Name: fluorescence recovery after photobleaching of yellow fluorescent protein tagged p62 in aggresome-like induced structures
Uploaded: 2019-03-26T14:00:00
Duration: 12 min 58 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Fluorescence Recovery after Photobleaching of Yellow Fluorescent Protein Tagged p62 in Aggresome-like Induced Structures at JoVE.com

Vi takke Dr. Seth Robia på Loyola University Chicago for hans værdifulde kommentarer på dette håndskrift. Dette arbejde blev støttet af NIH grant 1R01NS073967-01A1 til Joanna C. Bakowska.

<ol>
	<li>Axelrod, D., Koppel, D. E., Schlessinger, J., Elson, E., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mobility+measurement+by+analysis+of+fluorescence+photobleaching+recovery+kinetics.">Mobility measurement by analysis of fluorescence photobleaching recovery kinetics.</a> Biophysical Journal. 16 (9), 1055-1069 (1976).</li><li>Peters, R., Peters, J., Tews, K. H., Bahr, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microfluorimetric+study+of+translational+diffusion+in+erythrocyte+membranes.">A microfluorimetric study of translational diffusion in erythrocyte membranes.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 367 (3), 282-294 (1974).</li><li>Patterson, G., Day, R. N., Piston, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+protein+spectra.">Fluorescent protein spectra.</a> Journal of Cell Science. 114, 837-838 (2001).</li><li>Rabut, G., Ellenberg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photobleaching+techniques+to+study+mobility+and+molecular+dynamics+of+proteins+in+live+cells:+FRAP,+iFRAP,+and+FLIP.">Photobleaching techniques to study mobility and molecular dynamics of proteins in live cells: FRAP, iFRAP, and FLIP.</a> Live Cell Imaging: A Laboratory Manual (1st ed). , 101-126 (2004).</li><li>Fritzsche, M., Charras, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+protein+reaction+dynamics+in+living+cells+by+fluorescence+recovery+after+photobleaching.">Dissecting protein reaction dynamics in living cells by fluorescence recovery after photobleaching.</a> Nature Protocols. 10 (5), 660-680 (2015).</li><li>Goodwin, J. S., Kentworthy, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photobleaching+approaches+to+investigate+diffusional+mobility+and+trafficking+of+Ras+in+living+cells.">Photobleaching approaches to investigate diffusional mobility and trafficking of Ras in living cells.</a> Methods. 37 (2), 154-164 (2005).</li><li>Hildick, K. L., Gonz&#224;lez-Gonz&#224;lez, I. M., Jaskolski, F., Henley, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lateral+diffusion+and+exocytosis+of+membrane+proteins+in+cultured+neurons+assessed+using+fluorescence+recovery+and+fluorescence-loss+photobleaching.">Lateral diffusion and exocytosis of membrane proteins in cultured neurons assessed using fluorescence recovery and fluorescence-loss photobleaching.</a> Journal of Visualized Experiments. (60), e3747 (2012).</li><li>Nissim-Rafinia, M., Meshorer, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photobleaching+assays+(FRAP+&amp;+FLIP)+to+measure+chromatin+protein+dynamics+in+living+embryonic+stem+cells.">Photobleaching assays (FRAP &amp; FLIP) to measure chromatin protein dynamics in living embryonic stem cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (52), e2696 (2011).</li><li>Zheng, C., Petralia, R. S., Wang, Y., Kachar, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+recovery+after+photobleaching+(FRAP)+of+fluorescence+tagged+proteins+in+dendritic+spines+of+cultured+hippocampal+neurons.">Fluorescence recovery after photobleaching (FRAP) of fluorescence tagged proteins in dendritic spines of cultured hippocampal neurons.</a> Journal of Visualized Experiments. (50), e2568 (2011).</li><li>Thevenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+pyramid+approach+to+subpixel+registration+based+on+intensity.">A pyramid approach to subpixel registration based on intensity.</a> IEEE Transactions on Image Processing. 7 (1), 27-41 (1998).</li><li>Ishikawa-Ankerhold, H. C., Ankerhold, R., Drummen, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+fluorescence+microscopy+techniques--FRAP,+FLIP,+FLAP,+FRET+and+FLIM.">Advanced fluorescence microscopy techniques--FRAP, FLIP, FLAP, FRET and FLIM.</a> Molecules. 17 (4), 4047-4132 (2012).</li><li>Cabe, M., Rademacher, D. J., Karlsson, A. B., Cherukuri, S., Bakowska, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PB1+and+UBA+domains+of+p62+are+essential+for+aggresome-like+induced+structure+formation.">PB1 and UBA domains of p62 are essential for aggresome-like induced structure formation.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 503 (4), 2306-2311 (2018).</li><li>Brown, E. B., Wu, E. S., Zipfel, W., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+molecular+diffusion+in+solution+by+multiphoton+fluorescence+photobleaching+recovery.">Measurement of molecular diffusion in solution by multiphoton fluorescence photobleaching recovery.</a> Biophysical Journal. 77 (5), 2837-2849 (1999).</li><li>Centonze, V., Pawley, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tutorial+on+practical+confocal+microscopy+and+the+use+of+the+confocal+test+specimen.">Tutorial on practical confocal microscopy and the use of the confocal test specimen.</a> Handbook of biological confocal microscopy. , 549-570 (1995).</li><li>Chudakov, D. M., Matz, M. V., Lukyanov, S., Lukyanov, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+proteins+and+their+applications+in+imaging+living+cells+and+tissues.">Fluorescent proteins and their applications in imaging living cells and tissues.</a> Physiological Reviews. 90 (3), 1103-1163 (2010).</li></ol>

