Name: in vivo three-dimensional two-photon microscopy to study conducted vascular responses by local atp ejection using a glass micro-pipette
Uploaded: 2019-06-07T13:00:00
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이 연구는 룬드벡 재단, NOVO-Nordisk 재단, 덴마크 독립 연구 위원회의 지원을 받았습니다 | 의료 과학, 그리고 건강한 노화 센터에 NORDEA 재단 보조금.

동물과 관련된 모든 절차는 실험 및 기타 과학적 목적으로 사용되는 척추 동물 보호를 위한 유럽 이사회 협약에 명시된 지침에 따라 덴마크 국가 윤리위원회의 승인을 받았습니다. 도착 지침을 준수하고 있었습니다. 이것은 마취 회복 전에 마우스가 안락사되는 말단 절차입니다.
1. 수술 전 준비
<ol><li>수술 테이블과 주변 의 모든 부위를 70 % 에탄올로 ?...

<ol>
	<li>Abbott, N. J., Patabendige, A. A., Dolman, D. E., Yusof, S. R., Begley, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+Function+of+the+Blood-Brain+Barrier.">Structure and Function of the Blood-Brain Barrier.</a> Neurobiology of Disease. 37 (1), 13-25 (2010).</li><li>Hall, C. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capillary+Pericytes+Regulate+Cerebral+Blood+Flow+in+Health+and+Disease.">Capillary Pericytes Regulate Cerebral Blood Flow in Health and Disease.</a> Nature. 508 (7494), 55-60 (2014).</li><li>Cai, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stimulation-Induced+Increases+in+Cerebral+Blood+Flow+and+Local+Capillary+Vasoconstriction+Depend+on+Conducted+Vascular+Responses.">Stimulation-Induced Increases in Cerebral Blood Flow and Local Capillary Vasoconstriction Depend on Conducted Vascular Responses.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (25), 5796-5804 (2018).</li><li>Stosiek, C., Garaschuk, O., Holthoff, K., Konnerth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Vivo+Two-Photon+Calcium+Imaging+of+Neuronal+Networks.">In Vivo Two-Photon Calcium Imaging of Neuronal Networks.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (12), 7319-7324 (2003).</li><li>Mathiesen, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity-Dependent+Increases+in+Local+Oxygen+Consumption+Correlate+with+Postsynaptic+Currents+in+the+Mouse+Cerebellum+in+Vivo.">Activity-Dependent Increases in Local Oxygen Consumption Correlate with Postsynaptic Currents in the Mouse Cerebellum in Vivo.</a> The Journal of Neuroscience. 31 (50), 18327-18337 (2011).</li><li>Kitamura, K., Judkewitz, B., Kano, M., Denk, W., Hausser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+Patch-Clamp+Recordings+and+Single-Cell+Electroporation+of+Unlabeled+Neurons+in+Vivo.">Targeted Patch-Clamp Recordings and Single-Cell Electroporation of Unlabeled Neurons in Vivo.</a> Nature Methods. 5 (1), 61-67 (2008).</li><li>Norup Nielsen, A., Lauritzen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coupling+and+Uncoupling+of+Activity-Dependent+Increases+of+Neuronal+Activity+and+Blood+Flow+in+Rat+Somatosensory+Cortex.">Coupling and Uncoupling of Activity-Dependent Increases of Neuronal Activity and Blood Flow in Rat Somatosensory Cortex.</a> The Journal of Physiology. 533 (3), 773-785 (2001).</li><li>Wang, X. F., Huang, D. S., Xu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Efficient+Local+Chan-Vese+Model+for+Image+Segmentation.">An Efficient Local Chan-Vese Model for Image Segmentation.</a> Pattern Recognition. 43 (3), 603-618 (2010).</li><li>Chan, T. E., Sandberg, B. Y., Vese, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Active+Contours+without+Edges+for+Vector-Valued+Images.">Active Contours without Edges for Vector-Valued Images.</a> Journal of Visual Communication and Image Representation. 11 (2), 130-141 (2000).</li><li>Cetin, A., Komai, S., Eliava, M., Seeburg, P. H., Osten, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stereotaxic+Gene+Delivery+in+the+Rodent+Brain.">Stereotaxic Gene Delivery in the Rodent Brain.</a> Nature Protocols. 1 (6), 3166-3173 (2006).</li><li>Chen, B. R., Kozberg, M. G., Bouchard, M. B., Shaik, M. A., Hillman, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Critical+Role+for+the+Vascular+Endothelium+in+Functional+Neurovascular+Coupling+in+the+Brain.">A Critical Role for the Vascular Endothelium in Functional Neurovascular Coupling in the Brain.</a> Journal of the American Heart Association. 3 (3), 000787 (2014).</li><li>Lind, B. L., Brazhe, A. R., Jessen, S. B., Tan, F. C., Lauritzen, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+Stimulus-Evoked+Astrocyte+Ca2++Elevations+and+Hemodynamic+Responses+in+Mouse+Somatosensory+Cortex+in+Vivo.">Rapid Stimulus-Evoked Astrocyte Ca2+ Elevations and Hemodynamic Responses in Mouse Somatosensory Cortex in Vivo.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (48), 4678-4687 (2013).</li><li>Stobart, J. L., Ferrari, K. D., Barrett, M. J. P., Gluck, C., Stobart, M. J., Zuend, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cortical+Circuit+Activity+Evokes+Rapid+Astrocyte+Calcium+Signals+on+a+Similar+Timescale+to+Neurons.">Cortical Circuit Activity Evokes Rapid Astrocyte Calcium Signals on a Similar Timescale to Neurons.</a> Neuron. 98 (4), 726 (2018).</li><li>Bouchard, M. B., Voleti, V., Mendes, C. S., Lacefield, C., Grueber, W. B., Mann, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Swept+Confocally-Aligned+Planar+Excitation+(Scape)+Microscopy+for+High+Speed+Volumetric+Imaging+of+Behaving+Organisms.">Swept Confocally-Aligned Planar Excitation (Scape) Microscopy for High Speed Volumetric Imaging of Behaving Organisms.</a> Nature Photonics. 9 (2), 113-119 (2015).</li></ol>

