Name: fluorescence recovery after photobleaching of yellow fluorescent protein tagged p62 in aggresome-like induced structures
Uploaded: 2019-03-26T14:00:00
Duration: 12 min 58 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Fluorescence Recovery after Photobleaching of Yellow Fluorescent Protein Tagged p62 in Aggresome-like Induced Structures at JoVE.com

ونشكر الدكتور سيث ربيع في "جامعة لويولا شيكاغو" على تعليقاته القيمة على هذه المخطوطة. وأيد هذا العمل المعاهد الوطنية للصحة منحة 1R01NS073967-01A1 إلى جوانا باكووسكا جيم.

<ol>
	<li>Axelrod, D., Koppel, D. E., Schlessinger, J., Elson, E., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mobility+measurement+by+analysis+of+fluorescence+photobleaching+recovery+kinetics.">Mobility measurement by analysis of fluorescence photobleaching recovery kinetics.</a> Biophysical Journal. 16 (9), 1055-1069 (1976).</li><li>Peters, R., Peters, J., Tews, K. H., Bahr, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microfluorimetric+study+of+translational+diffusion+in+erythrocyte+membranes.">A microfluorimetric study of translational diffusion in erythrocyte membranes.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 367 (3), 282-294 (1974).</li><li>Patterson, G., Day, R. N., Piston, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+protein+spectra.">Fluorescent protein spectra.</a> Journal of Cell Science. 114, 837-838 (2001).</li><li>Rabut, G., Ellenberg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photobleaching+techniques+to+study+mobility+and+molecular+dynamics+of+proteins+in+live+cells:+FRAP,+iFRAP,+and+FLIP.">Photobleaching techniques to study mobility and molecular dynamics of proteins in live cells: FRAP, iFRAP, and FLIP.</a> Live Cell Imaging: A Laboratory Manual (1st ed). , 101-126 (2004).</li><li>Fritzsche, M., Charras, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+protein+reaction+dynamics+in+living+cells+by+fluorescence+recovery+after+photobleaching.">Dissecting protein reaction dynamics in living cells by fluorescence recovery after photobleaching.</a> Nature Protocols. 10 (5), 660-680 (2015).</li><li>Goodwin, J. S., Kentworthy, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photobleaching+approaches+to+investigate+diffusional+mobility+and+trafficking+of+Ras+in+living+cells.">Photobleaching approaches to investigate diffusional mobility and trafficking of Ras in living cells.</a> Methods. 37 (2), 154-164 (2005).</li><li>Hildick, K. L., Gonz&#224;lez-Gonz&#224;lez, I. M., Jaskolski, F., Henley, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lateral+diffusion+and+exocytosis+of+membrane+proteins+in+cultured+neurons+assessed+using+fluorescence+recovery+and+fluorescence-loss+photobleaching.">Lateral diffusion and exocytosis of membrane proteins in cultured neurons assessed using fluorescence recovery and fluorescence-loss photobleaching.</a> Journal of Visualized Experiments. (60), e3747 (2012).</li><li>Nissim-Rafinia, M., Meshorer, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photobleaching+assays+(FRAP+&amp;+FLIP)+to+measure+chromatin+protein+dynamics+in+living+embryonic+stem+cells.">Photobleaching assays (FRAP &amp; FLIP) to measure chromatin protein dynamics in living embryonic stem cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (52), e2696 (2011).</li><li>Zheng, C., Petralia, R. S., Wang, Y., Kachar, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+recovery+after+photobleaching+(FRAP)+of+fluorescence+tagged+proteins+in+dendritic+spines+of+cultured+hippocampal+neurons.">Fluorescence recovery after photobleaching (FRAP) of fluorescence tagged proteins in dendritic spines of cultured hippocampal neurons.</a> Journal of Visualized Experiments. (50), e2568 (2011).</li><li>Thevenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+pyramid+approach+to+subpixel+registration+based+on+intensity.">A pyramid approach to subpixel registration based on intensity.</a> IEEE Transactions on Image Processing. 7 (1), 27-41 (1998).</li><li>Ishikawa-Ankerhold, H. C., Ankerhold, R., Drummen, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+fluorescence+microscopy+techniques--FRAP,+FLIP,+FLAP,+FRET+and+FLIM.">Advanced fluorescence microscopy techniques--FRAP, FLIP, FLAP, FRET and FLIM.</a> Molecules. 17 (4), 4047-4132 (2012).</li><li>Cabe, M., Rademacher, D. J., Karlsson, A. B., Cherukuri, S., Bakowska, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PB1+and+UBA+domains+of+p62+are+essential+for+aggresome-like+induced+structure+formation.">PB1 and UBA domains of p62 are essential for aggresome-like induced structure formation.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 503 (4), 2306-2311 (2018).</li><li>Brown, E. B., Wu, E. S., Zipfel, W., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+molecular+diffusion+in+solution+by+multiphoton+fluorescence+photobleaching+recovery.">Measurement of molecular diffusion in solution by multiphoton fluorescence photobleaching recovery.</a> Biophysical Journal. 77 (5), 2837-2849 (1999).</li><li>Centonze, V., Pawley, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tutorial+on+practical+confocal+microscopy+and+the+use+of+the+confocal+test+specimen.">Tutorial on practical confocal microscopy and the use of the confocal test specimen.</a> Handbook of biological confocal microscopy. , 549-570 (1995).</li><li>Chudakov, D. M., Matz, M. V., Lukyanov, S., Lukyanov, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+proteins+and+their+applications+in+imaging+living+cells+and+tissues.">Fluorescent proteins and their applications in imaging living cells and tissues.</a> Physiological Reviews. 90 (3), 1103-1163 (2010).</li></ol>

الكتاب قد لا يوجد تضارب في الكشف عن.

