Name: colorimetric analysis of alkaline phosphatase activity in s. aureus biofilm
Uploaded: 2019-04-12T15:00:00
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Grazie a William Rainey Harper College e la University of Illinois a Chicago per la possibilità di condurre questi esperimenti. Ringraziamo anche McGraw Hill Foundation per il loro generoso sostegno.

1. preparazione media
<ol><li>Preparare 1 L di brodo di soia triptico (TSB): in 1 L di acqua distillata, aggiungere 15 g di digerito pancreatico di caseina, 5 g di papaico di farina di soia, 3 g di cloruro di sodio, 2,5 g di destrosio e 2,5 g di fosfato dipotassico. Sterilizzare prima dell'uso.</li>
	<li>Per Tryptic Soy Agar (TSA), aggiungere 15 g di agar a 1 L di TSB, autoclave. Poi lasciate raffreddare fino a temperatura ambiente. Successivamente, versare in un rapporto di 20 mL per piastra di Petri (100 x 15 mm).</l...

<ol>
	<li>Coleman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+mechanism+of+alkaline+phosphatase.">Structure and mechanism of alkaline phosphatase.</a> Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 21, 441-483 (1992).</li><li>Sharma, U., Pal, D., Prasad, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alkaline+Phosphatase:+An+Overview.">Alkaline Phosphatase: An Overview.</a> Indian Journal of Clinical Biochemistry. 29 (3), 269-278 (2014).</li><li>Mitchell, M. 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C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biofilms:+an+emergent+form+of+bacterial+life.">Biofilms: an emergent form of bacterial life.</a> Nature Reviews Microbiology. 14, 563-575 (2016).</li><li>Hoiby, N., Bjarnsholt, T., Givskov, M., Molin, S., Ciofu, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibiotic+resistance+of+bacterial+biofilms.">Antibiotic resistance of bacterial biofilms.</a> International Journal of Antimicrobial Agents. 35, 322-332 (2010).</li><li>Ito, A., Taniuchi, A., May, T., Kawata, K., Okabe, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+antibiotic+resistance+of+Escherichia+coli+in+mature+biofilms.">Increased antibiotic resistance of Escherichia coli in mature biofilms.</a> Applied and Environmental Microbiology. 75, 4093-4100 (2009).</li><li>Witherow, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Ten-Week+Biochemistry+Lab+Project+Studying+Wild-Type+and+Mutant+Bacterial+Alkaline+Phosphatase.">A Ten-Week Biochemistry Lab Project Studying Wild-Type and Mutant Bacterial Alkaline Phosphatase.</a> Biochemistry and Molecular Biology Education. 44 (6), (2016).</li><li>Henthorn, P., Zervos, P., Raducha, M., Harris, H., Kadesch, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+a+human+placental+alkaline+phosphatase+gene+in+transfected+cells:+Use+as+a+reporter+for+studies+of+gene+expression.">Expression of a human placental alkaline phosphatase gene in transfected cells: Use as a reporter for studies of gene expression.</a> Proceedings of the National Academy of Science USA. 85, 6324-6346 (1988).</li><li>Horney, B. 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R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+Skeletal+Alkaline+Phosphatase+in+Osteoporotic+Serum+by+Wheat+Germ+Agglutinin+Precipitation,+Heat+Inactivation,+and+a+Two-Site+Immunoradiometric+Assay.">Quantification of Skeletal Alkaline Phosphatase in Osteoporotic Serum by Wheat Germ Agglutinin Precipitation, Heat Inactivation, and a Two-Site Immunoradiometric Assay.</a> Clinical Chemistry. 40 (9), 1749-1756 (1994).</li><li>O&#8217;Toole, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtiter+Dish+Biofilm+Formation+Assay.">Microtiter Dish Biofilm Formation Assay.</a> Journal of Visualized Experience. , (2011).</li><li>Nomoto, M., Ohsawa, M., Wang, H. L., Chen, C. C., Yeh, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+Characterization+of+Extracellular+Alkaline+Phosphatase+from+an+Alkalophilic+Bacterium.">Purification and Characterization of Extracellular Alkaline Phosphatase from an Alkalophilic Bacterium.</a> Agricultural and Biological Chemistry. 52 (7), 1643-1647 (1988).</li></ol>