Forfatterne har nogen interessekonflikt at videregive.

Vi leverer en omfattende, praktisk og enkel trinvis protokol for FRAP eksperimenter med levende celler. Heri, protokollen blev brugt til at måle YFP-p62 i ALIS mobilitet i RAW264.7 makrofager, men det kan anvendes til mange af laser scanning Konfokal mikroskop systemer og genetisk kodet fluorescerende proteiner, der er nu tilgængelige. For enhver mikroskopi system er pilotforsøg afgørende for fastlæggelse af de optimale FRAP parametre, herunder erhvervelse, blegemiddel og kontrol ROI størrelser, laser intensitet for photobleaching, og prebleach og postbleach image erhvervelse. Det er rimeligt at forvente de optimale FRAP parametre er forskellige for hver genetisk kodet fluorescerende proteiner og celle linje.
Vigtige faktorer at overveje, hvornår gennemfører en FRAP eksperiment omfatter (a) at opnå egnet blegemiddel dybde, (b) brugen af et kort blegning skridt, (c) giver tilstrækkelig tid postbleach at observere fuld recovery funktion, (d) photobleaching effektivitet, (e). cytotoksicitet med gentagne FRAP, og (f) optagelse af et kontrolelement til fluorescens tab på grund af gentagne billeddannelse. Vi anbefaler, at der blegemiddel dybde, som kan beregnes efter ligning i afsnit 3.3.1, ≥9013. Når blegemiddel dybde er < 90, graden af postbleach fluorescens recovery vil være undervurderet, og værdierne af jegf, Mfog t1/2 vil være forkert. Selv om varigheden og intensiteten af blegemiddel-inducerende laserpulser kan variere mellem FRAP eksperimenter, er det vigtigt, at photobleaching skridt er korte og betydeligt hurtigere end fluorescens opsving funktion. Hvis det ikke er, kunne så en betydelig mængde af fluorescens opsving opstå under trinnet blegning. Med en lang blegemiddel tid, fluorescens opsving under blegning trin ikke vil blive målt, og det ville føre til forkerte målinger af jegf, Mf, ogt1/2. Hertil kommer, at få de korrekte værdier for jegf, Mf, ogt1/2, erhvervelse ROI bør overholdes, postbleach indtil niveauet fluorescens i blegemiddel ROI har nået et plateau. For eksempel, i vores FRAP eksperimenter, der var ingen forskel mellem den jegf, Mfog t1/2 værdier når vi observeret YFP-p62 fluorescens i blegemiddel ROI for 32,2 min postbleach versus hvornår vi observeret YFP-p62 i blegemiddel ROI for 15.1 min postbleach; Derfor konkluderede vi, at funktionen opsving nået et plateau på 15,1 min postbleach12. Med hensyn til photobleaching effektivitet øger photobleaching med kvadratet på den optiske zoom faktor14. Således brug af høj optisk zoom-objektiver er gunstige for hurtig photobleaching men kan resultere i uønskede photobleaching under erhvervelse sidstnævnte kan tages højde for ved imaging en kontrol ROI. Gentagne photobleaching er at undgås, da det kan føre til generation af cytotoksiske reaktive ilt arter (ROS). Men graden af ROS generation på grund af eksponering for en høj intensitet laser er lavere for genetisk kodet fluorescerende proteiner end for kemisk fluorophores (fx fluorescerende antistoffer)15, og ROS genereret er mere tilbøjelige til at reagere inden for den genetisk kodet fluorescerende proteiner end med andre molekyler i celle4. Ud over øget sandsynligheden for generering af cytotoksiske ROS, er gentagne photobleaching skal undgås, da det er svært at kontrollere. Endelig, selv om lavt laser transmission bruges til at erhverve alle ikke-bleach billeder, vil nogle photobleaching altid forekomme, som skal kontrolleres. Mulige kontrol for dette omfatter overvågning fluorescens i et kontrolelement ROI inden for erhvervelse ROI, at opnå kontrol billeder i en nærliggende ubleget celle og udfører kontrol eksperimenter med identiske indstillinger for dem, der anvendes i den photobleaching eksperimenter, men uden photobleaching begivenheden.

