Name: fluorescence recovery after photobleaching of yellow fluorescent protein tagged p62 in aggresome-like induced structures
Uploaded: 2019-03-26T14:00:00
Duration: 12 min 58 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Fluorescence Recovery after Photobleaching of Yellow Fluorescent Protein Tagged p62 in Aggresome-like Induced Structures at JoVE.com

We bedanken voor zijn waardevolle opmerkingen over dit manuscript Dr. Seth Robia Loyola Universiteit van Chicago. Dit werk werd gesteund door de NIH grant 1R01NS073967-01A1 naar Joanna C. Bakowska.

<ol>
	<li>Axelrod, D., Koppel, D. E., Schlessinger, J., Elson, E., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mobility+measurement+by+analysis+of+fluorescence+photobleaching+recovery+kinetics.">Mobility measurement by analysis of fluorescence photobleaching recovery kinetics.</a> Biophysical Journal. 16 (9), 1055-1069 (1976).</li><li>Peters, R., Peters, J., Tews, K. H., Bahr, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microfluorimetric+study+of+translational+diffusion+in+erythrocyte+membranes.">A microfluorimetric study of translational diffusion in erythrocyte membranes.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 367 (3), 282-294 (1974).</li><li>Patterson, G., Day, R. N., Piston, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+protein+spectra.">Fluorescent protein spectra.</a> Journal of Cell Science. 114, 837-838 (2001).</li><li>Rabut, G., Ellenberg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photobleaching+techniques+to+study+mobility+and+molecular+dynamics+of+proteins+in+live+cells:+FRAP,+iFRAP,+and+FLIP.">Photobleaching techniques to study mobility and molecular dynamics of proteins in live cells: FRAP, iFRAP, and FLIP.</a> Live Cell Imaging: A Laboratory Manual (1st ed). , 101-126 (2004).</li><li>Fritzsche, M., Charras, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+protein+reaction+dynamics+in+living+cells+by+fluorescence+recovery+after+photobleaching.">Dissecting protein reaction dynamics in living cells by fluorescence recovery after photobleaching.</a> Nature Protocols. 10 (5), 660-680 (2015).</li><li>Goodwin, J. S., Kentworthy, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photobleaching+approaches+to+investigate+diffusional+mobility+and+trafficking+of+Ras+in+living+cells.">Photobleaching approaches to investigate diffusional mobility and trafficking of Ras in living cells.</a> Methods. 37 (2), 154-164 (2005).</li><li>Hildick, K. L., Gonz&#224;lez-Gonz&#224;lez, I. M., Jaskolski, F., Henley, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lateral+diffusion+and+exocytosis+of+membrane+proteins+in+cultured+neurons+assessed+using+fluorescence+recovery+and+fluorescence-loss+photobleaching.">Lateral diffusion and exocytosis of membrane proteins in cultured neurons assessed using fluorescence recovery and fluorescence-loss photobleaching.</a> Journal of Visualized Experiments. (60), e3747 (2012).</li><li>Nissim-Rafinia, M., Meshorer, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photobleaching+assays+(FRAP+&amp;+FLIP)+to+measure+chromatin+protein+dynamics+in+living+embryonic+stem+cells.">Photobleaching assays (FRAP &amp; FLIP) to measure chromatin protein dynamics in living embryonic stem cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (52), e2696 (2011).</li><li>Zheng, C., Petralia, R. S., Wang, Y., Kachar, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+recovery+after+photobleaching+(FRAP)+of+fluorescence+tagged+proteins+in+dendritic+spines+of+cultured+hippocampal+neurons.">Fluorescence recovery after photobleaching (FRAP) of fluorescence tagged proteins in dendritic spines of cultured hippocampal neurons.</a> Journal of Visualized Experiments. (50), e2568 (2011).</li><li>Thevenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+pyramid+approach+to+subpixel+registration+based+on+intensity.">A pyramid approach to subpixel registration based on intensity.</a> IEEE Transactions on Image Processing. 7 (1), 27-41 (1998).</li><li>Ishikawa-Ankerhold, H. C., Ankerhold, R., Drummen, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+fluorescence+microscopy+techniques--FRAP,+FLIP,+FLAP,+FRET+and+FLIM.">Advanced fluorescence microscopy techniques--FRAP, FLIP, FLAP, FRET and FLIM.</a> Molecules. 17 (4), 4047-4132 (2012).</li><li>Cabe, M., Rademacher, D. J., Karlsson, A. B., Cherukuri, S., Bakowska, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PB1+and+UBA+domains+of+p62+are+essential+for+aggresome-like+induced+structure+formation.">PB1 and UBA domains of p62 are essential for aggresome-like induced structure formation.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 503 (4), 2306-2311 (2018).</li><li>Brown, E. B., Wu, E. S., Zipfel, W., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+molecular+diffusion+in+solution+by+multiphoton+fluorescence+photobleaching+recovery.">Measurement of molecular diffusion in solution by multiphoton fluorescence photobleaching recovery.</a> Biophysical Journal. 77 (5), 2837-2849 (1999).</li><li>Centonze, V., Pawley, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tutorial+on+practical+confocal+microscopy+and+the+use+of+the+confocal+test+specimen.">Tutorial on practical confocal microscopy and the use of the confocal test specimen.</a> Handbook of biological confocal microscopy. , 549-570 (1995).</li><li>Chudakov, D. M., Matz, M. V., Lukyanov, S., Lukyanov, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+proteins+and+their+applications+in+imaging+living+cells+and+tissues.">Fluorescent proteins and their applications in imaging living cells and tissues.</a> Physiological Reviews. 90 (3), 1103-1163 (2010).</li></ol>