Nella nostra analisi, abbiamo usato pNPP come il substrato ALP. Si tratta di una soluzione di lavoro progettata per ELISA e Nessuna diluizione è necessaria. Dopo l'idrolisi di ALP, un prodotto giallo si sviluppa e può essere misurato a 405 nm. Alla fine della reazione enzimatica, abbiamo brevemente centrifugato la piastra ben 96 e trasferito il surnatante in un piatto ben 96 fresco per misurare l'assorbanza utilizzando il lettore di piastra. Abbiamo trovato che questo passaggio di centrifugazione supplementare è fonda...

Fosfatasi alcalina (ALP) è espressa ubiquitariamente in entrambe le cellule procariote ed eucariote1. Esso può catalizzare l'idrolisi di monofosfato da diverse molecole come nucleotidi, proteine, alcaloidi, esteri fosforici e anidridi di acido fosforico. In esseri umani, ALP eucariotica è presente in molti tessuti compreso fegato, ossa, intestino e placenta2. Svolge i ruoli importanti nella fosforilazione della proteina, crescita cellulare, apoptosi, i processi delle cellule staminali come pure normale mineralizzazione scheletrica. Eucariotiche ALP è anche un indicatore chiave del siero per la presenza di malattie in ossa, fegato e altri tessuti/organi quando elevati3,4.
Prokaryotic ALP è stato rilevato in una varietà di cellule batteriche, tra cui5di e. coli, Staphylococcus aureus6,7 e alcuni comuni batteri ruminali in suoli8. Attività batterica ALP è stato usato come un biosensore nella rilevazione di pesticidi, metalli pesanti9 e10di contaminazione batterica. L'espressione costitutiva di ALP è stato utilizzato per identificare gli stafilococchi11 e per differenziare Serratia da Enterobacter12. Più ulteriormente è suggerito che la produzione costitutiva di ALP è correlato con patogenicità in stafilococchi13. Anche se ALP è stato studiato in diverse impostazioni3,4, ancora poco è segnalato per la sua attività e la funzione nelle culture di biofilm.
Un biofilm è stato documentato per avere una vita batterica in modo diverso funzionamento rispetto ai suoi dissipati cellula batterica controparte14. In S. aureus, la formazione del biofilm è stata identificata in una varietà di condizioni cliniche e conti per la resistenza agli Antibiotico e l'infiammazione cronica15,16. Molte molecole erano stati segnalati per essere trovato in una matrice di biofilm come polisaccaridi, proteine, acidi nucleici e lipidi, ma il meccanismo di formazione del biofilm non è pienamente compreso14. Per comprendere il ruolo di ALP nella formazione del biofilm, abbiamo coltivato i biofilm di S. aureus in 96 piatti di coltura di tessuto ben e misurato l'ALP attività utilizzando para-nitrophenylphosphate (pNPP).
La molecola pNPP è un substrato di ready-to-use per l'Alpe ed è stato ampiamente usato per misurare ALP attività6,17,18. Questo saggio colorimetrico si basa sulla conversione del para-nitrofenil fosfato (pNPP) a para-nitrofenolo risultante in un prodotto colorato a 405 nm. Rispetto ad altri test ALP convenzionali, come l'elettroforesi19, germe di grano precipitazione dell'agglutinina (WGA), gel dell'agarosi e WGA-HPLC20, questo test è altamente specifico, sensibile, facile da riprodurre e la maggior parte importante, consente ad alta velocità di trasmissione.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>VWR</td>
			<td>9002-18-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Centrifuge</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>5810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gluose</td>
			<td>VWR</td>
			<td>50-99-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH pellets</td>
			<td>VWR</td>
			<td>SS0550-500GR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Para-nitrophenylphosphate (pNPP)&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7998-100ML</td>
			<td>Typical concentrations of pNPP liquid substrates, often used in enzyme-linked immunesorbent assays (ELISA), range between 10 to 50 mM. Similar to most ready-to-use pNPP liquid substrates like the one used here, the exact pNPP concentration is not disclosed due to its proprietary nature.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X PBS, pH7.4. 
			173 mM NaCl, 
			2.7 mM KCl, 
			8 mM Na2HPO4, 
			2 mM KH2PO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P3288-1VL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate Reader</td>
			<td>Biotek</td>
			<td>ELx808</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S. aureus</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>ATCC25923</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptic Soy Agar&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 15g / L TSB</td>
			<td>VWR</td>
			<td>9002-18-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptic Soy Broth:&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; g/L 
			Pancreatic Digest of Casein............ 15.0 
			Papaic Digest of Soyben Meal.........5.00 
			Sodium chloride.............................. 3.00 
			Dextrose........................................&#160; 2.50 
			Dipotassium phosphate..................2.50</td>
			<td>VWR</td>
			<td>90006-098</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well tissue culture plates</td>
			<td>BD</td>
			<td>6902D09</td>
			<td>U shaped bottom</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

