Name: colorimetric analysis of alkaline phosphatase activity in s. aureus biofilm
Uploaded: 2019-04-12T15:00:00
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Agradecemos a William Rainey Harper College e a Universidade de Illinois em Chicago para a facilidade de conduzir as experiências. Agradecemos também o McGraw Hill Foundation por seu apoio generoso.

1. preparação média
<ol><li>Preparar 1 L de Tryptic Soy caldo (TSB): em 1 L de água destilada, adicione 15 g de digerir pancreático de caseína, 5g de papaic digest de farelo de soja, 3 g de cloreto de sódio, 2,5 g de dextrose e 2,5 g de fosfato dipotássico. Esterilize antes do uso.</li>
	<li>Para Tryptic Soy Agar (TSA), adicione 15 g de ágar-ágar para 1 L de TSB, autoclave. Então deixe esfriar até a temperatura de quarto. Em seguida, despeje em uma proporção de 20 mL por placa de Petri (100 x 15 mm).</li>...

<ol>
	<li>Coleman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+mechanism+of+alkaline+phosphatase.">Structure and mechanism of alkaline phosphatase.</a> Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 21, 441-483 (1992).</li><li>Sharma, U., Pal, D., Prasad, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alkaline+Phosphatase:+An+Overview.">Alkaline Phosphatase: An Overview.</a> Indian Journal of Clinical Biochemistry. 29 (3), 269-278 (2014).</li><li>Mitchell, M. 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C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biofilms:+an+emergent+form+of+bacterial+life.">Biofilms: an emergent form of bacterial life.</a> Nature Reviews Microbiology. 14, 563-575 (2016).</li><li>Hoiby, N., Bjarnsholt, T., Givskov, M., Molin, S., Ciofu, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibiotic+resistance+of+bacterial+biofilms.">Antibiotic resistance of bacterial biofilms.</a> International Journal of Antimicrobial Agents. 35, 322-332 (2010).</li><li>Ito, A., Taniuchi, A., May, T., Kawata, K., Okabe, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+antibiotic+resistance+of+Escherichia+coli+in+mature+biofilms.">Increased antibiotic resistance of Escherichia coli in mature biofilms.</a> Applied and Environmental Microbiology. 75, 4093-4100 (2009).</li><li>Witherow, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Ten-Week+Biochemistry+Lab+Project+Studying+Wild-Type+and+Mutant+Bacterial+Alkaline+Phosphatase.">A Ten-Week Biochemistry Lab Project Studying Wild-Type and Mutant Bacterial Alkaline Phosphatase.</a> Biochemistry and Molecular Biology Education. 44 (6), (2016).</li><li>Henthorn, P., Zervos, P., Raducha, M., Harris, H., Kadesch, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+a+human+placental+alkaline+phosphatase+gene+in+transfected+cells:+Use+as+a+reporter+for+studies+of+gene+expression.">Expression of a human placental alkaline phosphatase gene in transfected cells: Use as a reporter for studies of gene expression.</a> Proceedings of the National Academy of Science USA. 85, 6324-6346 (1988).</li><li>Horney, B. 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W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+Characterization+of+Extracellular+Alkaline+Phosphatase+from+an+Alkalophilic+Bacterium.">Purification and Characterization of Extracellular Alkaline Phosphatase from an Alkalophilic Bacterium.</a> Agricultural and Biological Chemistry. 52 (7), 1643-1647 (1988).</li></ol>

No nosso ensaio, usamos pNPP como o substrato ALP. Esta é uma solução de trabalho projetada para ELISA e a diluição não é necessária. Após a hidrólise por ALP, um produto amarelo desenvolve e pode ser medido em 405 nm. No final da reação enzimática, brevemente centrifugadas a placa bem 96 e transferido o sobrenadante para um prato bem 96 fresco para medir a absorvância usando o leitor de placa. Achamos que essa etapa de centrifugação extra é crítica, pois aumenta a consistência de absorbância em 405 n...