De auteurs hebben geen conflict van belang om te vermelden.

Wij bieden een complete, praktische en eenvoudige stapsgewijze protocol voor FRAP experimenten met levende cellen. Hierin, het protocol is gebruikt voor het meten van de mobiliteit van YFP-p62 in ALIS in macrofagen van de RAW264.7, maar het kan worden toegepast op veel van de laser confocal microscoop systemen scannen en genetisch gecodeerd fluorescente proteïnen die nu beschikbaar zijn. Voor elk systeem van microscopie zijn proefprojecten kritisch voor de bepaling van de optimale FRAP-parameters, met inbegrip van acquisitie, bleekmiddel, en controle ROI maten, laser intensiteit voor photobleaching en prebleach en postbleach Beeldacquisitie. Het is redelijk te verwachten dat de optimale FRAP-parameters kunnen verschillen voor elke genetisch gecodeerde fluorescent proteïne en cel regel.
Belangrijke factoren om te overwegen wanneer het uitvoeren van een experiment FRAP nemen (a) bereiken geschikt bleken diepte, (b) het gebruik van een korte bleken stap, (c) waardoor voldoende tijd postbleach te observeren de volledig herstel functie, (d) photobleaching efficiëntie, (e). cytotoxiciteit met herhaalde FRAP, en (f) de opneming van een besturingselement voor fluorescentie verlies als gevolg van herhaalde imaging. Het is raadzaam dat bleekmiddel diepte, die kan worden berekend op basis van de in punt 3.3.1 bedoelde vergelijking, ≥9013 worden. Wanneer bleekmiddel diepte is < 90, de mate van postbleach fluorescentie herstel zal worden onderschat, en de waarden van If, Mfen t-1/2 onjuist zal zijn. Hoewel de duur en de intensiteit van de laserpulsen bleekmiddel-inducerende tussen FRAP experimenten variëren kunnen, is het belangrijk dat de photobleaching stap kort en aanzienlijk sneller dan de fluorescentie recovery functie worden. Als het niet is, dan is een aanzienlijke hoeveelheid fluorescentie herstel kan optreden tijdens de bleken stap. Met een tijd van lange bleekmiddel, fluorescentie herstel tijdens de bleken stap niet zou worden gemeten, en het zou leiden tot onjuiste metingen van If, Mf, ent1/2. Bovendien, juist om waarden te verkrijgen voor If, Mf, ent1/2, de verwerving ROI nageleefd moet worden postbleach totdat het niveau van de fluorescentie in het bleekmiddel ROI heeft een plateau bereikt. Bijvoorbeeld, in onze FRAP-experimenten, er geen verschil was tussen de If, Mfen t-1/2 waarden wanneer we fluorescentie van de YFP-p62 in het bleekmiddel ROI voor 32.2 min postbleach waargenomen versus wanneer we YFP-p62 in het bleekmiddel ROI waargenomen voor 15.1 min postbleach; Dus wij geconcludeerd dat de recovery functie een plateau op 15.1 min postbleach12 bereikt. Met betrekking tot photobleaching efficiëntie toeneemt photobleaching met het kwadraat van de optische zoom factor14. Dus het gebruik van hoge optische zoomlenzen is gunstig voor de snelle photobleaching maar kan resulteren in ongewenste photobleaching tijdens overname; de laatste kan worden verklaard door een besturingselement ROI imaging. Herhaalde photobleaching dient te worden vermeden als het tot de generatie van cytotoxische reactieve zuurstof soorten (ROS leiden kan). Echter, de mate van ROS generatie als gevolg van blootstelling aan een hoge intensiteit laser is lager voor genetisch gecodeerde fluorescente proteïnen dan voor chemische fluorophores (bijvoorbeeld fluorescerende antilichamen)15, en het ROS gegenereerd zijn meer kans om te reageren binnen het genetisch gecodeerde fluorescerende eiwit dan met andere moleculen in de cel4. Naast de grotere waarschijnlijkheid van het genereren van cytotoxische ROS, dient herhaalde photobleaching te worden vermeden, want het is moeilijk te controleren. Tot slot, hoewel lage laser transmissie is bedoeld voor het verwerven van alle niet-bleekmiddel afbeeldingen, sommige photobleaching steevast plaatsvindt, die moet worden gecontroleerd. Mogelijke controles voor dit omvatten monitoring fluorescentie in een besturingselement ROI binnen de overname ROI, verkrijgen van controle beelden in een naburige ongebleekte cel en het uitvoeren van controle experimenten met de identieke instellingen voor die worden gebruikt de photobleaching experimenten, maar zonder de photobleaching gebeurtenis.