혈관 연구의 한 가지 과제는 혈관 직경의 정확한 측정입니다. 여기에서 설명하는 방법은 2 광자 현미경 검사법에 의하여 빠르고 반복적인 hyperstack 화상 진찰을 만들기 위하여 전동된 압전 목표를 이용했습니다. 첫째, 이 방법은 초점의 손실없이 관통 동맥, 1st 순서 및 2차 모세 혈관의 반복 검사를 허용하고 생체 내에서 모세 혈관 반응을 천천히 실시의 발견으로 이어졌다. 둘째, 바...

뇌는 높은 에너지 소비율을 가지고 있습니다. 산소의 약 20%와 인체가 소비하는 포도당의 25%는 뇌 기능에 전념하고 있으며, 뇌는 전체 체질량의 2%만 차지합니다. 정상적인 뇌 기능의 유지 보수 혈관의 복잡 한 네트워크에서 혈액 흐름에 의해 산소와 영양의 충분 하 고 효율적인 공급을 필요 합니다. 국소 뇌 활동 및 대뇌 혈류(CBF)는 뉴런, 성상세포, 회수세포, 평활근 세포(SMC) 및 내피 세포(ECs)의 기능적 특성에 따라 강력하게 결합된다1. 최근에는 관통하는 동맥에서 분지하는 모세혈관의 처음 몇 가지 주문이'핫스팟'2로 등장하여 모세 혈관 의 혈류에 대한 적극적인 조절을 보여주고 있습니다. 느린 전도 혈관 반응 (CVR)은 유리 마이크로 파이펫3와ATP의 수염 자극 및 국소 배출 (퍼핑) 동안 마우스 체감각 피질에서이 '핫스팟'에서 발견되었다.
2 광자 레이저 스캐닝 형광 현미경 검사법에 의한 생체 내 이미징은 대뇌 피질의 신경 혈관 반응을 연구하는 데 널리 사용되어 왔지만, 대부분의 연구는 혈관 직경을 측정하고 그들의 규정을 조사했습니다. 2차원(2D) x-y 평면. 과제는 첫째, 대뇌 혈관과 성상 세포, pericytes 및 SMC를 포용하는 것이 3 차원 (3D)로 분기를 구성합니다. 따라서 3D로 상호 작용을 연구하는 것이 중요합니다. 둘째, 소량의 초점도 혈관 직경과 세포 형광 신호의 정확한 측정에 영향을 미칩니다. 마지막으로, C버는 3차원으로 빠르고 광범위합니다. 3D 볼륨 스캐닝은 CR을 감지하고 메커니즘을 공개하는 데 최적입니다. 우리는 생체 내에서 마우스 체감각 피질을 연구하기 위해 2 광자 현미경으로 압전 모터 목표를 구현하여 얻은 이미지의 최대 강도 투영으로 정확한 직경측정을 가능하게 했습니다.
유리 마이크로 파이펫은 생체 내 뇌 연구에 자주 사용되어 왔다, 예를 들어,대량 로드 유기 염료 4, 기록 EEGs5 및 패치 클램핑6. 그럼에도 불구하고 제한은 남아 있습니다. 일반적으로 유리 마이크로 파이펫의 팁이 부정확하게 배치되거나 마이크로 파이펫이 국소 개입에 사용되지 않습니다. 여기서는 마이크로 파이펫 삽입 및 국소 배출 절차를 최적화했습니다.
또한 3D 2광자 현미경 검사법과 유전자 부호인형 형광 지표의 조합은 3D 범위에서 신경 혈관 커플링을 조사할 수 있는 전례 없는 기회를 제공합니다. 이 연구에서, 우리는 이것을 이용하고 마우스 체감각 피질로 성상 세포 특정 유전자 부호화 한 칼슘 지표를 운반하는 바이러스 벡터를 주입했습니다. 성상 세포뿐만 아니라 혈관 직경은 다른 형광 마커를 결합하여 동시에 이미지화되었다.
전반적으로, 우리는 유리 마이크로 파이펫과 모세관 직경 변화를 정밀하게 측정 할 수있는 빠른 2 광자 하이퍼 스택 이미징에 의한 국소 배출 (퍼핑)의 최적화 된 방법을 제시합니다. 또한, 우리의 방법은 성상 세포 및 혈관 직경 응답에서 Ca2+ 응답의 3D 프로파일을 동시에 연구할 수 있는 새로운 도구를 제공합니다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1161px;" width="1162">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Agarose</td>
			<td style="width:263px;">Sigma&#8211;Aldrich</td>
			<td style="width:152px;">A6138</td>
			<td style="width:524px;">Apply upon exposed cortex for protection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Alexa 594</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A-10438</td>
			<td>Stain puffing compound to red fluorescent color</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ATP</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9187</td>
			<td>Vasodilator and vasoconstrictor, puffing compound</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cyanoacrylate glue and activator</td>
			<td>Loctite</td>
			<td>Adhesives and SF7452</td>
			<td>Glue for metal piece and coverglass</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Eye lubricant</td>
			<td style="width:263px;">Neutral Ophtha, Ophtha A/S, Denmark</td>
			<td style="width:152px;"></td>
			<td>Keep the mouse eyes moisterized</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FITC-dextran</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:152px;">FD500S</td>
			<td>Blood serum dye, green fluorescent color</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">NG2DsRed mice</td>
			<td style="width:263px;">Jackson Laboratory</td>
			<td style="width:152px;">8241</td>