Fluorescens opsving efter photobleaching (FRAP) er en mikroskopi teknik, der kan bruges til at kvantificere protein dynamics i levende celler,1,2. FRAP popularitet er vokset på grund af den kommercielle udbredelse af laser scanning Konfokal mikroskoper med høj opløsning, hastighed og følsomhed, og en "regnbue" af genetisk kodet fluorescerende proteiner, såsom grøn fluorescerende protein (normal god landbrugspraksis) og gul fluorescerende proteiner (YFP)3. Genetisk kodet fluorescerende proteiner er sammenvoksede til en protein af interesse at tillade subcellulært lokaliseringen af protein af interesse. I en typisk FRAP eksperiment, er steady-state fluorescens i en erhvervelse region af interesse (ROI) i en celle observeret via gentagne billeddannelse af denne ROI med lav intensitet laserlys. Efterfølgende, er de fluorescerende molekyler hurtigt og uigenkaldeligt svækket i en foruddefineret undersæt af erhvervelse ROI, benævnt blegemiddel ROI, ved kortvarig påvirkning for høj intensitet laserlys. Som ny ubleget proteiner genopbygge bleget proteiner over tid, indeholder hastighed og intensitet af fluorescens opsving i blegemiddel ROI oplysninger om protein mobilitet (figur 1)4.
Vores interesse i fastsættelsen af ubiquitin bindende protein p62 (også kendt som sequestosome-1) i aggresome-lignende menneskeskabte strukturer (ALIS) i murine RAW264.7 makrofager mobilitet efter stimulation med LPS (LPS) førte os til at revidere FRAP litteratur. Desværre er mange af de eksisterende FRAP protokoller er ufuldstændig eller overdrevent komplekse5,6,7,8,9. Nogle giver ikke detaljerede oplysninger om laser indstillinger, beam sti konfiguration og image erhvervelse parametre5,6,7,8,9. Andre udeladt vigtige detaljer om dataanalyse, såsom hvordan man kan løse problemet med blegemiddel ROI drift6,9 eller hvordan man beregner vigtigt opsving parametre, herunder mobile brøkdel (Mf), immobile fraktion (Jegf), og halv-time inddrivelse (t½)5,7. Omvendt, andre lagt for meget vægt på komplekse matematiske formler bruges til at beregne Mf, jegfog t1/25,6,8,9. Vores formål er således at levere en omfattende, praktisk og enkel trinvis protokol for FRAP eksperimenter med levende celler.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:835px;" width="835">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium</td>
			<td style="width:211px;">Hyclone</td>
			<td style="width:137px;">SH30022.01</td>
			<td style="width:167px;">High Glucose (4.5 g/L)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Fetal bovine serum</td>
			<td style="width:211px;">Gemini Bio-Products</td>
			<td style="width:137px;">100-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Glass bottom dishes</td>
			<td style="width:211px;">MatTek</td>
			<td style="width:137px;">P35G-1.5-14-C</td>
			<td>35-mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Image J software</td>
			<td style="width:211px;">National Institutes of Health</td>
			<td style="width:137px;">N.A.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Lipopolysaccharide (LPS)</td>
			<td style="width:211px;">Sigma</td>
			<td style="width:137px;">L4391</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Nocodazole</td>
			<td style="width:211px;">Sigma</td>
			<td style="width:137px;">M1404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Penicillin-streptomycin solution</td>
			<td style="width:211px;">Corning</td>
			<td style="width:137px;">30-002-Cl</td>
			<td>100&#215;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Plan-Apochromat 63&#215;/1.40 oil objective</td>
			<td style="width:211px;">Carl Zeiss MicroImaging, Inc</td>
			<td style="width:137px;">4407629904000000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Polyethylenimine (PEI)</td>
			<td style="width:211px;">Polysciences</td>
			<td style="width:137px;">23966-1</td>
			<td>linear (MW 25,000)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">RAW 264.7 murine macrophages</td>
			<td style="width:211px;">ATCC</td>
			<td style="width:137px;">TIB-71</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Zeiss confocal microscope</td>
			<td style="width:211px;">Carl Zeiss MicroImaging, Inc</td>
			<td style="width:137px;">LSM 510</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fluorescence recovery after photobleaching of yellow fluorescent protein tagged p62 in aggresome-like induced structures