نحن نقدم بروتوكول خطوة بخطوة شاملة وعملية وبسيطة للتجارب فراب مع الخلايا الحية. وهنا، البروتوكول المستخدم لقياس حركة يفب-p62 في ALIS في الضامة RAW264.7، ولكن يمكن تطبيقها على العديد من المسح مجهر [كنفوكل] نظم الليزر ووراثيا ترميز البروتينات الفلورية التي أصبحت الآن متاحة. لأي نظام الفحص المجهري، وتجارب رائدة ذات أهمية حاسمة لتحديد معلمات فراب الأمثل، بما في ذلك كثافة الليزر اقتناء والتبييض، وأحجام عنصر التحكم العائد على الاستثمار، فوتوبليتشينج، والحصول على الصور بريبليتش وبوستبليتش. فإنه من المعقول أن نتوقع المعلمات فراب الأمثل تختلف عن كل سطر البروتين وخلية الفلورسنت وراثيا المرمزة.
العوامل الهامة في الاعتبار عند إجراء تجربة فراب وتشمل (أ) تحقيق مناسب التبييض العمق، (ب) استخدام الخطوة تبيض موجزة، (ج) السماح بوستبليتش الوقت الكافي لمراقبة وظيفة الاسترداد الكامل، (د) فوتوبليتشينج الكفاءة، (ه). سيتوتوكسيسيتي مع فراب المتكررة، و (و) إدراج عنصر تحكم لفقدان الأسفار بسبب تصوير المتكررة. نوصي بأن يكون عمق التبييض، التي يمكن أن تحسب وفقا للمعادلة المنصوص عليها في قسم 3.3.1, إيه ناين زيرو13. عندما يكون عمق التبييض < 90، سيتم التقليل من درجة الانتعاش بوستبليتش الأسفار، والقيم من أناوو Mوو t1/2 تكون غير صحيحة. على الرغم من أن مدة وكثافة من نبضات الليزر يحفز التبييض قد تختلف بين تجارب فراب، من المهم أن الخطوة فوتوبليتشينج تكون قصيرة وأسرع كثيرا من الدالة استرداد الأسفار. إذا لم يكن كذلك، يمكن أن تحدث قدرا كبيرا من الأسفار الانتعاش خلال الخطوة تبيض. مع وقت التبييض طويلة، لا يمكن قياسها fluorescence الانتعاش خلال الخطوة تبيض، وأنها ستؤدي إلى قياسات غير صحيحة أناfو Mووt1/2. وبالإضافة إلى ذلك، للحصول على القيم الصحيحة لاناوMf، وt1/2، الحصول على عائد الاستثمار ينبغي أن تراعي بوستبلياتش حتى وصلت إلى مستوى الأسفار في بليتش دوروا هضبة. على سبيل المثال، في تجاربنا فراب، لم يكن هناك فرق بين أناوMووقيم t1/2 عندما لاحظنا fluorescence يفب-p62 في المبيض دوروا لدقيقة 32.2 بوستبليتش مقابل عندما لاحظنا يفب-p62 في بليتش دوروا على بوستبليتش 15.1 دقيقة؛ هكذا، خلصنا أن الدالة استرداد التوصل إلى هضبة في دقيقة 15.1 بوستبليتش12. وفيما يتعلق بكفاءة فوتوبليتشينج، يزيد فوتوبليتشينج مع مربع عامل التكبير/التصغير البصري14. وهكذا، استخدام عدسات التكبير الضوئية عالية مواتية فوتوبليتشينج السريع ولكن يمكن أن تؤدي إلى فوتوبليتشينج غير مرغوب فيه أثناء اقتناء؛ هذه الأخيرة يمكن أن يعزى للتصوير عنصر تحكم العائد على الاستثمار. فوتوبليتشينج المتكررة أمر ينبغي تجنبه كما أنها يمكن أن تؤدي إلى توليد أنواع الأكسجين التفاعلية السامة للخلايا (روس). بيد أن درجة توليد روس بسبب التعرض لليزر عالية الكثافة أقل بالنسبة للبروتينات الفلورية المرمزة وراثيا من فلوروفوريس الكيميائية (مثل الأجسام المضادة الفلورسنت)15وروس المتولدة من المرجح أن الرد إطار المرمزة وراثيا بروتين فلوري من جزيئات أخرى في الخلية4. بالإضافة إلى احتمال زيادة توليد روس السامة للخلايا، فوتوبليتشينج المتكررة تجنب نظراً لأنه من الصعب التحكم. أخيرا، على الرغم من أن انتقال الليزر منخفض يستخدم للحصول على جميع الصور غير التبييض، بعض فوتوبليتشينج دائماً سيحدث، التي يجب أن تخضع للرقابة. وتشمل الضوابط الممكنة لهذا رصد الأسفار في عنصر تحكم عائد الاستثمار في الحصول على عائد الاستثمار، والحصول على صور التحكم في خلية مجاورة غير مقصور وإجراء تجارب التحكم في إعدادات مماثلة لتلك التي استخدمت في تجارب فوتوبليتشينج ولكن من دون هذا الحدث فوتوبليتشينج.