Fluorescentie herstel na photobleaching (FRAP) een microscopie techniek die kan worden gebruikt is voor het kwantificeren van de dynamiek van de eiwitten in levende cellen1,2. De populariteit van FRAP gestegen vanwege het wijdverspreide commerciële beschikbaarheid van laser scannen confocal microscopen met hoge resolutie, snelheid en gevoeligheid, en een "regenboog" van genetisch gecodeerd fluorescerende eiwitten, zoals groen fluorescerend proteïne (GFP) en gele fluorescerende eiwit (YFP)3. Genetisch gecodeerde fluorescente proteïnen worden gesmolten tot een proteïne van belang te voorzien in de subcellular localisatie van het eiwit van belang. In een typische FRAP-experiment, wordt de steady-state-fluorescentie in een regio van de acquisitie van belang (ROI) binnen een cel waargenomen via herhaalde beeldvorming van dat ROI met lage intensiteit laserlicht. Vervolgens zijn de fluorescerende moleculen snel en onherroepelijk aangetast in een vooraf gedefinieerde subset van de overname ROI, hierna te noemen het bleekmiddel ROI, door korte blootstelling aan hoge-intensiteit laserlicht. Als nieuwe ongebleekte eiwitten vullen gebleekte eiwitten na verloop van tijd, bevat de snelheid en de intensiteit van de fluorescentie herstel in het bleekmiddel ROI informatie over eiwit mobiliteit (Figuur 1)4.
Ons belang bij het bepalen van de mobiliteit van de ubiquitin bindende eiwitten p62 (ook bekend als sequestosome-1) in aggresome-achtige geïnduceerde structuren (ALIS) in lymfkliertest RAW264.7 macrofagen na stimulatie met lipopolysaccharide (LPS) ons leidde te herzien de FRAP literatuur. Helaas, veel van de bestaande FRAP-protocollen zijn onvolledig of buitensporig complex5,6,,7,,8,9. Sommige bieden geen gedetailleerde informatie over de instellingen van de laser, lichtbundel pad configuratie en afbeelding overname parameters5,6,7,8,9. Andere belangrijke details met betrekking tot de analyse van de gegevens, zoals hoe de kwestie van bleekmiddel ROI drift6,9 of hoe Bereken belangrijk herstel parameters, met inbegrip van de mobiele breuk (Mf), onbeweeglijke gedeelte weggelaten (Ikf), en de helft van de tijd van herstel (t½)5,7. Omgekeerd, anderen teveel nadruk gelegd op complexe wiskundige formules voor de berekening van Mf, ikfen t1/25,6,8,9. Ons doel is dus om een complete, praktische en eenvoudige stapsgewijze protocol voor FRAP experimenten met levende cellen.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:835px;" width="835">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium</td>
			<td style="width:211px;">Hyclone</td>
			<td style="width:137px;">SH30022.01</td>
			<td style="width:167px;">High Glucose (4.5 g/L)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Fetal bovine serum</td>
			<td style="width:211px;">Gemini Bio-Products</td>
			<td style="width:137px;">100-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Glass bottom dishes</td>
			<td style="width:211px;">MatTek</td>
			<td style="width:137px;">P35G-1.5-14-C</td>
			<td>35-mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Image J software</td>
			<td style="width:211px;">National Institutes of Health</td>
			<td style="width:137px;">N.A.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Lipopolysaccharide (LPS)</td>
			<td style="width:211px;">Sigma</td>
			<td style="width:137px;">L4391</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Nocodazole</td>
			<td style="width:211px;">Sigma</td>
			<td style="width:137px;">M1404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Penicillin-streptomycin solution</td>
			<td style="width:211px;">Corning</td>
			<td style="width:137px;">30-002-Cl</td>
			<td>100&#215;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Plan-Apochromat 63&#215;/1.40 oil objective</td>
			<td style="width:211px;">Carl Zeiss MicroImaging, Inc</td>
			<td style="width:137px;">4407629904000000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Polyethylenimine (PEI)</td>
			<td style="width:211px;">Polysciences</td>
			<td style="width:137px;">23966-1</td>
			<td>linear (MW 25,000)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">RAW 264.7 murine macrophages</td>
			<td style="width:211px;">ATCC</td>
			<td style="width:137px;">TIB-71</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Zeiss confocal microscope</td>
			<td style="width:211px;">Carl Zeiss MicroImaging, Inc</td>
			<td style="width:137px;">LSM 510</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fluorescence recovery after photobleaching of yellow fluorescent protein tagged p62 in aggresome-like induced structures