Fluorescens opsving efter photobleaching (FRAP) er en mikroskopi teknik, der kan bruges til at kvantificere protein mobilitet i levende celler. I en typisk FRAP eksperiment, er steady-state fluorescens observeret ved gentagen imaging med lav intensitet laserlys. Efterfølgende, er de fluorescerende molekyler hurtigt og uigenkaldeligt svækket via kort udsættelse for høj intensitet laserlys. Oplysninger om protein mobilitet er opnået ved at overvåge tilbagebetalingen af fluorescens. Vi brugte FRAP for at bestemme p62 i aggresome-lignende menneskeskabte strukturer (ALIS) i murine makrofager mobilitet efter stimulation med LPS (LPS). Fordi mange eksisterende FRAP protokoller er enten ufuldstændige eller komplekse, var vores mål at give en omfattende, praktisk og enkel trinvis protokol for FRAP eksperimenter med levende celler. Her beskriver vi RAW264.7 makrofag Transfektion med gul fluorescerende proteiner-p62 (YFP-p62), induktion af ALIS ved at udsætte celler til LP'ER og en trinvis metode til indsamling af prebleach og postbleach FRAP billeder og data analyse. Endelig vil diskutere vi vigtige faktorer at overveje, når de gennemfører en FRAP eksperiment.

