनएम पर एक रंगीन उत्पाद है । इस तरह के रूप में अंय पारंपरिक एएलपी परख, agose जेल के रूप में19ट्रो, गेहूं रोगाणु agglutinin (wga) वर्षण, और wga-hplc20, इस परख अत्यधिक विशिष्ट है, संवेदनशील, प्रतिलिपि करने के लिए आसान है, और सबसे महत्वपूर्ण बात, उच्च के लिए अनुमति देता है प्रवाह.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>VWR</td>
			<td>9002-18-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Centrifuge</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>5810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gluose</td>
			<td>VWR</td>
			<td>50-99-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH pellets</td>
			<td>VWR</td>
			<td>SS0550-500GR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Para-nitrophenylphosphate (pNPP)&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7998-100ML</td>
			<td>Typical concentrations of pNPP liquid substrates, often used in enzyme-linked immunesorbent assays (ELISA), range between 10 to 50 mM. Similar to most ready-to-use pNPP liquid substrates like the one used here, the exact pNPP concentration is not disclosed due to its proprietary nature.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X PBS, pH7.4. 
			173 mM NaCl, 
			2.7 mM KCl, 
			8 mM Na2HPO4, 
			2 mM KH2PO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P3288-1VL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate Reader</td>
			<td>Biotek</td>
			<td>ELx808</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S. aureus</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>ATCC25923</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptic Soy Agar&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 15g / L TSB</td>
			<td>VWR</td>
			<td>9002-18-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptic Soy Broth:&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; g/L 
			Pancreatic Digest of Casein............ 15.0 
			Papaic Digest of Soyben Meal.........5.00 
			Sodium chloride.............................. 3.00 
			Dextrose........................................&#160; 2.50 
			Dipotassium phosphate..................2.50</td>
			<td>VWR</td>
			<td>90006-098</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well tissue culture plates</td>
			<td>BD</td>
			<td>6902D09</td>
			<td>U shaped bottom</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

colorimetric analysis of alkaline phosphatase activity in s. aureus biofilm

क्षारीय फॉस्फेट (एएलपी) एक सामान्य एंजाइम है जो प्रोक्योटिक और यूकार्योटिक कोशिकाओं दोनों में व्यक्त किया जाता है । यह बुनियादी पीएच पर कई अणुओं से फॉस्फेट monoesters के hydrolysis catalyzes और फॉस्फेट चयापचय में एक अपरिहार्य भूमिका निभाता है । मनुष्यों में, यूकेरियोटिक एएलपी विभिन्न रोगों, जैसे कि cholestasis और रिकेट्स के निदान में सबसे अधिक बार इस्तेमाल किया एंजाइमी संकेतों में से एक है । में एस. ऑरियस, एएलपी कोशिका झिल्ली पर विशेष रूप से पाया जाता है; यह भी एक स्रावी रूप के रूप में अच्छी तरह से व्यक्त की है । फिर भी, थोड़ा biofilm गठन में अपने समारोह के बारे में जाना जाता है ।
इस पांडुलिपि के उद्देश्य के लिए एक त्वरित और विश्वसनीय परख विकसित करने के लिए एस में ALP गतिविधि को मापने के aureus biofilm कि प्रोटीन अलगाव की आवश्यकता नहीं है । एक सब्सट्रेट के रूप में पी-नाइट्रोफेनिल फॉस्फेट (pNPP) का उपयोग करना, हम एस में एएलपी गतिविधि मापा-९६ में बनाई गई biofilm-अच्छी तरह से ऊतक संस्कृति प्लेटें । गतिविधि ४०५ एनएम absorbance द्वारा मापा घुलनशील प्रतिक्रिया उत्पाद के गठन पर आधारित था । ९६ अच्छी तरह से ऊतक संस्कृति प्लेट विधि के उच्च थ्र्पुट प्रकृति एएलपी गतिविधि assays के लिए एक संवेदनशील और reproducible विधि प्रदान करता है । एक ही प्रयोगात्मक सेट अप भी अन्य extracellular आणविक मार्करों biofilm गठन से संबंधित उपाय करने के लिए बढ़ाया जा सकता है.

