Name: colorimetric analysis of alkaline phosphatase activity in s. aureus biofilm
Uploaded: 2019-04-12T15:00:00
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우리는 이러한 실험을 실시 시설에 대 한 시카고에 일리노이의 대학 윌리엄 Rainey Harper 대학 감사. 우리는 또한 그들의 관대 한 지원에 대 한 맥 그로 힐 재단을 감사합니다.

1. 매체 준비
<ol><li>1 L Tryptic 간장 국물 (TSB)의 준비:로 1 L 증류수, 카 제인, 콩 식사, 3 g의 염화 나트륨, 포도 당의 2.5 g와 dipotassium 인산 염의 2.5 g의 papaic 다이제스트의 5 g의 췌 장 소화의 15 g 추가. 사용 하기 전에 소독.</li>
	<li>TSB, 1 리터에 한 천 15 g을 추가 하는 대 한 Tryptic 간장 Agar (TSA), 오토 클레이 브. 다음 그것은 실내 온도 아래로 멋진 보자. 그런 다음 페 트리 접시 (100 m m x 15 m m) 당 20 mL의 비?...

<ol>
	<li>Coleman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+mechanism+of+alkaline+phosphatase.">Structure and mechanism of alkaline phosphatase.</a> Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 21, 441-483 (1992).</li><li>Sharma, U., Pal, D., Prasad, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alkaline+Phosphatase:+An+Overview.">Alkaline Phosphatase: An Overview.</a> Indian Journal of Clinical Biochemistry. 29 (3), 269-278 (2014).</li><li>Mitchell, M. 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C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biofilms:+an+emergent+form+of+bacterial+life.">Biofilms: an emergent form of bacterial life.</a> Nature Reviews Microbiology. 14, 563-575 (2016).</li><li>Hoiby, N., Bjarnsholt, T., Givskov, M., Molin, S., Ciofu, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibiotic+resistance+of+bacterial+biofilms.">Antibiotic resistance of bacterial biofilms.</a> International Journal of Antimicrobial Agents. 35, 322-332 (2010).</li><li>Ito, A., Taniuchi, A., May, T., Kawata, K., Okabe, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+antibiotic+resistance+of+Escherichia+coli+in+mature+biofilms.">Increased antibiotic resistance of Escherichia coli in mature biofilms.</a> Applied and Environmental Microbiology. 75, 4093-4100 (2009).</li><li>Witherow, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Ten-Week+Biochemistry+Lab+Project+Studying+Wild-Type+and+Mutant+Bacterial+Alkaline+Phosphatase.">A Ten-Week Biochemistry Lab Project Studying Wild-Type and Mutant Bacterial Alkaline Phosphatase.</a> Biochemistry and Molecular Biology Education. 44 (6), (2016).</li><li>Henthorn, P., Zervos, P., Raducha, M., Harris, H., Kadesch, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+a+human+placental+alkaline+phosphatase+gene+in+transfected+cells:+Use+as+a+reporter+for+studies+of+gene+expression.">Expression of a human placental alkaline phosphatase gene in transfected cells: Use as a reporter for studies of gene expression.</a> Proceedings of the National Academy of Science USA. 85, 6324-6346 (1988).</li><li>Horney, B. 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R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+Skeletal+Alkaline+Phosphatase+in+Osteoporotic+Serum+by+Wheat+Germ+Agglutinin+Precipitation,+Heat+Inactivation,+and+a+Two-Site+Immunoradiometric+Assay.">Quantification of Skeletal Alkaline Phosphatase in Osteoporotic Serum by Wheat Germ Agglutinin Precipitation, Heat Inactivation, and a Two-Site Immunoradiometric Assay.</a> Clinical Chemistry. 40 (9), 1749-1756 (1994).</li><li>O&#8217;Toole, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtiter+Dish+Biofilm+Formation+Assay.">Microtiter Dish Biofilm Formation Assay.</a> Journal of Visualized Experience. , (2011).</li><li>Nomoto, M., Ohsawa, M., Wang, H. L., Chen, C. C., Yeh, K. 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우리의 분석 결과 우리 ALP 기판으로 pNPP를 사용합니다. ELISA를 위한 작업 솔루션 이며 아무 희석이 필요 하다. 높은 산에 의해 가수분해, 후 노란색 제품 개발 하 고 405에서 측정 될 수 있다 nm. 효소 반응의 끝에, 우리는 간단히 96 잘 접시를 centrifuged 하 고 신선한 96 잘 접시 플레이트 리더를 사용 하 여 흡 광도 측정 하는 상쾌한 전송. 우리는이 여분의 원심 분리 단계는 중요 한, 일관성 405에서 흡 광?...