Vist her er resultatet af en typisk eksperiment, hvor vi brugte FRAP for at undersøge graden af mobilitet af p62 i ALIS i RAW264.7 celler behandles med LPS for 3-5 h12. Figur 3 A viser de rå data fra et blegemiddel, styre og baggrund ROI, når stakken af billeder var blevet justeret for at korrigere for små mængder (< ~ 3 µm) billede drift af ALIS. YFP-p62 fluorescens i denne ALIS på prebleach og postbleach er vist i figur 3E og supplerende Video 1. Figur 3 B viser disse data efter baggrund-korrektion. Figur 3 C viser disse data efter korrektion for fluorescens i kontrolelementet ROI. Figur 3 D viser disse data normaliseret til den gennemsnitlige fluorescens af 5 prebleach værdierne i blegemiddel ROI. Grad af blegning var tilstrækkeligt i dette eksperiment (blegemiddel dybde = 91.94). YFP-p62 fluorescens inden for denne ALIS inddrives langsomt, som t1/2 = 128.27 s (2.14 min). YFP-p62 var ikke en meget bærbare protein i dette eksperiment, som Mf = 21.97 og jegf = 78.03.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59288/59288fig1.jpg"> Figur 1 : Et diagram i en RAW264.7 celle og trin til billedanalyse når FRAP billeder har været justeret for at korrigere for billede drift af ALIS. (A) Diagram af en RAW264.7 celle skildrer flere ALIS og blegemiddel, kontrol og baggrunden ROIs inden for erhvervelse ROI. (B) en idealiseret skildring af rå FRAP oplysninger indhentet i blegemiddel, kontrol og baggrunden ROIs i panelet A. (C) en idealiseret graf af rå FRAP data, der har været baggrund-korrigeret. (D) en idealiseret graf af baggrundskorrigerede FRAP data, der er blevet normaliseret til fluorescens i kontrolelementet ROI. (E) en idealiseret graf af normaliserede og baggrundskorrigeret FRAP data, der er blevet normaliseret til den prebleach fluorescens i blegemiddel ROI. Forkortelser: Con = kontrol; BG = baggrund. Dette tal blev ændret fra Rabut og Ellenberg4. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59288/59288fig1large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59288/59288fig2.jpg"> Figur 2: Billeder af brugergrænsefladen i AIM-softwaren (Table of Materials) for laser udvælgelse, fjernlys sti konfiguration og image erhvervelse parametre for FRAP eksperimenter. (A) Laser kontrollere skærmen viser Argon/2 laser linjer, output, og tube nuværende bruges. (B) konfiguration kontrollere skærmen viser beam splitter og emission filter indstillinger, der bruges. (C) Scan kontrollere skærmen viser indstillingen anvendes til billede erhvervelse. (D) Scan kontrollere skærmen viser pinhole, detektor gevinst, forstærker offset, forstærker gevinst og transmission indstillinger for Argon/2 514 nm laser linje. (E) tidsserier kontrollere skærmen viser de tid serien indstillinger anvendes. (F) blegemiddel kontrollere skærmen viser prebleach og postbleach parametre, der anvendes. Forkortelser: HFT = Haupt Farb Teiler (primære dichroic beam splitter); NT1 = Neben Farb Teiler 1 (første sekundære dichroic beam splitter); NT2 = Neben Farb Teiler 2 (andet sekundære dichroic beam splitter); EF = emission filter. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59288/59288fig2large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59288/59288fig3.jpg"> Figur 3 : En repræsentativ FRAP eksperiment at studere YFP-p62 dynamics i ALIS i RAW264.7 celler. (A) rå fluorescens intensitet data for et blegemiddel, kontrol og baggrunden ROI. (B) oplysningerne i panelet A efter blegemiddel og kontrol ROI havde været korrigeret for fluorescens i baggrunden ROI. (C) oplysningerne i paneler A og B efter normalisering fluorescens-intensiteten i blegemiddel ROI konto til fluorescens i kontrolelementet baggrundskorrigeret ROI. (D) oplysningerne i paneler A-C efter normalisering fluorescens-intensiteten i normaliserede og baggrundskorrigeret blegemiddel ROI til gennemsnittet af de første 5 prebleach værdier i blegemiddel ROI. Mf = 21.97, jegf = 78.03, t1/2 = 128.27 s (2.14 min) og blegemiddel dybde = 91.94. (E) en afbildning af en ALIS på prebleach (1,5 min) og postbleach (0, 6 og 16 min). Skalalinjen = 5 µm og gælder for alle paneler. Forkortelser: Con = kontrol; BG = baggrund; Corr. = korrigeret; Normen. = normaliseret; Gns. = gennemsnit. Dette tal blev ændret fra Cabe et al.12<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59288/59288fig3large.jpg" target="_blank">venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Supplementary Video 1" src="/files/ftp_upload/59288/59288supvideo1.jpg"> Supplerende Video 1: en typisk ALIS i en RAW264.7 makrofag før og efter photobleaching. YFP-p62 Fluorescens er langsom til at inddrive efter photobleach; dermed er p62 ikke en meget bærbare protein. For dette eksperiment, Mf = 25.62, jegf = 74.38, t1/2 = 442.79 s (7.38 min) og blegemiddel dybde = 90.19. Skalalinjen = 5 µm. Denne video blev ændret fra Cabe et al.12<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59288/Fig_4-Vid_FINAL.avi" target="_blank">venligst klik her for at se denne video. (Højreklik for at hente.)</a>

Watch this Scientific Journal Video about Fluorescence Recovery after Photobleaching of Yellow Fluorescent Protein Tagged p62 in Aggresome-like Induced Structures at JoVE.com

Fluorescence Recovery after Photobleaching of Yellow Fluorescent Protein Tagged p62 in Aggresome-like Induced Structures

Fluorescens opsving efter Photobleaching af gul fluorescerende proteiner markeret p62 i Aggresome-lignende induceret strukturer

Vi beskriver en omfattende og praktisk protokol til fluorescens opsving efter photobleaching eksperimenter med levende celler. Selv om protokollen blev brugt til at måle mobilitet af gul fluorescerende proteiner-tagged p62 i aggresome-lignende menneskeskabte strukturer, kan det anvendes til en lang række mikroskopi systemer og fluorescerende proteiner.