الأسفار الانتعاش بعد فوتوبليتشينج (فراب) وهو أسلوب الفحص المجهري التي يمكن استخدامها لتحديد كمية البروتين الديناميات في العيش الخلايا1،2. زادت شعبية فراب بسبب التوافر التجاري على نطاق واسع لليزر المسح مجاهر [كنفوكل] مع عالية الدقة والسرعة، والحساسية، ووراثيا ترميز "قوس قزح" من البروتينات الفلورية، مثل أخضر نيون البروتين (التجارة والنقل) وبروتين فلوري الصفراء (يفب)3. تنصهر فيها البروتينات الفلورية وراثيا المشفر وتين فائدة للسماح للتعريب سوبسيلولار من بروتين الفائدة. في تجربة فراب نموذجي، لوحظ fluorescence الحالة المستقرة في منطقة اقتناء من الفائدة (ROI) داخل خلية عن طريق التصوير المتكرر لأن العائد على الاستثمار مع ضوء الليزر المنخفضة الكثافة. وفي وقت لاحق، الجزيئات الفلورسنت هي سريعاً ولا رجعة فيه ضعاف في مجموعة فرعية محددة مسبقاً للحصول على عائد الاستثمار، يشار إليه التبييض العائد على الاستثمار، موجز التعرض لضوء الليزر عالية الكثافة. كما البروتينات غير مقصور الجديدة تجديد البروتينات المبيضة على مر الزمن، بسرعة وكثافة الانتعاش fluorescence في بليتش دوروا يوفر معلومات حول البروتين التنقل (الشكل 1)4.
لدينا مصلحة في تحديد تنقل p62 البروتين ملزمة أوبيكويتين (يعرف أيضا باسم سيكويستوسومي-1) في هياكل المستحث (ALIS) مثل أجريسومي في مورين RAW264.7 الضامة بعد التحفيز مع lipopolysaccharide (لبس) أدت بنا إلى إعادة النظر في فراب الأدب. لسوء الحظ، العديد من البروتوكولات فراب الحالية هي غير مكتملة أو مفرطة التعقيد5،،من67،،من89. بعض لا توفر معلومات تفصيلية حول إعدادات الليزر، وتكوين مسار الشعاع واكتساب صورة معلمات6،5،7،،من89. آخرون حذف التفاصيل الرئيسية فيما يتعلق بتحليل البيانات، مثل كيفية معالجة مسألة التبييض دوروا الانجراف6،9 أو كيفية حساب معلمات استرداد الهامة، منها كسر الجوال (مو)، وكسر غير متحرك (أناو)، ونصف الوقت لاسترداد (t½)5،7. على العكس من ذلك، البعض الآخر وضع الكثير من التركيز على الصيغ الرياضية المعقدة المستخدمة لحساب مو، أناو t1/25،6،،من89. وهكذا، هدفنا تقديم بروتوكول خطوة بخطوة شامل وعملي ومباشر للتجارب فراب مع الخلايا الحية.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:835px;" width="835">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium</td>
			<td style="width:211px;">Hyclone</td>
			<td style="width:137px;">SH30022.01</td>
			<td style="width:167px;">High Glucose (4.5 g/L)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Fetal bovine serum</td>
			<td style="width:211px;">Gemini Bio-Products</td>
			<td style="width:137px;">100-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Glass bottom dishes</td>
			<td style="width:211px;">MatTek</td>
			<td style="width:137px;">P35G-1.5-14-C</td>
			<td>35-mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Image J software</td>
			<td style="width:211px;">National Institutes of Health</td>
			<td style="width:137px;">N.A.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Lipopolysaccharide (LPS)</td>
			<td style="width:211px;">Sigma</td>
			<td style="width:137px;">L4391</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Nocodazole</td>
			<td style="width:211px;">Sigma</td>
			<td style="width:137px;">M1404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Penicillin-streptomycin solution</td>
			<td style="width:211px;">Corning</td>
			<td style="width:137px;">30-002-Cl</td>
			<td>100&#215;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Plan-Apochromat 63&#215;/1.40 oil objective</td>
			<td style="width:211px;">Carl Zeiss MicroImaging, Inc</td>
			<td style="width:137px;">4407629904000000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Polyethylenimine (PEI)</td>
			<td style="width:211px;">Polysciences</td>
			<td style="width:137px;">23966-1</td>
			<td>linear (MW 25,000)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">RAW 264.7 murine macrophages</td>
			<td style="width:211px;">ATCC</td>
			<td style="width:137px;">TIB-71</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Zeiss confocal microscope</td>
			<td style="width:211px;">Carl Zeiss MicroImaging, Inc</td>
			<td style="width:137px;">LSM 510</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fluorescence recovery after photobleaching of yellow fluorescent protein tagged p62 in aggresome-like induced structures

