Name: colorimetric analysis of alkaline phosphatase activity in s. aureus biofilm
Uploaded: 2019-04-12T15:00:00
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Agradecemos a Guillermo Rainey Harper College y la Universidad de Illinois en Chicago para la facilidad de llevar a cabo estos experimentos. También agradecemos a McGraw Hill Foundation por su generoso apoyo.

1. medio preparación
<ol><li>Preparar 1 L de caldo de soja tríptica (TSB): en 1 L de agua destilada, agregar 15 g de digerido pancreático de caseína, 5 g de papaic recopilación de harina de soja, 3 g de cloruro sódico, 2,5 g de dextrosa y 2.5 g de fosfato dipotásico. Esterilizar antes de uso.</li>
	<li>Para Agar peptona de soja (TSA), añadir 15 g de agar en 1 L de TSB, autoclave. Luego déjelo enfriar a temperatura ambiente. A continuación, vierta en una proporción de 20 mL por placa de Petri (100 x 15 mm).</...

<ol>
	<li>Coleman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+mechanism+of+alkaline+phosphatase.">Structure and mechanism of alkaline phosphatase.</a> Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 21, 441-483 (1992).</li><li>Sharma, U., Pal, D., Prasad, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alkaline+Phosphatase:+An+Overview.">Alkaline Phosphatase: An Overview.</a> Indian Journal of Clinical Biochemistry. 29 (3), 269-278 (2014).</li><li>Mitchell, M. 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C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biofilms:+an+emergent+form+of+bacterial+life.">Biofilms: an emergent form of bacterial life.</a> Nature Reviews Microbiology. 14, 563-575 (2016).</li><li>Hoiby, N., Bjarnsholt, T., Givskov, M., Molin, S., Ciofu, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibiotic+resistance+of+bacterial+biofilms.">Antibiotic resistance of bacterial biofilms.</a> International Journal of Antimicrobial Agents. 35, 322-332 (2010).</li><li>Ito, A., Taniuchi, A., May, T., Kawata, K., Okabe, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+antibiotic+resistance+of+Escherichia+coli+in+mature+biofilms.">Increased antibiotic resistance of Escherichia coli in mature biofilms.</a> Applied and Environmental Microbiology. 75, 4093-4100 (2009).</li><li>Witherow, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Ten-Week+Biochemistry+Lab+Project+Studying+Wild-Type+and+Mutant+Bacterial+Alkaline+Phosphatase.">A Ten-Week Biochemistry Lab Project Studying Wild-Type and Mutant Bacterial Alkaline Phosphatase.</a> Biochemistry and Molecular Biology Education. 44 (6), (2016).</li><li>Henthorn, P., Zervos, P., Raducha, M., Harris, H., Kadesch, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+a+human+placental+alkaline+phosphatase+gene+in+transfected+cells:+Use+as+a+reporter+for+studies+of+gene+expression.">Expression of a human placental alkaline phosphatase gene in transfected cells: Use as a reporter for studies of gene expression.</a> Proceedings of the National Academy of Science USA. 85, 6324-6346 (1988).</li><li>Horney, B. 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R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+Skeletal+Alkaline+Phosphatase+in+Osteoporotic+Serum+by+Wheat+Germ+Agglutinin+Precipitation,+Heat+Inactivation,+and+a+Two-Site+Immunoradiometric+Assay.">Quantification of Skeletal Alkaline Phosphatase in Osteoporotic Serum by Wheat Germ Agglutinin Precipitation, Heat Inactivation, and a Two-Site Immunoradiometric Assay.</a> Clinical Chemistry. 40 (9), 1749-1756 (1994).</li><li>O&#8217;Toole, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtiter+Dish+Biofilm+Formation+Assay.">Microtiter Dish Biofilm Formation Assay.</a> Journal of Visualized Experience. , (2011).</li><li>Nomoto, M., Ohsawa, M., Wang, H. L., Chen, C. C., Yeh, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+Characterization+of+Extracellular+Alkaline+Phosphatase+from+an+Alkalophilic+Bacterium.">Purification and Characterization of Extracellular Alkaline Phosphatase from an Alkalophilic Bacterium.</a> Agricultural and Biological Chemistry. 52 (7), 1643-1647 (1988).</li></ol>

En nuestro análisis, hemos utilizado pNFF como el sustrato de la fosfatasa alcalina. Se trata de una solución de trabajo diseñada para ELISA y dilución no es necesario. Después de la hidrólisis por ALP, un producto amarillo se desarrolla y puede ser medido a 405 nm. Al final de la reacción enzimática, brevemente se centrifugó la placa bien 96 y transfirió el sobrenadante a un plato bien 96 fresco para medir absorbancia con el lector. Se encontró que este paso de centrifugado extra es crítica, puesto que aumen...