Fluorescentie herstel na photobleaching (FRAP) is een microscopie techniek die kan worden gebruikt voor het kwantificeren van eiwit mobiliteit in levende cellen. In een typische FRAP-experiment, is door herhaalde beeldbewerking met laserlicht van lage-intensiteit steady-state fluorescentie waargenomen. Vervolgens zijn de fluorescerende moleculen snel en onherroepelijk aangetast via korte blootstelling aan hoge-intensiteit laserlicht. Informatie over eiwit mobiliteit wordt verkregen door het toezicht op het herstel van de fluorescentie. We FRAP gebruikt om te bepalen van de mobiliteit van p62 in aggresome-achtige geïnduceerde structuren (ALIS) in lymfkliertest macrofagen na stimulatie met lipopolysaccharide (LPS). Omdat vele bestaande FRAP protocollen onvolledig of complexe zijn, was ons doel om een complete, praktische en eenvoudige stapsgewijze protocol voor FRAP experimenten met levende cellen. Hier beschrijven we RAW264.7 macrofaag transfectie met gele fluorescerende eiwit-p62 (YFP-p62), inductie van ALIS door de cellen aan LPS en een stapsgewijze methode voor het verzamelen van prebleach en postbleach FRAP beelden en gegevens analyse bloot te leggen. Tot slot bespreken we belangrijke factoren te overwegen bij het uitvoeren van een FRAP-experiment.