الأسفار الانتعاش بعد فوتوبليتشينج (فراب) وهو أسلوب الفحص المجهري التي يمكن استخدامها لتحديد حجم التنقل البروتين في الخلايا الحية. في تجربة فراب نموذجي، لوحظ fluorescence الحالة المستقرة بالتصوير المتكرر مع ضوء الليزر المنخفضة الكثافة. وفي وقت لاحق، جزيئات الفلورسنت البصر بسرعة وبلا رجعة عن طريق مختصر من التعرض لضوء الليزر عالية الكثافة. يتم الحصول على المعلومات حول التنقل البروتين عن طريق رصد انتعاش الأسفار. كنا فراب لتحديد حركة p62 في هياكل المستحث (ALIS) مثل أجريسومي في الضامة مورين بعد التحفيز مع lipopolysaccharide (LPS). نظراً للعديد من البروتوكولات الموجودة في فراب أما غير مكتملة أو المعقدة، كان هدفنا تقديم بروتوكول خطوة بخطوة شامل وعملي ومباشر للتجارب فراب مع الخلايا الحية. وهنا يصف لنا RAW264.7 بلعم تعداء مع الأصفر فلوري البروتين-p62 (يفب-p62)، تحريض ALIS وذلك بتعريض الخلايا للبس، وأسلوب خطوة بخطوة لجمع بريبليتش وبوستبليتش فراب الصور وتحليل البيانات. وأخيراً، نحن نناقش العوامل الهامة في الاعتبار عند إجراء تجربة فراب.