Fosfatasa alcalina (ALP) ubicuo se expresa en tanto de células procariotas y eucariotas1. Puede catalizar la hidrólisis de monofosfato de diferentes moléculas como nucleótidos, proteínas, alcaloides, ésteres de fosfato y anhídridos del ácido fosfórico. En los seres humanos, ALP eucariota está presente en muchos tejidos incluyendo el hígado, hueso, intestino y placenta2. Juega un papel importante en la fosforilación de proteínas, crecimiento de la célula, apoptosis, la célula de vástago procesos así como mineralización esquelética normal. ALP eucariota es también un indicador clave del suero para la presencia de enfermedades en huesos, hígado y otros tejidos/órganos cuando elevada3,4.
ALP procariota se ha detectado en una variedad de células bacterianas, incluyendo5de e. coli, S. aureus6,7 y algunas bacterias de rumen común en los suelos8. Actividad de fosfatasa alcalina bacteriana ha sido utilizado como un biosensor en la detección de pesticidas, metales pesados9 y10de contaminación bacteriana. La expresión constitutiva de ALP se ha utilizado para identificar estafilococos11 y diferenciar Serratia de Enterobacter12. Se sugirió que la producción constitutiva de ALP está correlacionado con patogenicidad en estafilococos13. Aunque ALP ha sido estudiado en diferentes configuraciones3,4, sin embargo, poco se divulga para su actividad y función en las culturas de los biofilms.
El biofilm se ha documentado para tener una diferente funcionamiento vida bacteriana en comparación con su contraparte de célula bacteriana libre-que viven14. En S. aureus, la formación de biofilm se ha identificado en una variedad de condiciones clínicas y representa la resistencia a los antibióticos y la inflamación crónica15,16. Muchas moléculas habían sido divulgadas en una matriz de la biopelícula como polisacáridos, proteínas, ácidos nucleicos y lípidos, pero el mecanismo de formación de biofilm no es completamente entendido14. Para entender el papel de ALP en la formación de biopelículas, cultivadas de biopelículas de S. aureus en placas de cultivo de tejidos bien 96 y mide la actividad de fosfatasa alcalina usando para-nitrophenylphosphate (pNFF).
La molécula pNFF está lista para usar sustrato para fosfatasa alcalina y ha sido ampliamente utilizado para medir la actividad ALP6,17,18. Este ensayo colorimétrico se basa en la conversión para-nitrofenil fosfato (pNFF) de para-nitrofenol resultando en un producto coloreado a 405 nm. En comparación con otros análisis de fosfatasa alcalina convencional, tales como gel de agarosa electroforesis19, precipitación de (WGA) de la aglutinina de germen de trigo, y WGA-HPLC20, este análisis es altamente específico, sensible, fácil de reproducir y más importante, permite la alta rendimiento de procesamiento.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>VWR</td>
			<td>9002-18-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Centrifuge</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>5810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gluose</td>
			<td>VWR</td>
			<td>50-99-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH pellets</td>
			<td>VWR</td>
			<td>SS0550-500GR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Para-nitrophenylphosphate (pNPP)&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7998-100ML</td>
			<td>Typical concentrations of pNPP liquid substrates, often used in enzyme-linked immunesorbent assays (ELISA), range between 10 to 50 mM. Similar to most ready-to-use pNPP liquid substrates like the one used here, the exact pNPP concentration is not disclosed due to its proprietary nature.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X PBS, pH7.4. 
			173 mM NaCl, 
			2.7 mM KCl, 
			8 mM Na2HPO4, 
			2 mM KH2PO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P3288-1VL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate Reader</td>
			<td>Biotek</td>
			<td>ELx808</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S. aureus</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>ATCC25923</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptic Soy Agar&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 15g / L TSB</td>
			<td>VWR</td>
			<td>9002-18-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptic Soy Broth:&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; g/L 
			Pancreatic Digest of Casein............ 15.0 
			Papaic Digest of Soyben Meal.........5.00 
			Sodium chloride.............................. 3.00 
			Dextrose........................................&#160; 2.50 
			Dipotassium phosphate..................2.50</td>
			<td>VWR</td>
			<td>90006-098</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well tissue culture plates</td>
			<td>BD</td>
			<td>6902D09</td>
			<td>U shaped bottom</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