Fosfatase alcalina (FAL ou ALP) ubiquitously é expresso em ambas as células procariotas e eucariotas1. Isso pode catalisar a hidrólise de monofosfato de moléculas diferentes, tais como nucleotídeos, proteínas, alcaloides, ésteres de fosfato e anidridos de ácido fosfórico. Em humanos, ALP eucariótica está presente em muitos tecidos, incluindo fígado, ossos, intestino e placenta2. Ela desempenha papel importante na fosforilação de proteínas, bem como do crescimento celular, apoptose, processos de células-tronco e mineralização óssea normal. Eucariótica ALP é um indicador chave do soro para a presença de doenças nos ossos, fígado e outros tecidos/órgãos quando elevada3,4.
ALP procariótica foi detectada em uma variedade de células bacterianas, incluindo e. coli5,6,de S. aureus7 e algumas bactérias do rúmen comum no solos8. Atividade bacteriana de ALP tem sido usada como um biossensor na detecção de pesticidas, metais pesados9 e contaminação bacteriana10. A expressão constitutiva de ALP tem sido usada para identificar os estafilococos11 e para diferenciar Serratia Enterobacter12. Sugere-se ainda mais que a produção de ALP constitutiva está correlacionada com patogenicidade em estafilococos13. Embora o ALP tem sido estudada em diferentes configurações3,4, ainda pouco é relatado pela sua atividade e função em culturas de biofilmes.
Um biofilme tem sido documentado para ter uma vida diferente funcionamento bacteriana em comparação com o seu homólogo de vida livre célula bacteriana14. Em S. aureus, a formação de biofilme foi identificada em uma variedade de condições clínicas e contas para a resistência aos antibióticos e inflamação crônica15,16. Muitas moléculas tinham sido relatadas para ser encontrado em uma matriz de biofilme como polissacarídeos, proteínas, ácidos nucleicos e lipídios, mas o mecanismo de formação de biofilme não é totalmente compreendida14. Para entender o papel de ALP na formação de biofilmes, nós cultivadas biofilmes de S. aureus em placas de cultura de pocos 96 e mede a atividade ALP usando pará-nitrofenilfosfato (pNPP).
A molécula pNPP é um substrato de ready-to-use para ALP e tem sido amplamente utilizado para medir a atividade ALP6,17,18. Este ensaio colorimétrico baseia-se na conversão de pará-nitrofenil fosfato (pNPP) para pará-nitrofenol, resultando em um produto colorido em 405 nm. Comparado a outro ensaio ALP convencional, tais como eletroforese19, precipitação de aglutininas (WGA) de germe de trigo, do gel de agarose e WGA-HPLC20, este ensaio é altamente específico, sensível, fácil de reproduzir e mais importante, permite para alta taxa de transferência.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>VWR</td>
			<td>9002-18-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Centrifuge</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>5810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gluose</td>
			<td>VWR</td>
			<td>50-99-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH pellets</td>
			<td>VWR</td>
			<td>SS0550-500GR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Para-nitrophenylphosphate (pNPP)&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7998-100ML</td>
			<td>Typical concentrations of pNPP liquid substrates, often used in enzyme-linked immunesorbent assays (ELISA), range between 10 to 50 mM. Similar to most ready-to-use pNPP liquid substrates like the one used here, the exact pNPP concentration is not disclosed due to its proprietary nature.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X PBS, pH7.4. 
			173 mM NaCl, 
			2.7 mM KCl, 
			8 mM Na2HPO4, 
			2 mM KH2PO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P3288-1VL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate Reader</td>
			<td>Biotek</td>
			<td>ELx808</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S. aureus</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>ATCC25923</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptic Soy Agar&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 15g / L TSB</td>
			<td>VWR</td>
			<td>9002-18-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptic Soy Broth:&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; g/L 
			Pancreatic Digest of Casein............ 15.0 
			Papaic Digest of Soyben Meal.........5.00 
			Sodium chloride.............................. 3.00 
			Dextrose........................................&#160; 2.50 
			Dipotassium phosphate..................2.50</td>
			<td>VWR</td>
			<td>90006-098</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well tissue culture plates</td>
			<td>BD</td>
			<td>6902D09</td>
			<td>U shaped bottom</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