Fluorescence recovery after photobleaching (FRAP)&#160;is a microscopy technique that can be used to quantify protein mobility in live cells. In a typical ...

Eksisterende fluorescens opsving efter photobleaching, FRAP protokoller, er enten ufuldstændige eller alt for komplekse. Protokollen præsenteres i denne video er betydelig i, at det er omfattende, praktisk og ligetil. Den største fordel ved denne FRAP-teknik er, at den giver mulighed for kvantificering af proteinmobilitet i og mellem delcellerum i levende celler.FRAP er ved at blive undersøgt til både terapeutiske og diagnostiske formål. En sådan anvendelse er at kvantificere diffusion inden for lægemiddelleveringssystemer i forskellige væv in vivo. Disse oplysninger kan ved hjælp af bruges til at optimere et lægemiddel struktur og sammensætning.FRAP-mikroskopiteknikken har givet indsigt på en bred vifte af områder, hvor forståelse af diffusionsfænomen er af interesse. Disse omfatter celle- og molekylærbiologi, udviklingsbiologi, neurovidenskab, materialevidenskab, avancerede biomaterialer og opdagelse af lægemidler. Selv om den beskrevne protokol er til brug med pattedyrceller, kan begreberne anvendes på andre systemer, såsom planteceller, gærceller og bakterier.En person, der aldrig har udført denne teknik kan kæmpe med at bestemme de optimale billede erhvervelse parametre, skabe en erhvervelse region af interesse, der er egnet til deres eksperiment, og beregning af den mobile fraktion og halftime af nyttiggørelse. Når du forsøger denne procedure for første gang, skal du sørge for at udføre flere pilotforsøg for at optimere protokollen i forbindelse med formålet med dit eksperiment. Demonstration af proceduren vil være Maleen Cabe, en tekniker fra mit laboratorium, og David Rademacher, kernen imaging facilitet manager.Til at begynde, forberede en plade af YFP-p62 transficeret RAW264.7 makrofager, og behandle dem med Lipopolysaccharid som beskrevet i den medfølgende tekstprotokol. Skyl derefter de behandlede celler med iskold Tyrods buffer én gang. Derefter tilsættes to milliliter Nocodazol-suppleret Tyrod's buffer til pladen, og lad pladerne til at inkubere ved fire grader Celsius i 15 til 20 minutter før FRAP billeddannelse og analyse.Lad pladerne inkubere ved fire grader Celsius i 15 til 20 minutter før FRAP-billeddannelse og analyse. Over på billeddannelse setup, skal du vælge 514 nanometer linje Argon / 2 laser, som fluorescens markør har en peak excitation på 512 nanometer, og en peak emission på 527 nanometer. Klik derefter på Argon/2, 458, 477, 488, 514 i vinduet Laserkontrol, og klik derefter på knappen Standby.Når du har ventet ca. tre minutter på, at laseren skal varmes op, skal du klikke på knappen Til. Indstil derefter lasereffekten af laseren til 100 %, og tryk på Enter. Dernæst indstille transmission af laser linje til 5%På mikroskopet, drej til Plan-Apochromat 63x forstørrelse 1,40 numerisk blænde olie mål.Se prøven gennem mikroskopet okular og placere en aggresome-lignende induceret struktur i midten af synsfeltet. Derefter skal du i anskaffelsessoftwaren indstille rammestørrelsen til 512 gange 512 pixel, scanningshastigheden til otte og datadybden til 12 Bit. Angiv også scanningsgennemsnittet til ét, den optiske zoom til tre, og tryk på Enter.Dernæst se pinhole til 1,95 fejlenheder og detektor gevinst til 582, hvilket er lige under mætning. Opret et kvadratisk interesseområde for billedopekøbet, der har dimensionerne 150 gange 150 pixel. Konfigurer tidsserierne, så interesseområdet scannes 35 gange, en gang hvert 30.Derefter indstille blegemiddel kontrol sådan, at photobleaching vil forekomme efter scanning nummer fem, for at indsamle fem prebleach billeder af regionen af interesse. Tryk på Enter for at bekræfte. Dernæst skal du gå til Vinduet Bleach Regioner og skabe en cirkulærformet blegemiddelregion af interesse inden for det aggresome-lignende inducerede strukturområde, der har en diameter på 10 pixels.Angiv nu antallet af gentagelser til 300, og tryk igen på Enter. Derefter skal du indstille laserlinjen til 100 %strøm, og indtast 100 i feltet transmissionsprocent for laseren, og tryk på Enter. Endelig køre billedet erhvervelse program til at indsamle FRAP data fra 10 aggresome-lignende inducerede strukturer i 10 celler med mindre end omkring tre mikron af drift.For at starte dataanalyse, først overføre AIM lsm filer til en personlig computer til dataanalyse. Korrekt for billeddrift ved at justere eller matche stakken