يظهر هنا هي نتائج التجربة النموذجية التي كنا فراب لفحص درجة تنقل p62 في ALIS في RAW264.7 الخلايا تعامل مع لبس ل 3-5 ح12. الشكل 3 أ تظهر البيانات الأولية التي تم الحصول عليها من التبييض، والسيطرة، والخلفية دوروا بعد قد تم مواءمة كومة الصور لتصحيح لكميات صغيرة (< ~ 3 ميكرومتر) من الانجراف الصورة ALIS. ويرد fluorescence يفب-p62 في هذا ALIS في بريبليتش وبوستبليتش في الشكل 3ه و التكميلي فيديو 1. الشكل 3 ب إظهار هذه البيانات بعد تصحيح الخلفية. الشكل 3 ج يوضح هذه البيانات بعد تصحيح للأسفار في مراقبة عائدات الاستثمار. الشكل 3 د تظهر هذه البيانات تطبيع للأسفار متوسط القيم بريبليتش 5 في بليتش العائد على الاستثمار. وكانت درجة تبيض كافية في هذه التجربة (التبييض عمق = 91.94). يفب-p62 الأسفار داخل هذه ALIS تعافي ببطء، كما t1/2 = 128.27 s (2.14 دقيقة). ولم يفب-p62 بروتين جداً المحمول في هذه التجربة، مو = 21.97، وواو = 78.03.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59288/59288fig1.jpg"> الشكل 1 : رسم تخطيطي لخلية RAW264.7 والخطوات اللازمة لتحليل الصورة بعد قد تم محاذاة الصور فراب لتصحيح الصورة الانجراف ALIS. (أ) رسم تخطيطي لخلية RAW264.7 ALIS عدة والتبييض والتحكم، والخلفية رويس في الحصول على عائد الاستثمار. الحصول على البيانات (ب) تصوير مثالي من فراب الخام في التبييض والتحكم، والخلفية رويس في الفريق ألف (ج) على الرسم بياني مثالية للبيانات فراب الخام التي تم تصحيحها الخلفية. (د) رسم مثالية الخلفية لتصحيح البيانات فراب التي قد تم تطبيع للأسفار في مراقبة عائدات الاستثمار. (ﻫ) المثالية الرسم البياني للبيانات فراب طبيعية وتصحيح الخلفية قد تم تطبيع للأسفار بريبليتش في المبيض العائد على الاستثمار. المختصرات: = يخدع الرقابة؛ جي = الخلفية. تم تعديل هذا الرقم من رابوت و Ellenberg4. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59288/59288fig1large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59288/59288fig2.jpg"> رقم 2: صور واجهة المستخدم في البرنامج الهدف (جدول المواد) لاختيار الليزر وشعاع مسار التكوين، وصورة اكتساب المعلمات للتجارب فراب. ليزر (A) التحكم في الشاشة التي تظهر خطوط ليزر الأرجون/2 والإخراج، وأنبوب الحالية المستخدمة. (ب) تكوين التحكم بشاشة عرض الشعاع الخائن والانبعاثات تصفية الإعدادات المستخدمة. المسح الضوئي (ج) التحكم في شاشة عرض الإعداد المستخدمة للحصول على الصور. (د) فحص التحكم الشاشة تظهر الثقب ومكسب للكشف عن، وإزاحة مكبر للصوت، وكسب مكبر للصوت، وإعدادات الإرسال لخط الليزر نانومتر 514 الأرجون/2. (ﻫ) السلسلة الزمنية التحكم بشاشة عرض إعدادات سلسلة الوقت المستخدمة. التحكم في شاشة عرض بريبليتش التبييض (F) وبوستبليتش المعلمات المستخدمة. المختصرات: HFT = هوبت النمساوية تيلر (الخائن شعاع مزدوج اللون الأساسي)؛ NT1 = نيبين النمساوية تيلير 1 (الثانوية الأولى مزدوج اللون شعاع الخائن)؛ NT2 = نيبن النمساوية تيلر 2 (الخائن شعاع مزدوج اللون الثانوي الثاني)؛ EF = تصفية الانبعاثات. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59288/59288fig2large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59288/59288fig3.jpg"> الشكل 3 : تجربة فراب ممثل لدراسة ديناميات يفب-p62 في ALIS في الخلايا RAW264.7- (أ) البيانات كثافة الفلورية الخام للتبييض والتحكم، والخلفية العائد على الاستثمار. (ب) أن البيانات المقدمة في الفريق A بعد التبييض ومراقبة عائد الاستثمار قد تم تصحيحه للأسفار في الخلفية العائد على الاستثمار. (ج) البيانات الواردة في الألواح A و B بعد تطبيع كثافة fluorescence في المبيض عائد الاستثمار إلى حساب لصف في عنصر التحكم خلفية لتصحيح العائد على الاستثمار. (د) البيانات الواردة في الألواح A-C بعد تطبيع كثافة fluorescence في التبييض طبيعية وأساسية لتصحيح عائد الاستثمار إلى متوسط قيم بريبليتش 5 أولاً في بليتش العائد على الاستثمار. مو = 21.97، أناf = 78.03، t1/2 = 128.27 s (2.14 دقيقة)، وعمق التبييض = 91.94. (ﻫ) صورة ALIS في بريبليتش (1.5 دقيقة) وبوستبليتش (0, 6 و 16 دقيقة). شريط المقياس = 5 ميكرومتر وصالحة لكل اللوحات. المختصرات: = يخدع الرقابة؛ جي = الخلفية؛ Corr. = تصحيحها؛ القواعد والمعايير. = تطبيع؛ متوسط = متوسط. تم تعديل هذا الرقم من كاب et al.12<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59288/59288fig3large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<img alt="Supplementary Video 1" src="/files/ftp_upload/59288/59288supvideo1.jpg"> التكميلي فيديو 1: ALIS نموذجية في بلعم RAW264.7 قبل وبعد فوتوبليتشينج- ومضان يفب-p62 بطيء للتعافي بعد فوتوبليتش؛ ومن ثم، لا p62 بروتين جداً المحمول. لهذه التجربة، مو = 25.62، أناو 74.38، t1/2 = = 442.79 s (7.38 دقيقة)، وعمق التبييض = 90.19. شريط المقياس = 5 ميكرومتر. هذا الفيديو تم تعديل من كاب et al.12<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59288/Fig_4-Vid_FINAL.avi" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض هذا الفيديو. (انقر بالزر الأيمن التحميل.)</a>

Watch this Scientific Journal Video about Fluorescence Recovery after Photobleaching of Yellow Fluorescent Protein Tagged p62 in Aggresome-like Induced Structures at JoVE.com

Fluorescence Recovery after Photobleaching of Yellow Fluorescent Protein Tagged p62 in Aggresome-like Induced Structures

الأسفار الانتعاش بعد p62 "فوتوبليتشينج من الأصفر فلوري البروتين معلم" في "الهياكل التي يسببها" مثل أجريسومي

يصف لنا بروتوكول شامل وعملي للأسفار الانتعاش بعد تجارب فوتوبليتشينج مع العيش الخلايا. على الرغم من أن البروتوكول استخدمت لقياس تنقل الأصفر p62 نيون معلم البروتين في هياكل المستحث أجريسومي، فإنه يمكن تطبيقها على مجموعة متنوعة من نظم الفحص المجهري والبروتينات الفلورية.

Fluorescence recovery after photobleaching (FRAP)&#160;is a microscopy technique that can be used to quantify protein mobility in live cells. In a typical ...