Hieronder zijn de resultaten van een typisch experiment waarin we FRAP te onderzoeken van de mate van mobiliteit van p62 in ALIS in cellen van de RAW264.7 behandeld met LPS voor 3-5 h12gebruikt. Figuur 3 A toont de onbewerkte gegevens verkregen uit een bleekmiddel, controle, en ROI achtergrond nadat de stack van beelden had aangepast om te corrigeren voor kleine hoeveelheden (< ~ 3 µm) voor afbeelding drift van het ALIS. YFP-p62 fluorescentie in deze ALIS op prebleach en postbleach wordt weergegeven in Figuur 3E en aanvullende Video 1. Figuur 3 B toont deze gegevens na achtergrondcorrectie. Figuur 3 C toont deze gegevens na correctie voor fluorescentie in het besturingselement ROI. Figuur 3 D toont deze gegevens genormaliseerd naar de gemiddelde fluorescentie van de 5 prebleach waarden in het bleekmiddel ROI. De mate van bleken volstond in dit experiment (bleekmiddel diepte = 91.94). YFP-p62 fluorescentie binnen deze ALIS hersteld langzaam, als t-1/2 = 128.27 s (2.14 min). YFP-p62 was niet een zeer mobiele eiwit in dit experiment, Mf = 21.97 en ikf = 78.03.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59288/59288fig1.jpg"> Figuur 1 : Een diagram van een RAW264.7 cel en stappen voor beeldanalyse nadat de FRAP beelden zijn aangepast om te corrigeren voor afbeelding drift van het ALIS. (A) schema van een cel van de RAW264.7 beeltenis van verschillende ALIS bleekmiddel, controle en de achtergrond ROIs binnen de overname ROI. (B) een geïdealiseerde voorstelling van ruwe FRAP gegevens verkregen in het bleekmiddel, controle en achtergrond ROIs in deelvenster A. (C) een geïdealiseerde grafiek van de ruwe FRAP-gegevens die achtergrond-gecorrigeerd zijn. (D) een geïdealiseerde grafiek van achtergrond-gecorrigeerde FRAP gegevens die hebben is genormaliseerd naar fluorescentie in het besturingselement ROI. (E) een geïdealiseerde grafiek van genormaliseerde en achtergrond-gecorrigeerde FRAP-gegevens die op de prebleach fluorescentie in het bleekmiddel ROI hebben zijn genormaliseerd. Afkortingen: Con = controle; BG = achtergrond. Dit cijfer werd vanaf Rabut en Ellenberg4gewijzigd. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59288/59288fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59288/59288fig2.jpg"> Figuur 2: Afbeeldingen van de gebruikersinterface in de AIM-software (tabel of Materials) voor selectie van de laser, dimlicht pad configuratie, en beeld overname parameters voor de experimenten FRAP. (A) Laser controle scherm tonen het Argon/2 laserlijnen, uitvoer en gebruikte buis stroom. (B) configuratie controle scherm tonen de balk splitter en emissie filterinstellingen gebruikt. (C) Scan controle scherm toont de instelling voor image aquisition gebruikt. (D) Scan controle scherm tonen de pinhole detector winst, de verschuiving van de versterker, versterker gain en transmissie instellingen voor het Argon/2 514 nm laser lijn. (E) tijdreeksen controle scherm tonen de tijdsinstellingen voor de reeks gebruikt. (F) bleekmiddel zeggenschap zeef tonen van de prebleach en postbleach parameters gebruikt. Afkortingen: HFT = Haupt Farb teilig (primaire dichroïde balk splitter); NT1 = Neben Farb teilig 1 (eerste middelbare dichroïde beam splitter); NT2 = Neben Farb teilig 2 (tweede secundaire dichroïde balk splitter); EF = emissie filter. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59288/59288fig2large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59288/59288fig3.jpg"> Figuur 3 : Een representatieve FRAP experiment om te studeren van YFP-p62 dynamiek in ALIS in RAW264.7 cellen. (A) de gegevens van de intensiteit van het ruwe fluorescentie voor een bleekmiddel, controle en achtergrond ROI. (B) de gegevens vermeld in deelvenster A nadat het bleekmiddel en controle ROI had gecorrigeerd voor fluorescentie op de achtergrond ROI. (C) de gegevens vermeld in panelen A en B na het normaliseren van de intensiteit van de fluorescentie in het bleekmiddel ROI op account voor fluorescentie in de achtergrond-gecorrigeerde besturingselement ROI. (D) de gegevens vermeld in panelen A-C na het normaliseren van de intensiteit van de fluorescentie in het genormaliseerde en achtergrond-gecorrigeerde bleekmiddel ROI berekend als het gemiddelde van de eerste 5 prebleach waarden in het bleekmiddel ROI. Mf = 21.97, ikf = 78.03, t-1/2 = 128.27 s (2.14 min), en bleekmiddel diepte = 91.94. (E) een beeld van een ALIS op prebleach (1.5 min) en postbleach (0, 6 en 16 min). Schaal bar = 5 µm en is geldig voor alle panelen. Afkortingen: Con = controle; BG = achtergrond; Corr. = gecorrigeerd; Norm. = genormaliseerd; Gemiddelde = gemiddelde. Dit cijfer is bewerkt van Cabe et al.12<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59288/59288fig3large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Supplementary Video 1" src="/files/ftp_upload/59288/59288supvideo1.jpg"> Aanvullende Video 1: een typische ALIS in een RAW264.7 macrofaag vóór en na photobleaching. YFP-p62 fluorescentie is traag om te herstellen na de photobleach; Vandaar, p62 is niet een zeer mobiele eiwit. Voor dit experiment, Mf = 25,62, ikf = 74.38, t-1/2 = 442.79 s (7.38 min), en bleekmiddel diepte = 90.19. Schaal bar = 5 µm. Deze video is bewerkt van Cabe et al.12<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59288/Fig_4-Vid_FINAL.avi" target="_blank">gelieve Klik hier om deze video te bekijken. (Klik met de rechtermuisknop om te downloaden.)</a>

Watch this Scientific Journal Video about Fluorescence Recovery after Photobleaching of Yellow Fluorescent Protein Tagged p62 in Aggresome-like Induced Structures at JoVE.com

Fluorescence Recovery after Photobleaching of Yellow Fluorescent Protein Tagged p62 in Aggresome-like Induced Structures

Fluorescentie herstel na Photobleaching van gele fluorescerende eiwit Tagged p62 in Aggresome-achtige geïnduceerde structuren

We beschrijven een uitgebreide en praktische protocol voor fluorescentie herstel na photobleaching experimenten met cellen levende. Hoewel het protocol werd gebruikt voor het meten van de mobiliteit van gele fluorescerende eiwit-gelabeld p62 in aggresome-achtige geïnduceerde structuren, kan het worden toegepast op een verscheidenheid van microscopie systemen en fluorescente proteïnen.

Fluorescence recovery after photobleaching (FRAP)&#160;is a microscopy technique that can be used to quantify protein mobility in live cells. In a typical ...