colorimetric analysis of alkaline phosphatase activity in s. aureus biofilm

Fosfatasi alcalina (ALP) è un enzima comune espresso in cellule sia procariote ed eucariote. Esso catalizza l'idrolisi di monoesteri di fosfato da molte molecole a base pH e svolge un ruolo indispensabile nel metabolismo del fosfato. In esseri umani, eucariotiche ALP è uno dei segnali enzimatici maggiormente utilizzati nella diagnosi di varie malattie, quali la colestasi ed il rachitismo. In S. aureus, ALP è rilevato esclusivamente sulla membrana cellulare; essa si esprime anche come una forma secretiva pure. Tuttavia, piccolo è conosciuto circa la sua funzione nella formazione del biofilm.
Lo scopo di questo manoscritto è quello di sviluppare un'analisi rapida e affidabile per misurare l'attività ALP nel biofilm di S. aureus che non richiedono l'isolamento di proteine. Utilizzando p-nitrofenil fosfato (pNPP) come substrato, abbiamo misurato ALP attività in biofilm di S. aureus formata in piastre a 96 pozzetti tessuto coltura. Attività si basava sulla formazione del prodotto solubile reazione misurata di assorbanza di 405 nm. La natura elevato throughput del metodo della piastra di coltura del tessuto ben 96 fornisce un metodo sensibile e riproducibile per analisi di attività ALP. Lo stesso sperimentale istituito può essere esteso anche per misurare altri marcatori molecolari extracellulare legate alla formazione del biofilm.

La figura 1 Mostra un risultato rappresentativo dell'attività ALP da culture di biofilm di S. aureus in piastre di coltura tissutale ben 96. 75 μL di soluzione di pNPP commercialmente disponibile è stato aggiunto a ogni bene e incubate a temperatura ambiente. Dopo incubazione per diverse volte (0 min, 15min, 30min, 45min, 60min e 75 min, rispettivamente) 75 μL di 5 M NaOH è stato aggiunto per arrestare la reazione. Il prodotto quindi è stato mi...

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Colorimetric Analysis of Alkaline Phosphatase Activity in S. aureus Biofilm

In questo manoscritto, abbiamo stabilito un metodo di alto rendimento per quantificare l'attività della fosfatasi alcalina nella coltura di biofilm di S. aureus dalla piastra di coltura del tessuto 96 pozzetti

Colorimetrico analisi di alcalino fosfatasi attività in Biofilm di S. aureus

Alkaline phosphatase (ALP) is a common enzyme expressed in both prokaryotic and eukaryotic cells. It catalyzes the hydrolysis of phosphate monoesters from ...