إن استرداد الفلورس الموجود بعد التحسس الضوئي، وبروتوكولات FRAP، إما غير مكتمل أو معقد بشكل مفرط. البروتوكول المعروض في هذا الفيديو مهم من حيث أنه شامل وعملي ومباشر. والميزة الرئيسية لهذه التقنية FRAP هو أنه يسمح لك بالكمية من تنقل البروتين داخل وفيما بين مقصورات الخلايا الفرعية في الخلايا الحية.ويجري حاليا دراسة البرنامج لأغراض علاجية وتشخيصية على السواء. ومن هذه الاستخدامات تحديد مدى الانتشار داخل نظم تسليم المخدرات في أنسجة مختلفة في الجسم الحي. ويمكن لهذه المعلومات باستخدام لتحسين بنية المخدرات وتكوينها.وقد وفرت تقنية التحليل المجهري لـ FRAP رؤى في مجموعة واسعة من المجالات التي يكون فيها فهم ظاهرة الانتشار أمرًا مهمًا. وتشمل هذه الخلايا والبيولوجيا الجزيئية، والبيولوجيا التنموية، وعلم الأعصاب، وعلوم المواد، والمواد الحيوية المتقدمة، واكتشاف المخدرات. على الرغم من أن البروتوكول الموصوف للاستخدام مع خلايا الثدييات ، يمكن تطبيق المفاهيم على أنظمة أخرى ، مثل الخلايا النباتية وخلايا الخميرة والبكتيريا.فرد الذي لم يسبق له أن أدى هذه التقنية قد النضال في تحديد الأمثل المعلمات الحصول على صورة ، وخلق منطقة الاستحواذ من الفائدة التي هي مناسبة للتجربة ، وحساب جزء المحمول ونصف من الانتعاش. عند محاولة هذا الإجراء لأول مرة، تأكد من إجراء العديد من التجارب التجريبية لتحسين البروتوكول في سياق أهداف تجربتك. إثبات الإجراء سيكون (ماليين كايب) فني من مختبري و(ديفيد راديماخر) مدير منشأة التصوير الأساسيةللبدء، إعداد لوحة من YFP-p62 المتحولة الخام 264.7 الضامة، وعلاجها مع السكاريد Lipopolys كما هو موضح في بروتوكول النص المرافق. بعد ذلك ، شطف الخلايا المعالجة مع عازلة تايرود الباردة الجليد مرة واحدة. ثم، إضافة ملليلتر اثنين من المخزن المؤقت التيرودي نوكودزول المكمل إلى لوحة، والسماح لوحات لاحتضان في أربع درجات مئوية لمدة 15 إلى 20 دقيقة قبل التصوير FRAP والتحليل.السماح للألواح لاحتضان في أربع درجات مئوية لمدة 15 إلى 20 دقيقة قبل التصوير FRAP والتحليل. في أكثر من الإعداد التصوير، حدد خط 514 نانومتر من الليزر أرغو/2، كما علامة الفلوريسنس لديه استثارة الذروة في 512 نانومتر، وانبعاثات الذروة في 527 نانومتر. بعد ذلك، في إطار التحكم في الليزر، انقر فوق Argon/2، 458، 477، 488، 514، ثم انقر فوق الزر "الاستعداد".بعد الانتظار حوالي ثلاث دقائق بالليزر للاحماء، انقر فوق الزر على. ثم تعيين قوة الليزر من الليزر إلى 100٪ واضغط Enter. المقبل، تعيين انتقال خط الليزر إلى 5٪ على المجهر، أنتقل إلى خطة-Apochromat 63x تكبير 1.40 رقمية فتحة هدف النفط.عرض العينة من خلال العدسة المجهر ووضع بنية مستحثة aggresome تشبه في وسط مجال الرؤية. ثم، في برنامج الاستحواذ، تعيين حجم الإطار إلى 512 في 512 بكسل، وسرعة المسح الضوئي إلى ثمانية، وعمق البيانات إلى 12 بت. كما يمكنك تعيين متوسط المسح الضوئي إلى واحد، والتكبير البصري إلى ثلاثة، واضغط على Enter.بعد ذلك ، se الثقب إلى 1.95 خطأ وحدات واكسب كاشف إلى 582 ، وهو أقل بقليل من التشبع. إنشاء منطقة مربعة الشكل من الفائدة للحصول على الصورة، التي لديها أبعاد 150 في 150 بكسل. قم بإعداد السلاسل الزمنية بحيث يتم مسح المنطقة التي تهمها ضوئيًا 35 مرة، مرة كل 30 ثانية.ثم، تعيين التحكم في التبييض بحيث photobleaching سيحدث بعد المسح الضوئي رقم خمسة، لجمع خمس صور prebleach من المنطقة ذات الأهمية. اضغط على مفتاح Enter للتأكيد. بعد ذلك، انتقل إلى نافذة "مناطق التبييض" وإنشاء منطقة التبييض دائرية الشكل من الفائدة داخل منطقة بنية مستحثة aggresome-like، التي يبلغ قطرها 10 بكسل.الآن، قم بتعيين عدد التكرارات إلى 300، واضغط مرة أخرى على مفتاح Enter. ثم، تعيين خط الليزر إلى 100٪ الطاقة، وأدخل 100 في مجال نقل النسبة المئوية بالليزر، واضغط Enter. وأخيرا ، تشغيل برنامج الحصول على صورة لجمع البيانات FRAP من 10 الهياكل aggresome مثل الناجمة في 10 خلايا مع أقل من حوالي ثلاثة ميكرون من الانجراف.لبدء تحليل البيانات، قم أولاً بنقل ملفات AIM lsm إلى جهاز كمبيوتر شخصي لتحليل البيانات. تصحيح ل الانجراف الصورة عن طريق محاذاة أو مطابقة كومة من الصور سلسلة الوقت من منطقة الاستحواذ من الفائدة من خلال فتح كل ملف AIM lsm مع برنامج معالجة الصور. ثم، حدد الإضافات والتسجيل StackReg والترجمة، متبوعاً بتحديد الإضافات والتسجيل StackReg ثم نص جامد.