Bestaand fluorescentieherstel na fotobleaching, FRAP-protocollen, zijn onvolledig of te complex. Het protocol gepresenteerd in deze video is belangrijk in die zin dat het is uitgebreid, praktisch en eenvoudig. Het belangrijkste voordeel van deze FRAP-techniek is dat het mogelijk maakt voor de kwantificering van eiwitmobiliteit binnen en tussen subcellulaire compartimenten in levende cellen.FRAP wordt bestudeerd voor zowel therapeutische als diagnostische doeleinden. Een dergelijk gebruik is het kwantificeren van diffusie binnen systemen voor de levering van geneesmiddelen in verschillende weefsels in vivo. Deze informatie kan door gebruikt worden om een drugstructuur en samenstelling te optimaliseren.De FRAP-microscopietechniek heeft inzichten opgeleverd op een breed scala aan gebieden waarop inzicht in het verspreidingsfenomeen van belang is. Deze omvatten cel- en moleculaire biologie, ontwikkelingsbiologie, neurowetenschappen, materiaalkunde, geavanceerde biomaterialen en drugsontdekking. Hoewel het beschreven protocol voor gebruik met zoogdiercellen is, kunnen de concepten worden toegepast op andere systemen, zoals plantencellen, gistcellen en bacteriën.Een persoon die nog nooit heeft uitgevoerd deze techniek kan worstelen bij het bepalen van de optimale beeldverwerving parameters, het creëren van een acquisitie regio van belang dat geschikt is voor hun experiment, en het berekenen van de mobiele fractie en de halftime van het herstel. Wanneer u deze procedure voor de eerste keer probeert, moet u verschillende proefexperimenten uitvoeren om het protocol te optimaliseren in de context van de doelstellingen van uw experiment. Het aantonen van de procedure zal Maleen Cabe, een technicus van mijn lab, en David Rademacher, de kern imaging facility manager.Om te beginnen, maak een plaat van YFP-p62 transfected RAW264.7 macrofagen, en behandel ze met Lipopolysaccharide zoals beschreven in de bijbehorende tekst protocol. Spoel vervolgens de behandelde cellen een keer af met de buffer van ijskoude Tyrode. Voeg vervolgens twee milliliter nocodazole-aangevuld tyrode's buffer aan de plaat, en laat de platen in te broeden op vier graden Celsius gedurende 15 tot 20 minuten voorafgaand aan FRAP beeldvorming en analyse.Laat de platen 15 tot 20 minuten voor frap-beeldvorming en analyse bij vier graden Celsius uitbroeden. Bij de beeldvormingsopstelling selecteert u de 514 nanometer-lijn van de Argon/2-laser, omdat de fluorescentiemarkering een piekexcitatie heeft op 512 nanometer en een piekemissie op 527 nanometer. Klik vervolgens in het venster Laserbesturing op Argon/2, 458, 477, 488, 514 en klik vervolgens op de stand-byknop.Na ongeveer drie minuten wachten op de laser op te warmen, klikt u op de knop Aan. Stel vervolgens de laserkracht van de laser in op 100% en druk op Enter. Stel vervolgens de overdracht van de laserlijn op 5%Op de microscoop, draai je naar de Plan-Apochromat 63x vergroting 1,40 numerieke diafragma olie doelstelling.Bekijk het exemplaar door de microscoop oculair en plaats een aggresome-achtige geïnduceerde structuur in het midden van het gezichtsveld. Stel vervolgens in de acquisitiesoftware de framegrootte in op 512 bij 512 pixels, de scansnelheid op acht en de gegevensdiepte op 12 Bit. Stel ook het scangemiddelde in op één, de optische zoom op drie en druk op Enter.Vervolgens, se het gaatje tot 1,95 fouteenheden en detector te krijgen tot 582, dat is net onder de verzadiging. Maak een vierkant gebied van belang voor de beeldverwerving, dat de afmetingen 150 bij 150 pixels heeft. Stel de tijdreeks zo in dat het interessegebied 35 keer wordt gescand, eens per 30 seconden.Stel vervolgens de bleekwatercontrole zodanig in dat het fotobleaching na scan nummer vijf zal plaatsvinden om vijf prebleach-afbeeldingen van het gebied van belang te verzamelen. Druk op enter om dit te bevestigen. Ga vervolgens naar het venster Bleekgebied en maak een cirkelvormig bleekmiddelgebied dat van belang is binnen het aggresome-achtige geïnduceerde structuurgebied, dat een diameter van 10 pixels heeft.Stel nu het aantal iteraties in op 300 en druk nogmaals op Enter. Stel vervolgens de laserlijn in op 100% vermogen en voer 100 in het veld transmissiepercentage voor de laser in en druk op Enter. Ten slotte voert u het programma voor het verkrijgen van afbeeldingen uit om FRAP-gegevens te verzamelen van 10 aggresome-achtige geïnduceerde structuren in 10 cellen met minder dan ongeveer drie micron drift.Om met data-analyse te beginnen, worden de AIM-lsm-bestanden eerst overgezet naar een personal computer voor gegevensanalyse. Correct voor beelddrift door het uitlijnen of afstemmen van de stapel tijdreeksafbeeldingen van het acquisitiegebied van belang door elk AIM-lsm-bestand te openen met een beeldverwerkingsprogramma. Selecteer