चित्रा 1 एस के BIOFILM संस्कृतियों से एएलपी गतिविधि का एक प्रतिनिधि परिणाम से पता चलता है ९६ में अच्छी तरह से ऊतक संस्कृति प्लेटें । ७५ μL वाणिज्यिक रूप से उपलब्ध pNPP समाधान प्रत्येक...

Watch this Scientific Journal Video about Colorimetric Analysis of Alkaline Phosphatase Activity in S. aureus Biofilm at JoVE.com

Colorimetric Analysis of Alkaline Phosphatase Activity in S. aureus Biofilm

इस पांडुलिपि में, हमने एक उच्च थ्रुपुट विधि की स्थापना की है जिसमें क्षारीय फॉस्फेट क्रियाकलाप को एस. ऑरेयस बायोफिल्म कल्चर में ९६-कूप ऊतक कल्चर प्लेट

एस. ऑरियस बायोफिल्म में क्षारीय फॉस्फेट गतिविधि का वर्णमितीय विश्लेषण

Alkaline phosphatase (ALP) is a common enzyme expressed in both prokaryotic and eukaryotic cells. It catalyzes the hydrolysis of phosphate monoesters from ...

इस प्रोटोकॉल ने एस ऑरियस बायोफिल्म संस्कृति में क्षारीय फॉस्फेट गतिविधि को मापने के लिए एक आसान और विश्वसनीय विधि प्रस्तुत की। यह हमें बायोफिल्म निर्माण में एएलपी के कार्य को समझने में मदद करेगा। इस तकनीक का बड़ा फायदा ज्यादा थ्रूपुट है।यह बहुत संवेदनशील और प्रदर्शन करने में आसान है। प्रक्रिया का प्रदर्शन केविन Danikowski, हार्पर कॉलेज से एक पूर्व छात्र होगा । टीएसबी तैयार करने के लिए, केसिन का अग्नाशय डाइजेस्ट, सोयाबीन भोजन का पैपिक डाइजेस्ट, सोडियम क्लोराइड, डेक्सट्रोस और डिपोटासियम फॉस्फेट को आसुत पानी में जोड़ें।एल्यूमीनियम पन्नी के साथ फ्लास्क कवर और उपयोग से पहले बंध्याकरण करने के लिए एक ऑटोक्लेव में डाल दिया। टीएसए तैयार करने के लिए टीएसबी में आगर डालकर नसबंदी के लिए ऑटोक्लेव में डाल दिया। फिर इसे कमरे के तापमान में ठंडा होने दें।इसके बाद, इसे पेट्री डिश में प्रति डिश 20 मिलीलीटर के अनुपात में डालें। एक बायोफिल्म संस्कृति माध्यम तैयार करने के लिए, 10 ग्राम प्रति लीटर की एकाग्रता प्राप्त करने के लिए ऑटोक्लेवित टीएसबी में ग्लूकोज जोड़ें। वैक्यूम फिल्ट्रेशन किट का उपयोग करके, 0.2 माइक्रोमीटर पोर आकार के फिल्टर के साथ समाधान को छानें।टीका लगाने के लिए, पेट्री डिश से स्टैफ ऑरियस के एक व्यक्तिगत कॉलोनी को चुनने के लिए एक निष्फल टीका लूप का उपयोग करें और इसे टीएसबी के 10 मिलीलीटर से भरे संस्कृति ट्यूब में रखें। 37 डिग्री सेल्सियस पर रात भर बढ़ने के लिए इनक्यूबेटर में ट्यूब रखो। एक माइक्रोपिपेट के साथ, रातोंरात संस्कृति के 100 माइक्रोलीटर आकर्षित करें और इसे 1:100 वॉल्यूम अनुपात कमजोर पड़ने के लिए ग्लूकोज के साथ टीएसबी के 10 मिलीलीटर से भरे संस्कृति ट्यूब में स्थानांतरित करें।