알칼리 성 인산 가수분해 효소 (높은 산)는 모두 간결한 및 진 핵 세포1편 표현 됩니다. 그것은 다른 분자 뉴클레오티드, 단백질, 알 카 로이드, 인산 에스테 르, 인산의 anhydrides 등에서 monophosphate의 가수분해를 촉매 수 있습니다. 인간에서는, 진 핵 ALP는 간, 뼈, 내장과 태 반2를 포함 하 여 많은 조직에 존재. 그것은 단백질 인 산화, 세포 성장, apoptosis, 줄기 세포 프로세스 뿐만 아니라 정상적인 골격 강화에 중요 한 역할을 한다. 진 핵 ALP는 또한 뼈, 간, 그리고 다른 조직/장기 상승 하는 때에 질병의 존재에 대 한 주요 혈 청 지표3,4.
간결한 ALP 토양8에서 대장균5, S. 구 균6,7 및 몇 가지 일반적인 제일 위 박테리아 등 세균성 세포의 다양 한에서 검색 되었습니다. 세균성 ALP 활동은 농약, 중 금속9 및 세균 오염10의 검출 바이오 센서로 사용 되었습니다. ALP의 제정 식 포도 상 구 균11 을 식별 하 고 Serratia Enterobacter12에서 차별화 하는 데 사용 되었습니다. 그것은 추가 제정 ALP 생산 포도 상 구 균13pathogenicity와 상관은 좋습니다. ALP 다른 설정3,4, 공부는 비록 아직 약간 biofilms 문화에 그것의 기능과 활동에 대 한 보고 됩니다.
Biofilm는 그것의 자유 롭 살아있는 세균성 세포 대응14에 비해 다르게 작동 세균성 생활을 문서화 되었습니다. S. 구 균, biofilm의 형성 다양 한 임상 조건 및 항 생 저항 및 만성 염증15,16에 대 한 계정에서에서 확인 되었습니다. 많은 분자 등 다 당 류, 단백질, 핵 산, 지질, biofilm 매트릭스에서 찾을 수 보고 왔다 하지만 biofilm 형성의 메커니즘은 완전히 이해14. Biofilm 형성에서 ALP의 역할을 이해 하려면 우리 미 균 biofilms 96 잘 조직 배양 접시에 배양 하 고 파라-nitrophenylphosphate (pNPP)를 사용 하 여 높은 산 활동 측정.
분자 pNPP 높은 산에 대 한 준비-사용 기판 이며 ALP 활동6,,1718측정에 널리 사용 되었습니다. 이 색도계 분석 결과 파라 nitrophenyl 인산 염 (pNPP)의 변환에 파라-nitrophenol 405에서 색된 제품의 결과를 기반으로 nm. 와 같은 agarose 젤 전기 이동 법19, 밀 세균 agglutinin (WGA) 강 수, WGA HPLC20이 분석 결과 매우 구체적인 다른 기존의 ALP 분석 결과에 비해, 민감한, 쉽게 재현, 그리고 가장 중요 한 것은, 허용 높은 처리량입니다.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>VWR</td>
			<td>9002-18-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Centrifuge</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>5810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gluose</td>
			<td>VWR</td>
			<td>50-99-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH pellets</td>
			<td>VWR</td>
			<td>SS0550-500GR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Para-nitrophenylphosphate (pNPP)&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7998-100ML</td>
			<td>Typical concentrations of pNPP liquid substrates, often used in enzyme-linked immunesorbent assays (ELISA), range between 10 to 50 mM. Similar to most ready-to-use pNPP liquid substrates like the one used here, the exact pNPP concentration is not disclosed due to its proprietary nature.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X PBS, pH7.4. 
			173 mM NaCl, 
			2.7 mM KCl, 
			8 mM Na2HPO4, 
			2 mM KH2PO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P3288-1VL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate Reader</td>
			<td>Biotek</td>
			<td>ELx808</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S. aureus</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>ATCC25923</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptic Soy Agar&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 15g / L TSB</td>
			<td>VWR</td>
			<td>9002-18-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptic Soy Broth:&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; g/L 
			Pancreatic Digest of Casein............ 15.0 
			Papaic Digest of Soyben Meal.........5.00 
			Sodium chloride.............................. 3.00 
			Dextrose........................................&#160; 2.50 
			Dipotassium phosphate..................2.50</td>
			<td>VWR</td>
			<td>90006-098</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well tissue culture plates</td>
			<td>BD</td>
			<td>6902D09</td>
			<td>U shaped bottom</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