colorimetric analysis of alkaline phosphatase activity in s. aureus biofilm

Fosfatase alcalina (FAL ou ALP) é uma enzima comum expressada em células procariotas e eucariotas. Ele catalisa a hidrólise de monoésteres de fosfato de muitas moléculas em pH básico e desempenha um papel indispensável no metabolismo de fosfato. Nos seres humanos, eucariótica ALP é um dos sinais de enzimática mais frequentemente utilizados no diagnóstico de várias doenças, tais como colestase e raquitismo. Em S. aureus, ALP é detectado exclusivamente na membrana celular; também é expressa como uma forma secretória também. No entanto, pouco se sabe sobre sua função na formação de biofilme.
O objetivo deste manuscrito é desenvolver um ensaio rápido e confiável para medir a atividade da ALP em S. aureus biofilme que não necessita de isolamento da proteína. Usando p-nitrofenil fosfato (pNPP) como substrato, medimos a atividade da ALP em S. aureus biofilme formado em placas de cultura de tecidos de 96 poços. Atividade baseou-se na formação do produto solúvel reação medido por 405 absorvância nm. A natureza de alta taxa de transferência do método 96 cultura pocos placa fornece um método sensível e reprodutível para ensaios de atividade ALP. O mesmo experimental setup também pode ser estendido para medir outros marcadores moleculares extracelulares relacionados à formação de biofilme.

A Figura 1 mostra um resultado representativo da atividade da ALP de biofilme culturas de S. aureus em placas de cultura de pocos 96. 75 μL de solução de pNPP disponível comercialmente foi adicionado para cada bem e incubados à temperatura ambiente. Após incubação de diferentes épocas (0 min, 15 min, 30 min, 45 min, 60 min e 75 min, respectivamente) 75 μL de 5 M de NaOH foi adicionado para parar a reação. O produto então foi medido em um...

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Colorimetric Analysis of Alkaline Phosphatase Activity in S. aureus Biofilm

Neste manuscrito, estabelecemos um método de alto throughput para quantificar a atividade da fosfatase alcalina na cultura de S. aureus biofilme da placa de 96 poços de cultura de tecidos

Colorimétrico análise de alcalina fosfatase atividade no biofilme de S. aureus

Alkaline phosphatase (ALP) is a common enzyme expressed in both prokaryotic and eukaryotic cells. It catalyzes the hydrolysis of phosphate monoesters from ...