भंवर धीरे एक सुसंगत एकाग्रता के लिए मिश्रण करने के लिए। एक 96 अच्छी तरह से प्लेट से कुल 18 कुओं में पतला संस्कृति के 200 माइक्रोलीटर स्थानांतरित करने के लिए एक माइक्रोपिपेट का उपयोग करें। बायोफिल्म निर्माण के लिए 24 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर 96 अच्छी तरह से प्लेट इनक्यूबेट।एस ऑरियस के सर्वश्रेष्ठ बायोफिल्म गठन के लिए, एक फ्लैट या गोल बॉटम 96 अच्छी प्लेट चुनना बेहतर है। उसके बाद, प्रत्येक कुएं के किनारे से आकांक्षा द्वारा सुपरनैंट को कम करने के लिए प्लेट को थोड़ा झुकाएं। प्रत्येक को 1X पीबीएस के साथ अच्छी तरह से धोएं।8, 000 क्रांतियों प्रति मिनट पर पांच मिनट के लिए स्पिन करने के लिए अपकेंद्रित्र में प्लेट रखो और आकांक्षा द्वारा सुपरनैंट को डिकंट करें। प्रत्येक कुएं में व्यावसायिक रूप से उपलब्ध पीएनपीपी से मिलकर बफर एएलपी सब्सट्रेट के 75 माइक्रोलीटर जोड़ें और ट्रिप्लिकेट में हर बार बिंदु रिकॉर्ड करने के लिए टाइमर का उपयोग करें। प्रत्येक इनक्यूबेशन समय बिंदु के बाद, प्रतिक्रिया को रोकने के लिए तीन कुओं में से प्रत्येक में पांच मोलर सोडियम हाइड्रोक्साइड के ७५ माइक्रोलीटर जोड़ें ।प्रति मिनट 800 क्रांतियों पर पांच मिनट के लिए प्लेट को सेंट्रलाइज करें। कैलोरीमेट्रिक मापन के लिए एक नई 96 अच्छी प्लेट में सुपरनेट के 100 माइक्रोलीटर स्थानांतरित करने के लिए एक पिपेट का उपयोग करें। 405 नैनोमीटर पर प्रत्येक कुएं के अवशोषण को मापने के लिए 96 अच्छी तरह से प्लेट रीडर का उपयोग करें।पृष्ठभूमि शोर के लिए नियंत्रण करने के लिए 30 मिनट के समय बिंदु कुओं का उपयोग करें। तीन 96 वेल प्लेटों में पूरे प्रयोग को दोहराएं। यह प्रोटोकॉल एस ऑरियस बायोफिल्म में एएलपी गतिविधि को मापने के लिए एक त्वरित और विश्वसनीय परख विकसित करता है जिसमें प्रोटीन अलगाव की आवश्यकता नहीं होती है।एएलपी गतिविधि का प्रतिनिधि परिणाम 75 मिनट तक के लिए बढ़ी हुई प्रवृत्ति दिखाता है। 75 मिनट के बाद एएलपी गतिविधि में कोई वृद्धि नहीं देखी गई। एक अच्छी बायोफिल्म संस्कृति स्थापित करना बहुत महत्वपूर्ण है और इसमें महारत हासिल करने के लिए काफी कुछ परीक्षण लग सकते हैं।आप क्रिस्टल वायलेट परख प्रदर्शन के रूप में पहले हमारे और दूसरों द्वारा रिपोर्ट या आप पूर्व मानव प्लाज्मा के साथ थाली का इलाज करने के लिए बायोफिल्म गठन की सुविधा कर सकते है प्रदर्शन करके बायोफिल्म गठन की पुष्टि कर सकते हैं । इसके विकास के बाद, आप संभावित एएलपी अवरोधकों को स्क्रीन कर सकते हैं जो बायोफिल्म गठन में हस्तक्षेप कर सकते हैं। परिणाम चिकित्सा क्षेत्र में बायोफिल्म प्रबंधन की ओर महत्वपूर्ण जानकारी प्रदान करेगा ।संपर्क के मामले में पांच मोलर सोडियम हाइड्रोक्साइड खतरनाक हो सकते हैं। हैंडलिंग करते समय व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण पहनना सुनिश्चित करें।