colorimetric analysis of alkaline phosphatase activity in s. aureus biofilm

Fosfatasa alcalina (ALP) es una enzima común expresada en las células procariotas y eucariotas. Cataliza la hidrólisis de Monoésteres de fosfato de muchas moléculas en pH básico y juega un papel indispensable en el metabolismo del fosfato. En los seres humanos, ALP eucariota es una de las señales enzimáticas más frecuente en el diagnóstico de varias enfermedades, tales como colestasis y raquitismo. En S. aureus, ALP se detecta exclusivamente en la membrana de la célula; también se expresa como forma secretora. Sin embargo, poco se sabe sobre su función en la formación de biopelículas.
El objetivo de este manuscrito es desarrollar un análisis rápido y fiable para medir la actividad ALP en biofilm de S. aureus que no requiere aislamiento de proteínas. Utilizando p-nitrofenil fosfato (pNFF) como sustrato, se evaluó la actividad ALP en biofilm de S. aureus en placas de cultivo de tejidos de 96 pocillos. Actividad se basa en la formación del producto de la reacción soluble midiendo absorbancia nm 405. La naturaleza de alto rendimiento del método de placa de 96 bien cultura de tejido proporciona un método sensible y reproducible para ensayos de actividad de la ALP. La misma experimental establecido puede ampliarse también para medir otros marcadores moleculares extracelulares relacionadas con la formación de biopelículas.

La figura 1 muestra un resultado representativo de la actividad de la ALP de culturas de biofilm de S. aureus en placas de cultivo de tejidos bien 96. 75 μL de solución de pNFF comercialmente disponibles se añadió a cada pozo y se incubó a temperatura ambiente. Después de la incubación para diferentes tiempos (0 min, 15 min, 30 min, 45 min, 60 min y 75 min, respectivamente) 75 μL de NaOH M 5 fue agregado para detener la reacción. El producto...

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Colorimetric Analysis of Alkaline Phosphatase Activity in S. aureus Biofilm

En este manuscrito, hemos establecido un método de alto rendimiento para cuantificar la actividad de la fosfatasa alcalina en la cultura de biofilm de S. aureus de placa de 96 pocillos cultivo de tejido

Colorimétrico análisis de alcalina fosfatasa actividad biofilm de S. aureus

Alkaline phosphatase (ALP) is a common enzyme expressed in both prokaryotic and eukaryotic cells. It catalyzes the hydrolysis of phosphate monoesters from ...