vervolgens Plug-ins, Registratie, StackReg en Vertaling, gevolgd door het selecteren van Plug-ins, Registratie, StackReg en vervolgens Rigid Body.Stel vervolgens de region of interest manager in om de signaalintensiteit in het bleekmiddelgebied van belang te meten. Selecteer hiervoor het ovale gereedschap, teken vervolgens een cirkel in het bleekmiddelgebied met een diameter van 10 pixels en klik op de knop Toevoegen. Eenmaal toegevoegd, het opzetten van het programma om signaalintensiteit te meten in het controlegebied van belang.Selecteer het rechthoeksgereedschap, teken vervolgens een vierkant van 20 bij 20 pixels in het besturingselementgebied en klik op de knop Toevoegen. Tot slot, het opzetten van de regio van belang manager om signaal intensiteit te meten in de achtergrond regio van belang. Selecteer het rechthoeksgereedschap, teken een vierkant van 20 bij 20 pixels in het achtergrondgebied en klik op de knop Toevoegen.Nadat u de regio's hebt toegevoegd die moeten worden geanalyseerd in ROI Manager, wijzigt u deze bij de naam Bleach ROI, Control ROI en Background ROI. Meet de signaalintensiteit in elke regio. Selecteer hiervoor De ROI van Bleach, de ROI en de ROI op de achtergrond controleren en vervolgens naar Meer gaan en selecteert u Multi Measure.Plak de resultaten op een spreadsheet in kolommen met respectievelijk het label Bleach ROI, Control ROI en Background ROI. Begin met achtergrond het corrigeren van de signaalintensiteit in de ROI van het bleken bleekmiddel en de ROI voor controle door de waarden in de kolom met het label Achtergrond-ROI af te trekken van de waarden in de kolom met het label Bleek ROI en de kolom met het label Control ROI. Label deze nieuwe kolommen Gecorrigeerdbleek ROI en Gecorrigeerde Control ROI.Normaliseer vervolgens het signaal in de Roi van het bleekmiddel naar het achtergrondgecorrigeerde signaal in de control-ROI. Deel de waarden in de kolom met het label Gecorrigeerde rendement van het bleken door de waarden in de kolom met het label Gecorrigeerde controle-ROI. Label deze nieuwe kolom, Normalized Corrected Bleach ROI.Normaliseer vervolgens het signaal in de kolom Genormaliseerd gecorrigeerde rendementsfaal ROI naar het gemiddelde van de vijf prebleachwaarden in de ROI van het bleekmiddel. Verdeel de waarden in de kolom met het label Genormaliseerd Gecorrigeerde Rendementsvoorwaarde door het gemiddelde van de vijf prebleachwaarden in de ROI van het bleken. Label deze nieuwe kolom, Normalized Corrected Prebleach Average Bleach ROI.Open ten slotte een programma voor beeldverwerking. Curve passen bij de genormaliseerde en gecorrigeerde rendementsgegevens van het bleekmiddel door de genormaliseerde gecorrigeerde rendementswaarden van het bleekmiddel en de bijbehorende tijdwaarden te kopiëren. Plak ze in het venster Curve Fitter, selecteer exponentieel herstel in het vervolgkeuzemenu Curve Fitter en selecteer Fit.Hier wordt een typische video van fluorescentieherstel getoond na het fotobleaching voor RAW264.7-cellen die met LPS zijn behandeld. Het fluorescentieherstel binnen het aggresome-achtige geïnduceerde structuurgebied van belang, is traag. Dit experiment maakt gebruik van fotobleaching om de mate van mobiliteit van p62 te onderzoeken.p62 fluorescentie in de aggresome-achtige geïnduceerde structuren, prebleach en postbleach, wordt hier getoond. Zoals beschreven in deze video, kan de fluorescentie intensiteit worden gevolgd in de tijd. Na achtergrondcorrectie en normalisatie kan de p62-fluorescentie worden berekend om de mobiele fractie te beschrijven als 22% van de onbeweeglijke fractie als 78%en beschrijft de rust van herstel binnen de aggresome-achtige geïnduceerde structuren, als 2,14 minuten.Vergeet niet, het is vooral belangrijk om goed te definiëren de overname regio van belang, zodat het een ALIS van belang, een controle regio van belang, en een achtergrond regio van belang omvat. Na deze procedure kunnen andere kwantitatieve fluorescerende microscopietechnieken worden toegepast, zoals fluorescentieverlies bij fotobleaching, FLIP en selectief fotobleaching. Terwijl FLIP de mate van continuïteit en communicatie tussen subcellulaire compartimenten meet, biedt selectieve fotobleaching kinetische informatie over actief en passief transport van eiwitten naar organellen of tussen eiwitrijke gebieden.FRAP werd aanvankelijk ontwikkeld om de laterale beweging van eiwitten in celmembranen te kwantificeren. Vervolgens is het gebruikt om eiwitmobiliteit te kwantificeren binnen en tussen een verscheidenheid aan subcellulaire compartimenten, die de weg vrijmaakten voor onderzoekers om vragen te beantwoorden op verschillende gebieden, waaronder cel- en moleculaire biologie, ontwikkelingsbiologie, neurowetenschappen, materiaalkunde, geavanceerde biomaterialen en medicijnontdekking.