Questo protocollo ha presentato un metodo facile e affidabile per misurare l'attività della fosfatasi alcalinizzata nella cultura del biofilm S.aureus. Ci aiuterà a comprendere la funzione di ALP nella formazione di biofilm. Il principale vantaggio di questa tecnica è l'elevata produttività.È molto sensibile e facile da eseguire. A dimostrare la procedura sarà Kevin Danikowski, ex studente dell'Harper College. Per preparare il TSB, aggiungere il digerimento pancreatico della caseina, il digestione papaica della farina di soia, il cloruro di sodio, il destrosio e il fosfato di dipotassio in acqua distillata.Coprire il pallone con un foglio di alluminio e metterlo in autoclave per sterilizzare prima dell'uso. Per preparare una TSA, aggiungere l'agar al TSB e metterlo in autoclave per la sterilizzazione. Quindi lascialo raffreddare a temperatura ambiente.Quindi, versalo nella piastra di Petri con un rapporto di 20 millilitri per piatto. Per preparare un mezzo di coltura di biofilm, aggiungere glucosio al TSB autoclavato per ottenere la concentrazione di 10 grammi per litro. Utilizzando un kit di filtrazione sottovuoto, filtrare la soluzione con un filtro delle dimensioni di un poro di 0,2 micrometri.Per inoculare, utilizzare un circuito di inoculazione sterilizzato per scegliere una singola colonia di Staph aureus dalla piastra di Petri e posizionarlo nel tubo di coltura riempito con 10 millilitri di TSB. Metti il tubo nell'incubatrice per crescere durante la notte a 37 gradi Celsius. Con una micropipetta, disegnare 100 microlitri di coltura notturna e trasferirli in un tubo di coltura riempito con 10 millilitri di TSB con glucosio per una diluizione del rapporto volume 1:100.Vortice delicatamente da mescolare per una concentrazione costante. Utilizzare una micropipetta per trasferire 200 microlitri di coltura diluita in un totale di 18 pozzali da una piastra da 96 pozzi. Incubare la piastra del pozzo 96 a 37 gradi Celsius per 24 ore per la formazione di biofilm.Per la migliore formazione di biofilm di S.aureus, è meglio scegliere una piastra piatta o rotonda del fondo 96. Successivamente, inclinare leggermente la piastra per decantare il supernatante per aspirazione dal bordo di ogni pozzo. Lavare ogni bene con 1X PBS.Mettere la piastra nella centrifuga per girare per cinque minuti a 8.000 giri al minuto e decantare il supernatante per aspirazione. Aggiungere 75 microlitri di substrato ALP tamponato costituito da PNPP disponibile in commercio a ciascun pozzo e utilizzare un timer per registrare ogni punto di tempo in triplice copia. Dopo ogni punto di incubazione, aggiungere 75 microlitri di cinque idrossido di sodio molare a ciascuno dei tre pozzi per fermare la reazione.Centrifuga la piastra per cinque minuti a 800 giri al minuto. Utilizzare una pipetta per trasferire 100 microlitri di supernatante in una nuova piastra di pozzo 96 per la misurazione calorimetrica. Utilizzare un lettore di piastre a 96 po porsi per misurare l'assorbanza di ogni pozzo a 405 nanometri.Utilizzare i pozzi del punto di tempo di 30 minuti per controllare il rumore di fondo. Ripetere l'intero esperimento in tre piastre di pozzo 96. Questo protocollo sviluppa un saggio rapido e affidabile per misurare l'attività alp nel biofilm S.aureus che non richiede isolamento proteico.Il risultato rappresentativo dell'attività ALP mostra una tendenza aumentata fino a 75 minuti. Dopo 75 minuti, non è stato osservato alcun aumento dell'attività alp. È molto importante stabilire una buona cultura del biofilm e potrebbero essere necessarie alcune prove da padroneggiare.Puoi confermare la formazione di biofilm eseguendo un saggio di viola cristallo come precedentemente riportato da noi e da altri o puoi pre-trattare la piastra con plasma umano per facilitare la formazione di biofilm. Dopo il suo sviluppo, è possibile schermare potenziali inibitori dell'ALP che potrebbero interferire nella formazione di biofilm. Il risultato fornirà importanti informazioni per la gestione del biofilm in campo medico.Cinque idrossido di sodio molare potrebbero essere pericolosi in caso di contatto. Assicurarsi di indossare dispositivi di protezione individuale durante la manipolazione.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

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Ricerca

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A Zebrafish Embryo Model for In Vivo Visualization and Intravital Analysis of Biomaterial-associated Staphylococcus aureus Infection

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