Name: fluorescence recovery after photobleaching of yellow fluorescent protein tagged p62 in aggresome-like induced structures
Uploaded: 2019-03-26T14:00:00
Duration: 12 min 58 s
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Nous remercions le Dr Seth Robia à Loyola University Chicago pour ses précieux commentaires sur ce manuscrit. Ce travail a été soutenu par les NIH grant 1R01NS073967-01 a 1 à Joanna C. Bakowska.

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Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêt à divulguer.

Nous fournissons un protocole étape par étape complète, pratique et simple pour des expériences de PAF avec des cellules vivantes. Dans les présentes, le protocole a été utilisé pour mesurer la mobilité des YFP-p62 dans ALIS RAW264.7 macrophages, mais elle peut être appliquée à de nombreux systèmes de microscope confocal à balayage laser et codé génétiquement des protéines fluorescentes qui sont maintenant disponibles. Pour n’importe quel système de microscopie, les expériences pilotes sont essentiels pour déterminer les paramètres optimaux de FRAP, incluant l’acquisition, eau de Javel et de tailles de contrôle ROI, intensité du laser pour le Photoblanchiment et acquisition d’images prebleach et postbleach. Il est raisonnable de s’attendre les paramètres optimaux de FRAP diffèrent pour chaque ligne de protéines et cellules fluorescente codé génétiquement.
Facteurs importants à considérer quand mène une expérience FRAP incluent (a) réalisation convenable de Javel profondeur, (b) l’utilisation d’une brève étape de blanchiment, (c) ce qui permet aux postbleach de temps suffisant pour observer la fonction de restauration complète, l’efficacité de Photoblanchiment (d), (e). cytotoxicité avec répétitions FRAP et (f) l’inclusion d’un contrôle pour la perte de fluorescence en raison de l’imagerie répété. Nous recommandons que la profondeur de l’eau de Javel, qui peut être calculé selon l’équation fournie dans la section 3.3.1, soit ≥ 9013. Quelle est la profondeur de l’eau de Javel < 90, le degré de fluorescence postbleach récupération sera sous-estimée et les valeurs d’IfMfet t1/2 sera incorrectes. Bien que la durée et l’intensité des impulsions laser induisant la javel peuvent varier entre les expériences du PAF, il est important que l’étape de Photoblanchiment être bref et sensiblement plus rapide que la fonction de récupération de fluorescence. Si ce n’est pas le cas, une quantité importante de récupération de la fluorescence peut se produire pendant l’étape de blanchiment. Avec un temps de l’eau de Javel long, récupération de fluorescence au cours de l’étape de blanchiment ne serait pas être mesurée, et cela donnerait lieu à des mesures erronées d’If, M,f, ett1/2. En outre, pour obtenir des valeurs correctes pour If, M,f, ett1/2, l’acquisition de retour sur investissement doit être observée postbleach jusqu'à ce que le degré de fluorescence dans l’eau de Javel ROI atteint un plateau. Par exemple, dans nos expériences FRAP, il n’y avait aucun différence entre l’If, M,fet t1/2 valeurs lorsque nous avons observé YFP-p62 fluorescence dans le ROI de l’eau de Javel pour 32,2 min postbleach contre quand nous avons observé YFP-p62 dans l’eau de Javel ROI pour 15,1 min postbleach ; ainsi, nous avons conclu que la fonction de récupération atteint un plateau à 15,1 min postbleach12. En ce qui concerne l’efficacité de Photoblanchiment, Photoblanchiment augmente avec le carré du facteur de zoom optique14. Ainsi, l’utilisation de zooms optiques hautes est favorable pour le Photoblanchiment rapid mais peut entraîner le Photoblanchiment indésirable lors de l’acquisition ; ce dernier peut s’expliquer par un contrôle ROI d’imagerie. Photoblanchiment répété doit être évitée car elle peut conduire à la génération de cytotoxiques reactive oxygen species (ROS). Toutefois, le degré de génération ROS dus à l’exposition d’un laser à haute intensité est plus faible pour des protéines fluorescentes génétiquement codés que pour fluorophores chimiques (p. ex. anticorps fluorescents)15et les ROS générées sont plus susceptibles de réagir au sein de la protéine fluorescente génétiquement encodée qu’avec d’autres molécules dans la cellule4. En plus de la probabilité accrue de générer ROS cytotoxique, répété Photoblanchiment est à éviter car il est difficile à contrôler. Enfin, bien que la transmission laser faible sert à acquérir toutes les images non-eau de Javel, certains Photoblanchiment invariablement se produira, qui doit être contrôlée. Contrôles possibles pour cela incluent la surveillance fluorescence dans un contrôle de retour sur investissement dans l’acquisition de ROI, obtenir des images de contrôle dans une cellule voisine écrue et effectuent des expériences de contrôle avec les paramètres identiques à ceux utilisés dans le expériences de Photoblanchiment mais sans l’événement Photoblanchiment.