colorimetric analysis of alkaline phosphatase activity in s. aureus biofilm

알칼리 성 인산 가수분해 효소 (높은 산) 간결한와 진 핵 세포에서 표현 하는 일반적인 효소 이다. 그것은 인산 염 monoesters 기본 pH에 많은 분자에서의 가수분해를 catalyzes 고 인산 대사에 필수적인 역할을 한다. 인간에서는, 진 핵 ALP cholestasis 구루병 등 다양 한 질병을 진단에 가장 자주 사용된 효소 신호 중 하나입니다. 미 에 균, ALP 세포 막;에 감지 되 그것은 또한 뿐만 아니라 분 비 양식으로 표현 된다. 그러나, 약간 biofilm 형성에서 기능에 대 한 알려져 있다.
이 원고의 목적은 단백질 격리를 필요로 하지 않는 미 균 biofilm에서 ALP 활동 측정을 신속 하 고 신뢰할 수 있는 분석 결과 개발 하는 것입니다. P-nitrophenyl 인산 염 (pNPP)를 사용 하 여 기판으로, 96-잘 조직 배양 배지에서 형성 된 미 균 biofilm에서 ALP 활동을 측정 했습니다. 활동은 405 nm 흡 광도 측정 성 반응 제품의 형성을 기반으로 합니다. 96 잘 조직 문화 접시 방법의 높은 처리량 자연 ALP 활동 분석에 대 한 과민 하 고 재현할 수 있는 방법을 제공합니다. 같은 실험 설정 또한 biofilm 형성에 관련 된 다른 세포 외 분자 마커 측정을 확장할 수 있습니다.

그림 1 96 잘 조직 배양 플레이트에서 미 균 의 biofilm 문화에서 ALP 활동의 대표적인 결과 보여 줍니다. 상업적으로 사용 가능한 pNPP 솔루션의 75 μ 각각 잘 하 고 실 온에서 incubated에 추가 되었습니다. 서로 다른 시간에 대 한 부 화 후 (0 분, 15 분, 30 분, 45 분, 60 분, 및 75 분, 각각) 75 μ 5 M NaOH의 반응을 중지에 추가 되었습니다. 제품은 다음 405에서 ...

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Colorimetric Analysis of Alkaline Phosphatase Activity in S. aureus Biofilm

이 원고에서 우리 96-잘 조직 배양 플레이트에서 미 균 biofilm 문화에서 알칼리 성 인산 가수분해 효소 활동을 계량 하는 높은 처리량 방법 설립

색도계 분석의 알칼리 성 인산 가수분해 효소 활동 S. 구 균 Biofilm에서

Alkaline phosphatase (ALP) is a common enzyme expressed in both prokaryotic and eukaryotic cells. It catalyzes the hydrolysis of phosphate monoesters from ...