			<td style="width:524px;">These transgenic mice express an red fluorescent protein variant (DsRed) under the control of the mouse NG2 (Cspg4) promoter</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">pZac2.1 gfaABC1D-lck-GCaMP6f</td>
			<td style="width:263px;">Addgene</td>
			<td style="width:152px;">52924-AAV5</td>
			<td>Astrocyte specific viral vectors carrying genetically encoded calcium indicators</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TRITC-dextran</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:152px;">52194</td>
			<td>Blood serum dye, red fluorescent color</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">List of Equipments</td>
			<td style="width:263px;"></td>
			<td style="width:152px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Air pump</td>
			<td>WPI</td>
			<td>PV830</td>
			<td>Give air pressure to pipette puffing</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Blood gas analyzer</td>
			<td style="width:263px;">Radiometer</td>
			<td>ABL 700</td>
			<td>Measure levels of blood gases&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Blood pressure monitor</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>BP-1</td>
			<td>Monitor aterial blood pressure</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Body temperature controller</td>
			<td>CWE</td>
			<td>Model TC-1000</td>
			<td>Keep the mouse body temperature in physiological range</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:223px;">Capnograph</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>Type 340</td>
			<td>Monitor the end-expiratory CO2 from the mouse</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Electrical stimulator</td>
			<td style="width:263px;">A.M.P.I.</td>
			<td>ISO-flex</td>
			<td>Apply whisker pad stimulation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Mechanical ventilator</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>D-79232</td>
			<td>Mechanically ventilate the mouse in physiological range</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Micropipette puller</td>
			<td style="width:263px;">Sutter Instrument</td>
			<td>P-97</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Two-photon microscope</td>
			<td>Femtonics Ltd</td>
			<td>Femto3D-RC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">List of Surgical Instruments</td>
			<td style="width:263px;"></td>
			<td style="width:152px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Anatomical tweezer&#160;</td>
			<td>Lawton</td>
			<td>09-0007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Angled and balanced tweezer</td>
			<td>S&#38;T AG</td>
			<td>00595 FRAS-18 RM-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Iris scissor</td>
			<td>Lawton</td>
			<td>05-1450</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Micro vascular clamp</td>
			<td>S&#38;T AG</td>
			<td>462</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mouse vascular catheters</td>
			<td>Verutech</td>
			<td>100828</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo three-dimensional two-photon microscopy to study conducted vascular responses by local atp ejection using a glass micro-pipette