Récupération de fluorescence après que Photoblanchiment (FRAP) est une technique de microscopie qui peut être utilisée pour quantifier la dynamique des protéines en direct des cellules1,2. La popularité du PAF a augmenté en raison de la disponibilité commerciale de microscopes confocaux à haute résolution, vitesse et sensibilité à balayage laser, et un « arc-en-ciel » de codé génétiquement des protéines fluorescentes, comme le vert fluorescent protéine (GFP) et protéine fluorescente jaune (YFP)3. Génétiquement codés protéines fluorescentes sont fondues à une protéine d’intérêt afin de permettre la localisation intracellulaire de la protéine d’intérêt. Dans une expérience typique du PAF, la fluorescence en état stationnaire dans une région d’acquisition d’intérêt (ROI) dans une cellule est observée par imagerie répété de ce ROI avec lumière laser de faible intensité. Par la suite, les molécules fluorescentes sont rapidement et irréversiblement altérées chez un sous-ensemble prédéfini de l’acquisition de retour sur investissement, ci-après dénommé l’eau de Javel ROI, par une brève exposition à la lumière de laser de haute intensité. Comme les nouvelles protéines écrus reconstituer les protéines blanchies au fil du temps, la vitesse et l’intensité de la reprise de fluorescence de l’eau de Javel ROI fournit des informations sur la protéine mobilité (Figure 1)4.
Notre intérêt dans la détermination de la mobilité de l’ubiquitine liaison protéine p62 (également connu sous le nom de sequestosome-1) en structures induites semblables à aggresome (ALIS) dans les macrophages murins RAW264.7 après que stimulation avec le lipopolysaccharide (LPS) nous a conduit à revoir du PAF littérature. Malheureusement, bon nombre des protocoles existants FRAP sont incomplètes ou excessivement complexe5,6,7,8,9. Certains ne fournissent pas d’informations détaillées sur les paramètres laser et configuration de chemins faisceau image acquisition paramètres5,6,7,8,9. D’autres omis des détails clés au sujet de l’analyse des données, telles que d’aborder la question de l’eau de Javel ROI dérive6,9 ou comment calculer les paramètres de récupération importante, y compris la fraction mobile (Mf), la fraction immobile (J’aif) et de temps de récupération (t½)5,7. À l’inverse, d’autres mettait trop l’accent sur des formules mathématiques complexes permettant de calculer Mf, j’aifet t1/25,6,8,9. Ainsi, notre but est de fournir un protocole étape par étape complète, pratique et simple pour des expériences de PAF avec des cellules vivantes.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:835px;" width="835">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium</td>
			<td style="width:211px;">Hyclone</td>
			<td style="width:137px;">SH30022.01</td>
			<td style="width:167px;">High Glucose (4.5 g/L)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Fetal bovine serum</td>
			<td style="width:211px;">Gemini Bio-Products</td>
			<td style="width:137px;">100-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Glass bottom dishes</td>
			<td style="width:211px;">MatTek</td>
			<td style="width:137px;">P35G-1.5-14-C</td>
			<td>35-mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Image J software</td>
			<td style="width:211px;">National Institutes of Health</td>
			<td style="width:137px;">N.A.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Lipopolysaccharide (LPS)</td>
			<td style="width:211px;">Sigma</td>
			<td style="width:137px;">L4391</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Nocodazole</td>
			<td style="width:211px;">Sigma</td>
			<td style="width:137px;">M1404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Penicillin-streptomycin solution</td>
			<td style="width:211px;">Corning</td>
			<td style="width:137px;">30-002-Cl</td>
			<td>100&#215;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Plan-Apochromat 63&#215;/1.40 oil objective</td>
			<td style="width:211px;">Carl Zeiss MicroImaging, Inc</td>
			<td style="width:137px;">4407629904000000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Polyethylenimine (PEI)</td>
			<td style="width:211px;">Polysciences</td>
			<td style="width:137px;">23966-1</td>
			<td>linear (MW 25,000)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">RAW 264.7 murine macrophages</td>
			<td style="width:211px;">ATCC</td>
			<td style="width:137px;">TIB-71</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Zeiss confocal microscope</td>
			<td style="width:211px;">Carl Zeiss MicroImaging, Inc</td>
			<td style="width:137px;">LSM 510</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fluorescence recovery after photobleaching of yellow fluorescent protein tagged p62 in aggresome-like induced structures