이 프로토콜은 S.aureus 생물막 배양에서 알칼화 된 인산염 활성을 측정하는 쉽고 신뢰할 수있는 방법을 제시했다. 그것은 우리가 생물 막 형성에 ALP의 기능을 이해하는 데 도움이 될 것입니다. 이 기술의 주요 장점은 높은 처리량입니다.그것은 매우 민감하고 수행하기 쉽습니다. 절차를 시연하는 것은 하퍼 칼리지의 전 학생 케빈 다니코프스키입니다. TSB를 준비하려면 카제인의 췌장 소화, 콩 식사의 교황 다이제스트, 염화 나트륨, 덱스트로스 및 디포타슘 인산염을 증류수에 추가하십시오.플라스크를 알루미늄 호일로 덮고 오토클레이브에 넣어 사용하기 전에 살균하십시오. TSA를 준비하려면 TSB에 한천을 추가하고 멸균을 위해 오토클레이브에 넣습니다. 그런 다음 실온으로 식힙니다.다음으로, 접시 당 20 밀리리터의 비율로 페트리 접시에 붓습니다. 생물막 배양 배지를 준비하려면, 리터당 10그램의 농도를 달성하기 위해 오토클레이브 TSB에 포도당을 첨가한다. 진공 여과 키트를 사용하여 0.2 마이크로미터 모공 크기의 필터로 용액을 여과합니다.접종을 하려면, 페트리 접시에서 Staph 아우레우스의 한 개별 식민지를 선택하고 TSB의 10 밀리리터로 가득 배양 튜브에 배치 하기 위해 살균 접종 루프를 사용 하 여. 인큐베이터에 튜브를 넣고 섭씨 37도에서 하룻밤 사이에 자랍니다. 마이크로피펫으로, 하룻밤 문화의 100 마이크로리터를 뽑고 1:100 부피 비율 희석을 위해 포도당으로 TSB의 10 밀리리터로 채워진 배양 튜브로 전송합니다.소용돌이는 부드럽게 혼합하여 일관된 농도를 제공합니다. 마이크로파이프를 사용하여 희석 배양 200마이크로리터를 96개의 웰 플레이트에서 총 18개의 우물로 옮기습니다. 생물막 형성을 위해 24 시간 동안 섭씨 37도에서 96 웰 플레이트를 배양하십시오.S.aureus의 최고의 생물 막 형성을 위해, 평면 또는 라운드 하단 96 웰 플레이트를 선택하는 것이 좋습니다. 그 후, 약간 각 우물의 가장자리에서 포부에 의해 상수에 의해 상수에 접시를 기울입니다. 1X PBS로 각 것을 잘 씻으시면 됩니다.원심분리기에 플레이트를 넣고 분당 8, 000 회전에서 5분 동안 회전하고 포부로 상수판을 장식합니다. 각 웰에 시판되는 PNPP로 구성된 버퍼링된 ALP 기판 75마이크로리터를 추가하고 타이머를 사용하여 트리플리케이트의 매 시간 지점을 기록합니다. 각 잠복 시점 후, 5개의 어금니 나트륨 수산화나트륨 75마이크로리터를 3개의 우물각각에 추가하여 반응을 멈춥춥시다.분당 800 회전에서 5 분 동안 접시를 원심 분리합니다. 파이펫을 사용하여 100 마이크로리터의 체온화를 새로운 96 웰 플레이트로 전송하여 칼로리 측정을 합니다. 96 웰 플레이트 리더기를 사용하여 405 나노미터에서 각 웰의 흡광도를 측정합니다.30분 시간 점 유정을 사용하여 배경 노이즈를 제어합니다. 세 개의 96 웰 플레이트에서 전체 실험을 반복합니다. 이 프로토콜은 단백질 절연을 필요로하지 않는 S.aureus 생물막에서 ALP 활성을 측정하기 위해 빠르고 신뢰할 수있는 분석기를 개발한다.ALP 활동의 대표적인 결과는 최대 75분 동안 증가된 추세를 보여줍니다. 75분 후 ALP 활성의 증가가 관찰되지 않았다. 좋은 생물막 문화를 확립하는 것이 매우 중요하며 마스터하는 데 꽤 많은 시험이 필요할 수 있습니다.이전에 당사 와 다른 사람들이 보고한 것처럼 크리스탈 보라색 분석기를 수행하여 생물막 형성을 확인할 수 있거나 생물막 형성을 용이하게 하기 위해 인간 플라즈마로 플레이트를 사전 치료할 수 있습니다. 개발 후 생물막 형성을 방해할 수 있는 잠재적ALP 억제제를 검사할 수 있습니다. 그 결과 의료 분야의 생물막 관리에 중요한 정보를 제공할 것입니다.5개의 어금니 나트륨수산화나트륨은 접촉시 위험할 수 있습니다. 취급 시 개인 보호 장비를 착용하십시오.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Colorimetric Analysis of Alkaline Phosphatase Activity in S. aureus Biofilm

Quantification of Global Diastolic Function by Kinematic Modeling-based Analysis of Transmitral Flow via the Parametrized Diastolic Filling Formalism

매개 변수화 이완기 충전 형식주의를 통해 Transmitral 흐름의 운동 학적 모델링 기반의 분석에 의하여 세계적인 이완기 기능의 정량화

Quantitative cardiac function assessment remains a challenge for physiologists and clinicians.&#160;Although historically invasive methods have comprised ...

연구

생체공학

Protocol for Biofilm Streamer Formation in a Microfluidic Device with Micro-pillars

마이크로 기둥 미세 유체 장치에서 바이오 필름 보리 형성을위한 프로토콜

Several bacterial species possess the ability to attach to surfaces and colonize them in the form of thin films called biofilms. Biofilms that grow in ...

Real-time Visualization and Analysis of Chondrocyte Injury Due to Mechanical Loading in Fully Intact Murine Cartilage Explants

실시간 시각화 및 Chondrocyte 부상 때문에 완전히 그대로 Murine 연골 Explants 기계적 부하의 분석

Homeostasis of articular cartilage depends on the viability of resident cells (chondrocytes). Unfortunately, mechanical trauma can induce widespread ...

A Zebrafish Embryo Model for In Vivo Visualization and Intravital Analysis of Biomaterial-associated Staphylococcus aureus Infection

A Zebrafish Embryo Model for In Vivo Visualization and Intravital Analysis of Biomaterial-associated Staphylococcus aureus Infection

Zebrafish 태아 모델 Vivo 시각화 및 Intravital 소재 분석 관련 된 황색 포도상구균 에 감염

Biomaterial-associated infection (BAI) is a major cause of the failure of biomaterials/medical devices. Staphylococcus aureus is one of the major ...

High-resolution Patterned Biofilm Deposition Using pDawn-Ag43

고해상도 무늬 Biofilm 증 착을 사용 하 여 pDawn-Ag43

Spatial structure and patterning play an important role in bacterial biofilms. Here we demonstrate an accessible method for culturing E. coli biofilms ...

Measuring Global Cellular Matrix Metalloproteinase and Metabolic Activity in 3D Hydrogels

글로벌 세포 매트릭스 Metalloproteinase 및 3D Hydrogels 신진 대사 활동 측정

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