Este protocolo presentaba un método fácil y fiable para medir la actividad de fosfatasa alcalinizada en el cultivo de biopelícula S.aureus. Nos ayudará a entender la función de LA ALP en la formación de biopelículas. La principal ventaja de esta técnica es el alto rendimiento.Es muy sensible y fácil de realizar. Demostrando el procedimiento estará Kevin Danikowski, un ex estudiante del Harper College. Para preparar TSB, agregue el digerido pancreático de caseína, el digerido papaico de la harina de soja, el cloruro de sodio, la dextrosa y el fosfato de dipotassio en agua destilada.Cubra el matraz con papel de aluminio y colótelo en un autoclave para esterilizarlo antes de usarlo. Para preparar una TSA, agregue el agar a TSB y colótelo en el autoclave para su esterilización. Luego déjelo enfriar a temperatura ambiente.A continuación, vierta en el plato de Petri en una proporción de 20 mililitros por plato. Para preparar un medio de cultivo de biopelícula, añadir glucosa a TSB autoclavado para lograr la concentración de 10 gramos por litro. Con un kit de filtración al vacío, filtre la solución con un filtro de 0,2 micrómetros de tamaño de poro.Para inocular, utilice un bucle de inoculación esterilizado para recoger una colonia individual de Staph aureus de la placa Petri y colóquela en el tubo de cultivo lleno de 10 mililitros de TSB. Ponga el tubo en la incubadora para crecer durante la noche a 37 grados centígrados. Con una micropipeta, extraiga 100 microlitros de cultivo nocturno y transfiéralo a un tubo de cultivo lleno de 10 mililitros de TSB con glucosa para una dilución de la relación de volumen de 1:100.Vórtice suavemente para mezclar para una concentración constante. Utilice una micropipeta para transferir 200 microlitros de cultivo diluido a un total de 18 pozos de una placa de 96 pozos. Incubar la placa de 96 pozos a 37 grados Centígrados durante 24 horas para la formación de biopelículas.Para la mejor formación de biopelícula de S.aureus, es mejor elegir una placa plana o redonda inferior de 96 pozos. Después de eso, incline ligeramente la placa para decantar el sobrenadante por aspiración desde el borde de cada pozo. Lave cada pozo con 1X PBS.Ponga el plato en la centrífuga para girar durante cinco minutos a 8.000 revoluciones por minuto y decantar el sobrenadante por aspiración. Añadir 75 microlitros de sustrato ALP tamponado que consiste en PNPP disponible comercialmente a cada pozo y utilizar un temporizador para registrar cada punto de tiempo en triplicado. Después de cada punto de tiempo de incubación, agregue 75 microlitros de cinco molares de hidróxido de sodio a cada uno de los tres pozos para detener la reacción.Centrifugar la placa durante cinco minutos a 800 revoluciones por minuto. Utilice una pipeta para transferir 100 microlitros de sobrenadante a una nueva placa de 96 pozos para la medición calorimétrica. Utilice un lector de placas de 96 pozos para medir la absorbancia de cada pozo a 405 nanómetros.Utilice los pozos de punto de tiempo de 30 minutos para controlar el ruido de fondo. Repita todo el experimento en tres placas de 96 pozos. Este protocolo desarrolla un ensayo rápido y fiable para medir la actividad de ALP en biopelícula S.aureus que no requiere aislamiento proteico.El resultado representativo de la actividad de ALP muestra una tendencia creciente de hasta 75 minutos. Después de 75 minutos, no se observó ningún aumento de la actividad de ALP. Es muy importante establecer un buen cultivo de biopelícula y puede tomar bastantes ensayos para dominar.Puede confirmar la formación de biopelículas realizando ensayos de cristal violeta como ya informamos nosotros y otros o puede pretratar la placa con plasma humano para facilitar la formación de biopelículas. Después de su desarrollo, puede detectar posibles inhibidores de la ALP que podrían interferir en la formación de biopelículas. El resultado proporcionará información importante para el manejo de biopelículas en el campo médico.Cinco molares de hidróxido de sodio pueden ser peligrosos en caso de contacto. Asegúrese de usar equipo de protección personal al manipular.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Colorimetric Analysis of Alkaline Phosphatase Activity in S. aureus Biofilm

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La cuantificación de la función diastólica por Global Análisis basado en Modelado cinemático de flujo transmitral mediante el formalismo de llenado diastólico parametrizada

Quantitative cardiac function assessment remains a challenge for physiologists and clinicians.&#160;Although historically invasive methods have comprised ...

Investigación

Bioingeniería

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Protocolo para Biofilm Streamer Formación en un dispositivo de microfluidos con Micro-pilares

Several bacterial species possess the ability to attach to surfaces and colonize them in the form of thin films called biofilms. Biofilms that grow in ...

Real-time Visualization and Analysis of Chondrocyte Injury Due to Mechanical Loading in Fully Intact Murine Cartilage Explants

Visualización en tiempo real y análisis de la lesión de condrocitos debido a cargas mecánicas en explantes de cartílago murino intacta

Homeostasis of articular cartilage depends on the viability of resident cells (chondrocytes). Unfortunately, mechanical trauma can induce widespread ...

A Zebrafish Embryo Model for In Vivo Visualization and Intravital Analysis of Biomaterial-associated Staphylococcus aureus Infection

A Zebrafish Embryo Model for In Vivo Visualization and Intravital Analysis of Biomaterial-associated Staphylococcus aureus Infection

Un modelo de embrión de pez cebra para In Vivo visualización y análisis Intravital de Biomaterial asociados Staphylococcus aureus infección

Biomaterial-associated infection (BAI) is a major cause of the failure of biomaterials/medical devices. Staphylococcus aureus is one of the major ...

High-resolution Patterned Biofilm Deposition Using pDawn-Ag43

Alta resolución con motivos Biofilm deposición utilizando pDawn-Ag43

Spatial structure and patterning play an important role in bacterial biofilms. Here we demonstrate an accessible method for culturing E. coli biofilms ...

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