Récupération de fluorescence après Photoblanchiment (FRAP) est une technique de microscopie qui peut être utilisée pour quantifier la mobilité des protéines dans des cellules vivantes. Dans une expérience typique de FRAP, fluorescence en état stationnaire est observé par imagerie répété avec la lumière laser de faible intensité. Par la suite, les molécules fluorescentes sont rapidement et irréversiblement altérées par une brève exposition à la lumière de laser de haute intensité. Informations sur la mobilité des protéines sont obtenues en contrôlant la récupération de la fluorescence. FRAP nous permettant de déterminer la mobilité des p62 dans aggresome-comme des structures induites (ALIS) dans les macrophages murins après stimulation avec le lipopolysaccharide (LPS). Parce que de nombreux protocoles existants de FRAP sont incomplets ou complexes, notre objectif était de fournir un protocole étape par étape complète, pratique et simple pour des expériences de PAF avec des cellules vivantes. Nous décrivons ici la transfection de macrophage RAW264.7 avec la protéine fluorescente jaune-p62 (YFP-p62), induction d’ALIS en exposant les cellules à LPS et une méthode étape par étape pour rassembler les prebleach et postbleach FRAP, analyse des images et des données. Finalement, nous discutons des facteurs importants à considérer lorsqu’il procède à une expérimentation de PAF.

Montré ici sont le résultat d’une expérience typique dans lequel nous avons utilisé le FRAP afin d’examiner le degré de mobilité de p62 dans ALIS RAW264.7 cellules traitées avec le LPS pour 3-5 h12. Figure 3 A montre les fichiers RAW provenant d’une eau de Javel, contrôler et ROI d’arrière-plan après la pile d’images avait été alignée pour corriger pour les petits montants (< 3 ~ µm) de dérive d’image d’ALIS. YFP-p62 fluorescence dans cette ALIS à prebleach et postbleach est montré en Figure 3E et supplémentaire vidéo 1. Figure 3 B montre ces données après correction du fond. Figure 3 C affiche ces données après correction pour la fluorescence dans le contrôle ROI. Figure 3 D montre ces valeurs normalisés à la fluorescence moyenne des 5 valeurs prebleach dans l’eau de Javel ROI. Le degré de blanchiment ne suffisait pas dans cette expérience (profondeur d’eau de Javel = 91.94). YFP-p62 fluorescence dans cette ALIS récupéré lentement, comme t1/2 = 128,27 s (2,14 min). YFP-p62 n’était pas une protéine très mobile dans cette expérience, comme Mf = 21.97 If = 78.03.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59288/59288fig1.jpg"> Figure 1 : Un diagramme d’une cellule RAW264.7 et étapes pour l’analyse de l’image après les images de la PAF ont été alignés pour corriger la dérive d’image de l’ALIS. (A) schéma d’une cellule RAW264.7 illustrant plusieurs ALIS et l’eau de Javel, de régulation et ROIs de fond au sein de l’acquisition de ROI. (B) une représentation idéalisée de FRAP brute tirées dans l’eau de Javel, de régulation et fond ROIs dans panneau A. (C) un graphique en données brutes de PAF qui ont été corrigées idéalisé. (D) un graphique idéalisé de données FRAP-corrigées ont été normalisés à fluorescence dans le contrôle ROI. (E) un idéalisé graphique des données FRAP normalisées et correction de fond qui ont été normalisées pour la fluorescence prebleach l’eau de Javel ROI. Abréviations : Con = contrôle ; BG = fond. Ce chiffre a été modifié de Rabut et Ellenberg4. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59288/59288fig1large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59288/59288fig2.jpg"> Figure 2 : Images de l’interface utilisateur dans le logiciel AIM (Table des matières) pour la sélection de laser à faisceau configuration du chemin d’accès et paramètres d’acquisition image pour les expériences FRAP. Laser (A) contrôler l’écran montrant les lignes laser Argon/2, sortie et courant de tube utilisé. (B) Configuration écran montrant le faisceau de commande splitter et émission filtrent les paramètres utilisés. Scan (C) contrôler l’écran montrant le paramètre utilisé pour l’acquisition d’images. (D) Scan contrôler l’écran montrant le sténopé, gain de détecteur, amplificateur offset, gain de l’amplificateur et les paramètres de transmission pour la ligne de laser Argon/2 514 nm. (E) séries temporelles contrôlent l’écran indiquant les paramètres de série temps utilisés. Eau de Javel (F) contrôler l’écran montrant le prebleach et postbleach des paramètres utilisés. Abréviations : HFT = Haupt Farb Teiler (séparateur de faisceau dichroïque primaire) ; NT1 = 1 de Teiler Neben Farb (séparateur de faisceau dichroïque première secondaire) ; NT2 = Neben Farb Teiler 2 (séparateur de faisceau dichroïque deuxième secondaire) ; EF = filtre d’émission. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59288/59288fig2large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59288/59288fig3.jpg"> Figure 3 : Une expérience FRAP représentative pour l’étude dynamique de la YFP-p62 dans ALIS dans les cellules RAW264.7. (A) données d’intensité de fluorescence Raw pour une eau de Javel, de régulation et fond ROI. (B) les données contenues dans la paroi A après que l’eau de Javel et le contrôle ROI avaient été corrigées pour la fluorescence dans le fond ROI. (C) les données contenues dans les groupes A et B après la normalisation de l’intensité de fluorescence dans le ROI de l’eau de Javel pour tenir compte de la fluorescence dans le contrôle arrière-plan corrigé ROI. (D) les données contenues dans les panneaux A-C après normalisation de l’intensité de fluorescence dans le bleach normalisée et corrigées ROI à la moyenne des 5 premières valeurs prebleach dans l’eau de Javel ROI. Mf = 21.97, j’aif = 78.03, t1/2 = 128,27 s (2,14 min) et la profondeur de l’eau de Javel = 91.94. (E), l’image d’un ALIS à prebleach (1,5 min) et postbleach (0, 6 et 16 min). Echelle = 5 µm et est valable pour tous les panneaux. Abréviations : Con = contrôle ; BG = bruit de fond ; Corr. = corrigé ; Norm. = normalisé ; Prix moyen = moyenne. Ce chiffre a été modifié de Cabe et al.12<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59288/59288fig3large.jpg" target="_blank">s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Supplementary Video 1" src="/files/ftp_upload/59288/59288supvideo1.jpg"> Supplémentaire vidéo 1 : un ALIS typique dans un macrophage RAW264.7 avant et après Photoblanchiment. YFP-p62 fluorescence est lent à se rétablir après le photobleach ; p62 n’est donc pas une protéine très mobile. Pour cette expérience, Mf = 25.62, j’aif = 74.38, t1/2 = 442.79 s (7,38 min) et la profondeur de l’eau de Javel = 90.19. Echelle = 5 µm. Cette vidéo a été modifiée de Cabe et al.12<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59288/Fig_4-Vid_FINAL.avi" target="_blank">s’il vous plaît cliquez ici pour regarder cette vidéo. (Clic droit pour télécharger.)</a>