المقبل ، قم بإعداد إدارة المنطقة من المصالح لقياس كثافة الإشارة في منطقة التبييض من الفائدة. لهذا، حدد الأداة البيضاوية ثم رسم دائرة في منطقة التبييض من الفائدة مع قطر 10 بكسل، ثم انقر فوق الزر إضافة. مرة واحدة تضاف ، وإعداد البرنامج لقياس كثافة الإشارة في منطقة السيطرة من الفائدة.حدد أداة المستطيل، ثم ارسم مربعًا من 20 بكسل في 20 بكسل في منطقة التحكم، وانقر على الزر إضافة. وأخيرا ، قم بإنشاء منطقة من المصالح مدير لقياس كثافة الإشارة في منطقة خلفية من الفائدة. حدد أداة المستطيل، وارسم مربعًا من 20 بكسل في 20 بكسل في منطقة الخلفية، ثم انقر فوق الزر إضافة.بعد إضافة المناطق التي سيتم تحليلها في مدير ROI ، إعادة تسميتها تبييض العائد على الاستثمار ، ومراقبة العائد على الاستثمار ، والعائد على خلفية ، وفقا لذلك. قياس كثافة الإشارة في كل منطقة. لإنجاز ذلك، حدد "عائد الاستثمار" Bleach و "التحكم في العائد على الاستثمار" و"عائد الاستثمار في الخلفية"، ثم انتقل إلى المزيد، وحدد Multi Measure.قم بلصق النتائج في جدول بيانات في أعمدة تحمل عنواناً "عائد الاستثمار الخاص بـ Bleach" و"عائد الاستثمار التحكم" و"عائد الاستثمار في الخلفية" على التوالي. ابدأ بخلفية تصحيح كثافة الإشارة في ROI Bleach و ROI التحكم بطرح القيم في العمود المسمى عائد الاستثمار في الخلفية من القيم في العمود المسمى "ROI التبييض" والعمود المسمى "عائد الاستثمار التحكم". تسمية هذه الأعمدة الجديدة تصحيح العائد على الاستثمار التبييض وتصحيح العائد على الاستثمار التحكم.بعد ذلك، تطبيع الإشارة في ROI التبييض إلى الإشارة تصحيح الخلفية في العائد على الاستثمار التحكم. تقسيم القيم في العمود المسمى "ROI التبييض" مصححة حسب القيم في العمود المسمى "تصحيح العائد على الاستثمار التحكم". تسمية هذا العمود الجديد ، تطبيع تصحيح التبييض ROI.ثم، تطبيع الإشارة في العمود "معدل تصحيح التبييض" إلى متوسط قيم prebleach الخمسة في "عائد الاستثمار التبييض". تقسيم القيم في العمود المسمى تطبيع تصحيح التبييض ROI حسب متوسط قيم prebleach الخمسة في "عائد الاستثمار التبييض". تسمية هذا العمود الجديد، تطبيع تصحيح Prebleach متوسط التبييض ROI.وأخيراً، افتح برنامجًا لمعالجة الصور. منحنى تناسب تطبيع وتصحيح بيانات العائد على الاستثمار التبييض عن طريق نسخ postbleach تطبيع تسويتها قيم العائد على الاستثمار التبييض وتصحيحها والقيم الزمنية المقابلة. لصقها في إطار الأصلح المنحنى، حدد استرداد أسي من القائمة المنسدلة أصلح المنحنى، وحدد احتواء.يظهر هنا هو نموذجي فيديو من الانتعاش fluorescence بعد photobleaching لP264.7 الخلايا المعالجة مع LPS. انتعاش الفلوريسنس داخل منطقة الهيكل المستحث aggresome مثل الفائدة ، بطيئة. تستخدم هذه التجربة التحسس الضوئي لفحص درجة التنقل p62.p62 fluorescence في الهياكل المستحثة aggresome مثل، prebleach و postbleach، هو مبين هنا. كما هو موضح في هذا الفيديو، يمكن تتبع كثافة الفلوريسنس مع مرور الوقت. بعد تصحيح الخلفية والتطبيع، يمكن حساب الفلوري p62 لوصف الكسر المتنقل كـ 22٪ الكسر غير المتحرك كـ 78٪، ويصف نصف الوقت من الانتعاش داخل الهياكل المستحثة aggresome- مثل، كما 2.14 دقيقة.تذكر، من المهم بشكل خاص تحديد منطقة الاستحواذ بشكل صحيح من الفائدة بحيث يتضمن ALIS من الفائدة، منطقة مراقبة من الفائدة، ومنطقة خلفية من الاهتمام. بعد هذا الإجراء، يمكن تطبيق تقنيات أخرى المجهر الفلورسنت الكمية الأخرى، مثل فقدان الفلوريسنس في photobleaching، الوجه، وphotobleaching انتقائية. في حين أن الوجه يقيس درجة الاستمرارية والتواصل بين المقصورات دون الخلوية ، فإن التصوير الضوئي الانتقائي يوفر معلومات حركية حول النقل النشط والسلبي للبروتينات إلى العضيات ، أو بين المناطق الغنية بالبروتين.وقد تم تطوير FRAP في البداية لتحديد الحركة الجانبي للبروتينات في أغشية الخلايا. وفي وقت لاحق، تم استخدامه لقياس حركة البروتين داخل وفيما بين مجموعة متنوعة من المقصورات دون الخلوية، مما مهد الطريق للباحثين للإجابة على الأسئلة في مجموعة متنوعة من المجالات، بما في ذلك البيولوجيا الخلوية والجزيئية، والبيولوجيا التنموية، وعلم الأعصاب، وعلوم المواد، والمواد الحيوية المتقدمة، واكتشاف الأدوية.