Este protocolo apresentou um método fácil e confiável para medir a atividade fosfattase alcaalizada na cultura biofilme S.aureus. Isso nos ajudará a entender a função da ALP na formação de biofilmes. A maior vantagem dessa técnica é o alto rendimento.É muito sensível e fácil de realizar. Demonstrando o procedimento estará Kevin Danikowski, um ex-aluno da Harper College. Para preparar a TSB, adicione o digestor pancreático da caseína, o digestão papaic da farelo de soja, cloreto de sódio, dextrose e fosfato de dipotassium em água destilada.Cubra o frasco com papel alumínio e coloque-o em uma autoclave para esterilizar antes de usar. Para preparar um TSA, adicione ágar ao TSB e coloque-o na autoclave para esterilização. Então deixe esfriar até a temperatura ambiente.Em seguida, despeje-o na placa de Petri a uma proporção de 20 mililitros por prato. Para preparar um meio de cultura de biofilme, adicione glicose ao TSB autoclavado para alcançar a concentração de 10 gramas por litro. Usando um kit de filtragem de vácuo, filtrar a solução com um filtro de tamanho de poro de 0,2 micômetro.Para inocular, use um laço de inoculação esterilizado para escolher uma colônia individual de Staph aureus da placa de Petri e colocá-la no tubo de cultura preenchido com 10 mililitros de TSB. Coloque o tubo na incubadora para crescer durante a noite a 37 graus Celsius. Com uma micropipette, desenhe 100 microliters de cultura durante a noite e transfira-o para um tubo de cultura cheio de 10 mililitros de TSB com glicose para uma diluição de proporção de volume de 1:100.Vórtice suavemente para misturar para uma concentração consistente. Use uma micropipette para transferir 200 microliters de cultura diluída em um total de 18 poços de uma placa de poço de 96. Incubar a placa de 96 poços a 37 graus Celsius durante 24 horas para formação de biofilme.Para a melhor formação de biofilme de S.aureus, é melhor escolher uma placa de fundo 96 plana ou redonda. Depois disso, incline ligeiramente a placa para decantar o sobrenante por aspiração da borda de cada poço. Lave cada poço com 1X PBS.Coloque a placa na centrífuga para girar por cinco minutos a 8.000 revoluções por minuto e decante o supernatante por aspiração. Adicione 75 microliters de substrato ALP tamponado que consiste em PNPP comercialmente disponível para cada poço e use um temporizador para registrar cada ponto de tempo em triplicado. Após cada ponto de tempo de incubação, adicione 75 microlitadores de cinco hidróxido de sódio molar a cada um dos três poços para parar a reação.Centrifugar a placa por cinco minutos a 800 revoluções por minuto. Use uma pipeta para transferir 100 microliters de supernascer em uma nova placa de poço 96 para medição calórica. Use um leitor de placas de 96 poços para medir a absorção de cada poço em 405 nanômetros.Use os poços de ponto de tempo de 30 minutos para controlar o ruído de fundo. Repita todo o experimento em três placas de 96 poços. Este protocolo desenvolve um ensaio rápido e confiável para medir a atividade da ALP no biofilme S.aureus que não requer isolamento de proteínas.O resultado representativo da atividade da ALP mostra uma tendência crescente de até 75 minutos. Após 75 minutos, não foi observado aumento da atividade da ALP. É muito importante estabelecer uma boa cultura de biofilm e pode levar alguns testes para dominar.Você pode confirmar a formação de biofilmes realizando ensaios violeta cristalinas como relatado anteriormente por nós e outros ou você pode pré-tratar a placa com plasma humano para facilitar a formação de biofilm. Após seu desenvolvimento, você pode rastrear potenciais inibidores de ALP que podem interferir na formação de biofilmes. O resultado fornecerá informações importantes para o gerenciamento de biofilmes na área médica.Cinco hidróxido de sódio molar podem ser perigosos em caso de contato. Certifique-se de usar equipamento de proteção individual durante o manuseio.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Colorimetric Analysis of Alkaline Phosphatase Activity in S. aureus Biofilm

Quantification of Global Diastolic Function by Kinematic Modeling-based Analysis of Transmitral Flow via the Parametrized Diastolic Filling Formalism

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Quantitative cardiac function assessment remains a challenge for physiologists and clinicians.&#160;Although historically invasive methods have comprised ...

Bioengenharia

Protocol for Biofilm Streamer Formation in a Microfluidic Device with Micro-pillars

Protocolo para a formação de biofilme Streamer em um dispositivo micro com micro-pilares

Several bacterial species possess the ability to attach to surfaces and colonize them in the form of thin films called biofilms. Biofilms that grow in ...

Real-time Visualization and Analysis of Chondrocyte Injury Due to Mechanical Loading in Fully Intact Murine Cartilage Explants

Visualização em tempo real e análise do condrócito prejuízo devido ao carregamento mecânico em explantes de cartilagem murino totalmente intacta

Homeostasis of articular cartilage depends on the viability of resident cells (chondrocytes). Unfortunately, mechanical trauma can induce widespread ...

A Zebrafish Embryo Model for In Vivo Visualization and Intravital Analysis of Biomaterial-associated Staphylococcus aureus Infection

A Zebrafish Embryo Model for In Vivo Visualization and Intravital Analysis of Biomaterial-associated Staphylococcus aureus Infection

Um modelo de embrião de Zebrafish para na visualização de Vivo e Intravital análise de biomateriais-associado Staphylococcus aureus infecção

Biomaterial-associated infection (BAI) is a major cause of the failure of biomaterials/medical devices. Staphylococcus aureus is one of the major ...

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PDawn-Ag43 modelado usando de deposição de biofilme em alta resolução

Spatial structure and patterning play an important role in bacterial biofilms. Here we demonstrate an accessible method for culturing E. coli biofilms ...

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Medição de metaloproteinase matriz celular Global e atividade metabólica em hidrogel 3D

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