Research

JoVE Journal

Biology

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

Kleuring van eiwitten in Gels met Coomassie G-250 zonder organisch oplosmiddel en azijnzuur

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Fluorescent Labeling of Drosophila Heart Structures

Fluorescent Labeling of Drosophila Heart Structures

TL-etikettering van Drosophila Hart Structuren

The Drosophila melanogaster dorsal vessel, or heart, is a tubular structure comprised of a single layer of contractile cardiomyocytes, pericardial cells ...

Measuring Diffusion Coefficients via Two-photon Fluorescence Recovery After Photobleaching

Het meten van diffusiecoëfficiënten via twee-foton Fluorescence Recovery After Photobleaching

Multi-fluorescence recovery after photobleaching is a microscopy technique used to measure the diffusion coefficient (or analogous transport parameters) ...

Using the GELFREE 8100 Fractionation System for Molecular Weight-Based Fractionation with Liquid Phase Recovery

Met behulp van de GELFREE 8100 Fractionering System for Molecular Weight-Based Fractionering met Liquid Phase Recovery

The GELFREE 8100 Fractionation System is a novel protein fractionation system designed to maximize protein recovery during molecular weight based ...

Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection

Time-lapse Imaging van mitose Na siRNA transfectie

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and ...

Photobleaching Assays (FRAP &amp; FLIP) to Measure Chromatin Protein Dynamics in Living Embryonic Stem Cells

Photobleaching Assays FRAP & FLIP to Measure Chromatin Protein Dynamics in Living Embryonic Stem Cells

Fotobleken Analyses (FRAP &amp; FLIP) om chromatine eiwit Dynamics Meet in Living Embryonale stamcellen

Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) and Fluorescence Loss In Photobleaching (FLIP) enable the study of protein dynamics in living cells with ...

Determination of Lipid Raft Partitioning of Fluorescently-tagged Probes in Living Cells by Fluorescence Correlation Spectroscopy (FCS)

Determination of Lipid Raft Partitioning of Fluorescently-tagged Probes in Living Cells by Fluorescence Correlation Spectroscopy FCS

Bepaling van de lipid raft van afscherming van fluorescent-gelabelde probes in levende cellen met behulp van fluorescentie Correlatie Spectroscopie (FCS)

In the past fifteen years the notion that cell membranes are not homogenous and rely on microdomains to exert their functions has become widely accepted. ...

Intravital Microscopy for Imaging Subcellular Structures in Live Mice Expressing Fluorescent Proteins

Intravitale Microscopy for Imaging Subcellulaire Structuren in Levende muizen die fluorescerende eiwitten

Here we describe a procedure to image subcellular structures in live rodents that is based on the use of confocal intravital microscopy. As a model organ, ...

Simultaneous Multicolor Imaging of Biological Structures with Fluorescence Photoactivation Localization Microscopy

Gelijktijdige Multicolor beeldvorming van biologische structuren met fluorescentie Fotoactivatie Lokalisatie Microscopie

Localization-based super resolution microscopy can be applied to obtain a spatial map (image) of the distribution of individual fluorescently labeled ...

Protein-protein Interactions Visualized by Bimolecular Fluorescence Complementation in Tobacco Protoplasts and Leaves

Eiwit-eiwit interacties gevisualiseerd door Bimoleculaire Fluorescentie Complementatie in Protoplasten en Bladeren Tabak

Many proteins interact transiently with other proteins or are integrated into multi-protein complexes to perform their biological function. Bimolecular ...