af tidsseriebilleder af anskaffelsesområdet af interesse ved at åbne hver AIM lsm-fil med et billedbehandlingsprogram. Vælg derefter Plugins, Registrering, StackReg og Oversættelse efterfulgt af valg af plugins, registrering, StackReg og derefter Rigid Body.Dernæst oprette regionen interesse manager til at måle signalintensiteten i blegemiddel region af interesse. Til dette skal du markere det ovale værktøj, derefter tegne en cirkel i blegemiddelområdet af interesse med en diameter på 10 pixel og derefter klikke på knappen Tilføj. Når det er tilføjet, skal du konfigurere programmet til at måle signalintensiteten i det pågældende kontrolområde.Vælg rektangelværktøjet, tegn derefter en firkant på 20 ud af 20 pixel i kontrolområdet, og klik på knappen Tilføj. Endelig oprettes interesseforvalteren for at måle signalintensiteten i området af interesse. Vælg rektangelværktøjet, tegn en firkant på 20 ud af 20 pixel i baggrundsområdet, og klik derefter på knappen Tilføj.Når du har tilføjet de områder, der skal analyseres i ROI Manager, skal du omdøbe dem Bleach ROI, Kontrolafkastet og baggrundsafkastet i overensstemmelse hermed. Mål signalintensiteten i hver region. For at opnå dette skal du vælge Blege investeringsafkast, kontrolaf investeringsafkast og baggrundsafkast og derefter gå til Mere og vælge Multi measure.Indsæt resultaterne i et regneark i kolonner med navnet henholdsvis blegeafkast, kontrolafkastet og baggrundsafkastet. Start med at korrigere signalintensiteten i bleach-investeringsafkastet og kontrolafkastet ved at trække værdierne i kolonnen baggrundsafkastet fra værdierne i kolonnen med navnet Bleach ROI og kolonnen Control ROI. Mærc disse nye kolonner Korrigeret Bleach ROI og Korrigeret Kontrol ROI.Derefter normaliseres signalet i bleach-investeringsafkastet til det baggrundskorrigerede signal i kontrolafkastet. Opdel værdierne i kolonnen Korrigeret blegemiddelafkast med værdierne i kolonnen Rettet kontrolafkast. Mærk denne nye kolonne, normaliseret korrigeret blegemiddel ROI.Normaliser derefter signalet i kolonnen Normaliseret korrigeret blegemiddelafkast til gennemsnittet af de fem forbleach-værdier i bleach-investeringsafkastet. Divider værdierne i kolonnen normaliseret normaliseret blegemiddelafkast med gennemsnittet af de fem forblerværdier i bleach-investeringsafkastet. Mærk denne nye kolonne, Normaliseret Korrigeret Prebleach Gennemsnitlig Bleach ROI.Endelig skal du åbne et program til billedbehandling. Kurve passer til de normaliserede og korrigerede roi-data ved at kopiere postbleach normaliserede korrigerede værdier for genforbehold og de tilsvarende tidsværdier. Indsæt dem i vinduet Kurvemontør, vælg eksponentiel gendannelse i rullemenuen Kurvemontør, og vælg Tilpas.Vist her er en typisk video af fluorescens opsving efter photobleaching for RAW264.7 celler behandlet med LPS. Fluorescens opsving inden for aggresome-lignende induceret struktur region af interesse, er langsom. Dette eksperiment bruger photobleaching til at undersøge graden af mobilitet p62.p62 fluorescens i den aggresome-lignende inducerede strukturer, prebleach og postbleach, er vist her. Som beskrevet i denne video kan fluorescensintensiteten spores over tid. Efter baggrundskorrektion og normalisering kan p62-fluorescens beregnes til at beskrive den mobile fraktion som 22% den immobile fraktion som 78% og beskriver pausen af opsving inden for aggresome-lignende inducerede strukturer, som 2,14 minutter.Husk, at det er særlig vigtigt at definere erhvervelsesregionen af interesse korrekt, så den omfatter en ALIS af interesse, en kontrolregion af interesse og en baggrundsregion af interesse. Efter denne procedure kan der anvendes andre kvantitative fluorescerende mikroskopiteknikker, såsom fluorescenstab ved fotobleaching, FLIP og selektiv fotobleaching. Mens FLIP måler graden af kontinuitet og kommunikation mellem delcellulære rum, giver selektiv fotobleaching kinetisk information om aktiv og passiv transport af proteiner til organeller eller mellem proteinrige områder.FRAP blev oprindeligt udviklet for at kvantificere den laterale bevægelse af proteiner i cellemembraner. Efterfølgende er det blevet brugt til at kvantificere protein mobilitet inden for og mellem en række subcellulære rum, som banede vejen for forskere til at besvare spørgsmål inden for en række områder, herunder celle-og molekylærbiologi, udviklingsbiologi, neurovidenskab, materialevidenskab, avancerede biomaterialer, og lægemiddelopdagelse.