Research

JoVE Journal

Biology

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

تلطيخ من البروتينات في الهلام مع Coomassie G - 250 دون عضوي حمض الخليك والمذيبات

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Fluorescent Labeling of Drosophila Heart Structures

Fluorescent Labeling of Drosophila Heart Structures

بطاقات المواد الفلورية ذبابة الفاكهة</emهياكل القلب>

The Drosophila melanogaster dorsal vessel, or heart, is a tubular structure comprised of a single layer of contractile cardiomyocytes, pericardial cells ...

Measuring Diffusion Coefficients via Two-photon Fluorescence Recovery After Photobleaching

قياس معاملات إنتشار عبر ثنائي الفوتون الاسترداد بعد الإسفار Photobleaching

Multi-fluorescence recovery after photobleaching is a microscopy technique used to measure the diffusion coefficient (or analogous transport parameters) ...

Using the GELFREE 8100 Fractionation System for Molecular Weight-Based Fractionation with Liquid Phase Recovery

باستخدام نظام التقطير GELFREE 8100 لتقطير الوزن الجزيئي وبناء مع مرحلة الانتعاش السائل

The GELFREE 8100 Fractionation System is a novel protein fractionation system designed to maximize protein recovery during molecular weight based ...

Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection

الوقت الفاصل بين التصوير من الانقسام الميتوزي بعد ترنسفكأيشن سيرنا

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and ...

Photobleaching Assays (FRAP &amp; FLIP) to Measure Chromatin Protein Dynamics in Living Embryonic Stem Cells

Photobleaching Assays FRAP & FLIP to Measure Chromatin Protein Dynamics in Living Embryonic Stem Cells

Photobleaching فحوصات (FRAP و FLIP) لقياس حيوية الكروماتين البروتين في الخلايا الحية الجذعية الجنينية

Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) and Fluorescence Loss In Photobleaching (FLIP) enable the study of protein dynamics in living cells with ...

Determination of Lipid Raft Partitioning of Fluorescently-tagged Probes in Living Cells by Fluorescence Correlation Spectroscopy (FCS)

Determination of Lipid Raft Partitioning of Fluorescently-tagged Probes in Living Cells by Fluorescence Correlation Spectroscopy FCS

تقرير من الطوافة الدهن تقسيم المسابر Fluorescently الموسومة في الخلايا الحية بواسطة التحليل الطيفي الارتباط الإسفار (FCS)

In the past fifteen years the notion that cell membranes are not homogenous and rely on microdomains to exert their functions has become widely accepted. ...

Intravital Microscopy for Imaging Subcellular Structures in Live Mice Expressing Fluorescent Proteins

حيوي داخلي المجهري للهياكل التصوير التحت خلوية في الفئران لايف تعرب عن البروتينات الفلورية

Here we describe a procedure to image subcellular structures in live rodents that is based on the use of confocal intravital microscopy. As a model organ, ...

Simultaneous Multicolor Imaging of Biological Structures with Fluorescence Photoactivation Localization Microscopy

في وقت واحد متعدد الألوان التصوير من الهياكل البيولوجية مع الإسفار تنشيط ضوئي توطين المجهر

Localization-based super resolution microscopy can be applied to obtain a spatial map (image) of the distribution of individual fluorescently labeled ...

Protein-protein Interactions Visualized by Bimolecular Fluorescence Complementation in Tobacco Protoplasts and Leaves

البروتين البروتين التفاعلات تصور من قبل ثنائي الجزيء الإسفار التكملة في Protoplasts التبغ وأوراق

Many proteins interact transiently with other proteins or are integrated into multi-protein complexes to perform their biological function. Bimolecular ...