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Colorimetric Analysis of Alkaline Phosphatase Activity in S. aureus Biofilm

Quantification of Global Diastolic Function by Kinematic Modeling-based Analysis of Transmitral Flow via the Parametrized Diastolic Filling Formalism

Parametrized डायस्टोलिक भरने रीतिवाद के माध्यम से Transmitral फ्लो की विज्ञान सम्बन्धी मॉडलिंग आधारित विश्लेषण द्वारा ग्लोबल डायस्टोलिक समारोह की मात्रा

Quantitative cardiac function assessment remains a challenge for physiologists and clinicians.&#160;Although historically invasive methods have comprised ...

Protocol for Biofilm Streamer Formation in a Microfluidic Device with Micro-pillars

माइक्रो खंभे के साथ एक microfluidic डिवाइस में Biofilm किरण गठन के लिए प्रोटोकॉल

Several bacterial species possess the ability to attach to surfaces and colonize them in the form of thin films called biofilms. Biofilms that grow in ...

Real-time Visualization and Analysis of Chondrocyte Injury Due to Mechanical Loading in Fully Intact Murine Cartilage Explants

वास्तविक समय दृश्य और पूरी तरह से बरकरार Murine उपास्थि Explants में यांत्रिक लदान के कारण Chondrocyte चोट का विश्लेषण

Homeostasis of articular cartilage depends on the viability of resident cells (chondrocytes). Unfortunately, mechanical trauma can induce widespread ...

A Zebrafish Embryo Model for In Vivo Visualization and Intravital Analysis of Biomaterial-associated Staphylococcus aureus Infection

A Zebrafish Embryo Model for In Vivo Visualization and Intravital Analysis of Biomaterial-associated Staphylococcus aureus Infection

Vivo दृश्य और Intravital विश्लेषण में के लिए एक Zebrafish भ्रूण मॉडल-संबंधित Staphylococcus aureus संक्रमण

Biomaterial-associated infection (BAI) is a major cause of the failure of biomaterials/medical devices. Staphylococcus aureus is one of the major ...

High-resolution Patterned Biofilm Deposition Using pDawn-Ag43

pDawn-Ag43 का उपयोग करते हुए उच्च-रिज़ॉल्यूशन नमूनों वाली फिल्मी साठा

Spatial structure and patterning play an important role in bacterial biofilms. Here we demonstrate an accessible method for culturing E. coli biofilms ...

Measuring Global Cellular Matrix Metalloproteinase and Metabolic Activity in 3D Hydrogels

3d Hydrogels में वैश्विक सेलुलर मैट्रिक्स Metalloproteinase और चयापचय गतिविधि को मापने

Three-dimensional (3D) cell culture systems often more closely recapitulate in vivo cellular responses and functions than traditional two-dimensional (2D) ...

Home-Based Monitor for Gait and Activity Analysis

गैट और गतिविधि विश्लेषण के लिए घर आधारित मॉनिटर

Current outcomes in neuromuscular disorder clinical trials include motor function scales, timed tests, and strength measures performed by trained clinical ...

Substructure Analyzer: A User-Friendly Workflow for Rapid Exploration and Accurate Analysis of Cellular Bodies in Fluorescence Microscopy Images

सबस्ट्रक्चर एनालाइजर: फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी इमेजेज में सेलुलर निकायों के रैपिड एक्सप्लोरेशन और सटीक विश्लेषण के लिए उपयोगकर्ता के अनुकूल वर्कफ्लो

The last decade has been characterized by breakthroughs in fluorescence microscopy techniques illustrated by spatial resolution improvement but also in ...

Electric and Magnetic Field Devices for Stimulation of Biological Tissues

जैविक ऊतकों की उत्तेजना के लिए इलेक्ट्रिक और चुंबकीय क्षेत्र उपकरण

Electric fields (EFs) and magnetic fields (MFs) have been widely used by tissue engineering to improve cell dynamics such as proliferation, migration, ...