Research

JoVE Journal

Biology

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Fluorescent Labeling of Drosophila Heart Structures

Fluorescent Labeling of Drosophila Heart Structures

The Drosophila melanogaster dorsal vessel, or heart, is a tubular structure comprised of a single layer of contractile cardiomyocytes, pericardial cells ...

Measuring Diffusion Coefficients via Two-photon Fluorescence Recovery After Photobleaching

Multi-fluorescence recovery after photobleaching is a microscopy technique used to measure the diffusion coefficient (or analogous transport parameters) ...

Using the GELFREE 8100 Fractionation System for Molecular Weight-Based Fractionation with Liquid Phase Recovery

The GELFREE 8100 Fractionation System is a novel protein fractionation system designed to maximize protein recovery during molecular weight based ...

Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and ...

Photobleaching Assays (FRAP &amp; FLIP) to Measure Chromatin Protein Dynamics in Living Embryonic Stem Cells

Photobleaching Assays FRAP & FLIP to Measure Chromatin Protein Dynamics in Living Embryonic Stem Cells

Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) and Fluorescence Loss In Photobleaching (FLIP) enable the study of protein dynamics in living cells with ...

Determination of Lipid Raft Partitioning of Fluorescently-tagged Probes in Living Cells by Fluorescence Correlation Spectroscopy (FCS)

Determination of Lipid Raft Partitioning of Fluorescently-tagged Probes in Living Cells by Fluorescence Correlation Spectroscopy FCS

Bestemmelse af lipidklump opdeling af fluorescens-mærkede prober i levende celler ved fluorescenskorrelationsspektroskopi (FCS)

In the past fifteen years the notion that cell membranes are not homogenous and rely on microdomains to exert their functions has become widely accepted. ...

Intravital Microscopy for Imaging Subcellular Structures in Live Mice Expressing Fluorescent Proteins

Intravital mikroskopi af Imaging Subcellulære Strukturer Live mus, der udtrykker fluorescerende proteiner

Here we describe a procedure to image subcellular structures in live rodents that is based on the use of confocal intravital microscopy. As a model organ, ...

Simultaneous Multicolor Imaging of Biological Structures with Fluorescence Photoactivation Localization Microscopy

Samtidig Multicolor Imaging af biologiske strukturer med Fluorescence Fotoaktivering Lokalisering Microscopy

Localization-based super resolution microscopy can be applied to obtain a spatial map (image) of the distribution of individual fluorescently labeled ...

Protein-protein Interactions Visualized by Bimolecular Fluorescence Complementation in Tobacco Protoplasts and Leaves

Protein-protein interaktioner visualiseret ved bimolekylær Fluorescens komplementering i tobaksprotoplaster og blade

Many proteins interact transiently with other proteins or are integrated into multi-protein complexes to perform their biological function. Bimolecular ...