정상적인 뇌 기능의 유지 보수혈관의 복잡한 네트워크에 의해 산소와 영양의 충분하고 효율적인 공급이 필요합니다. 그러나, 대뇌 혈류량의 규칙 (CBF)는 불완전하게 이해됩니다, 특히 모세관 수준에서. 2 광자 현미경 검사법은 CBF와 그것의 규정을 공부하기 위하여 널리 이용된 강력한 공구입니다. 현재, 이 분야는 (1) CBF 반응을 3차원으로 검사하는 생체내 2광자 현미경 연구의 부족, (2) 혈관 반응 및 (3) 혈관 네트워크 내의 국소적 개입에 의해 제한된다. 여기서, 우리는 유리 마이크로 파이펫으로 ATP의 국소 배출에 의해 유도된 실시된 혈관 반응을 연구하기 위해 2광자 현미경을 사용하여 생체 내 3D 방법을 설명합니다. 우리의 방법은 얻어진 심물의 최대 강도 투영에 의하여 정확한 직경 측정을 제공하는 빠르고 반복적인 하이퍼스택 2 광자 화상 진찰을 이용합니다. 또한, 우리는이 방법은 또한 3D 성상 성상 칼슘 응답을 연구하는 데 사용할 수 있음을 보여줍니다. 또한 유리 마이크로 파이펫 삽입 및 2광자 하이퍼스택 이미징의 장점과 한계에 대해서도 논의합니다.

수술이 완료되면, 마우스를 2광자 현미경으로 이송하였다(도1A). 1 mM ATP를 함유하는 유리 마이크로 파이펫을 대상 위치에서 대상 혈관의 근접에 삽입하였다(도1B).
우리는 1 mM ATP의 퍼프를 제공하면서 하이퍼 스택 이미징을 수행 (그림2A, 보충 비디오1). 각 이미...

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In Vivo Three-Dimensional Two-Photon Microscopy to Study Conducted Vascular Responses by Local ATP Ejection Using a Glass Micro-Pipette

우리는 유리 마이크로 파이펫과 빠른 2 광자 하이퍼 스택 이미징 방법을 사용하여 최적화 된 국소 배출 절차를 제시하여 모세관 직경 변화를 정밀하게 측정하고 3 차원으로 조절을 조사 할 수 있습니다.

유리 마이크로 파이펫을 사용하여 국소 ATP 배출에 의한 혈관 반응을 연구하기 위한 Vivo 3차원 2차원 광자 현미경 검사법

Maintenance of normal brain function requires a sufficient and efficient supply of oxygen and nutrition by a complex network of vessels. However, the ...

이 프로토콜은 ATP의 국소 배출에 의해 유도된 뇌모세 혈관에서 느린 수행된 혈관 반응을 연구하도록 설계되었습니다. 이 기술의 장점은 국소 피펫 배출에 의한 로컬 시냅스 활동을 시뮬레이션하고 3D 2광자 현미경 검사법에 의해 빈칸 용기를 집중하는 것입니다. 이 방법은 또한 3 차원에서 휴식과 자극에 대뇌 신경종과 신경교 활동을 공부에 사용할 수 있습니다. 절차를 시연하는 것은 마이클 L이 될 것입니다.

Research

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연구

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초음파 혈액 - 뇌 장벽 파괴 및 망간 향상된 MRI를 사용하여 기능성 Neuroimaging

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The brain's ability to change in response to experience is essential for healthy brain function, and abnormalities in this process contribute to a variety ...

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