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Fluorescence Recovery after Photobleaching of Yellow Fluorescent Protein Tagged p62 in Aggresome-like Induced Structures

Récupération de fluorescence après Photoblanchiment du jaune Fluorescent Protein tag p62 en Structures induites ressemblant à Aggresome

Les auteurs décrivent un protocole complet et pratique pour la récupération de fluorescence après que Photoblanchiment expérimente vivre les cellules. Bien que le protocole a été utilisé pour mesurer la mobilité des jaune fluorescent protein-tag p62 en structures induites en aggresome, il peut être appliqué à une variété de systèmes de microscopie et de protéines fluorescentes.

Fluorescence recovery after photobleaching (FRAP)&#160;is a microscopy technique that can be used to quantify protein mobility in live cells. In a typical ...

La récupération de fluorescence existante après photobleaching, protocoles FRAP, sont incomplètes ou trop complexes. Le protocole présenté dans cette vidéo est significatif en ce sens qu’il est complet, pratique et simple. Le principal avantage de cette technique FRAP est qu’elle permet la quantification de la mobilité protéique à l’intérieur et entre les compartiments subcellulaires dans les cellules vivantes.Le FRAP est à l’étude à des fins thérapeutiques et diagnostiques. L’une de ces utilisations est de quantifier la diffusion dans les systèmes d’administration de médicaments dans différents tissus in vivo. Ces informations peuvent être utilisées pour optimiser la structure et la composition d’un médicament.La technique de microscopie FRAP a permis de mieux comprendre un large éventail de domaines dans lesquels la compréhension du phénomène de diffusion est d’intérêt. Il s’agit notamment de la biologie cellulaire et moléculaire, de la biologie du développement, des neurosciences, des sciences des matériaux, des biomatériaux avancés et de la découverte de médicaments. Bien que le protocole décrit soit utilisé avec les cellules mammifères, les concepts peuvent être appliqués à d’autres systèmes, tels que les cellules végétales, les cellules de levure et les bactéries.Une personne qui n’a jamais effectué cette technique peut avoir du mal à déterminer les paramètres optimaux d’acquisition d’image, à créer une région d’acquisition d’intérêt adaptée à son expérience et à calculer la fraction mobile et la mi-temps de récupération. Lorsque vous essayez cette procédure pour la première fois, assurez-vous d’effectuer plusieurs expériences pilotes pour optimiser le protocole dans le contexte des objectifs de votre expérience. Maleen Cabe, technicienne de mon laboratoire, et David Rademacher, le directeur principal de l’établissement d’imagerie, démontreront la procédure.Pour commencer, préparez une plaque de macrophages RAW264.7 transfectés YFP-p62, et traitez-les avec lipopolysaccharide tel que décrit dans le protocole de texte qui l’accompagne. Ensuite, rincez les cellules traitées avec le tampon froid de Tyrode une fois. Ensuite, ajoutez deux millilitres de tampon tyrode complété par Nocodazole à la plaque, et laissez les plaques couver à quatre degrés Celsius pendant 15 à 20 minutes avant l’imagerie et l’analyse frap.Laissez les plaques couver à quatre degrés Celsius pendant 15 à 20 minutes avant l’imagerie et l’analyse du FRAP. Lors de la configuration de l’imagerie, sélectionnez la ligne de 514 nanomètres du laser Argon/2, car le marqueur de fluorescence a une excitation maximale à 512 nanomètres, et une émission maximale à 527 nanomètres. Ensuite, dans la fenêtre de contrôle laser, cliquez sur Argon/2, 458, 477, 488, 514, puis cliquez sur le bouton veille.Après avoir attendu environ trois minutes pour que le laser se réchauffe, cliquez sur le bouton On. Réglez ensuite la puissance laser du laser à 100% et appuyez sur Entrez. Ensuite, réglez la transmission de la ligne laser à 5% Sur le microscope, tournez-vous vers le Plan-Apochromat 63x grossissement 1,40 objectif d’huile d’ouverture numérique.Visualisez le spécimen à travers l’oculaire du microscope et placez une structure induite en forme d’aggresome au centre du champ de vision. Ensuite, dans le logiciel d’acquisition, réglez la taille du cadre à 512 par 512 pixels, la vitesse d’analyse à huit, et la profondeur des données à 12 Bits. Réglez également la moyenne d’analyse à un, le zoom optique à trois, et appuyez sur Entrez.Ensuite, se le sténopé à 1,95 unités d’erreur et le gain de détecteur à 582, qui est juste en dessous de la saturation. Créez une région d’intérêt en forme de carré pour l’acquisition de l’image, qui a les dimensions 150 par 150 pixels. Configurez la série de temps de telle sorte que la région d’intérêt est scannée 35 fois, une fois toutes les 30 secondes.Ensuite, réglez le contrôle de l’eau de Javel de telle sorte que le photobleaching se produira après l’analyse numéro cinq, pour recueillir cinq images de pré-coupe de la région d’intérêt. Appuyez sur la clé Entrez pour confirmer. Ensuite, allez à la fenêtre Bleach Regions et créez une région d’eau de Javel de forme circulaire d’intérêt dans la zone de structure induite aggresome-like, qui a un diamètre de 10 pixels.Maintenant, réglez le nombre d’itérations à 300, et appuyez à nouveau sur la clé Enter. Ensuite, réglez la ligne laser à 100% de puissance, et entrez 100 dans le champ de transmission pour cent pour le laser, et appuyez sur Entrez. Enfin, exécutez le programme d’acquisition d’images pour recueillir des données FRAP à partir de 10 structures induites de façon aggresome dans 10 cellules avec moins de trois microns de dérive.Pour commencer l’analyse des données, transférez d’abord les fichiers AIM lsm à un ordinateur personnel pour analyse de données. Correction de la dérive de l’image en alignant ou en faisant correspondre la pile d’images de séries horaires de la région d’acquisition d’intérêt en ouvrant chaque fichier AIM lsm avec un programme de traitement d’image. Ensuite, sélectionnez Plugins, Registration, StackReg et Translation, puis sélectionnez Plugins, Registration, StackReg, puis Rigid Body.Ensuite, mettre en place la région d’intérêt gestionnaire pour mesurer l’intensité du signal dans la région d’eau de Javel d’intérêt. Pour cela, sélectionnez l’outil ovale, puis dessinez un cercle dans la région d’eau de Javel d’intérêt avec un diamètre de 10 pixels, puis cliquez sur le bouton Ajouter. Une fois ajouté, mettre en place le programme pour mesurer l’intensité du signal dans la région de contrôle d’intérêt.Sélectionnez l’outil rectangle, puis dessinez un carré de 20 par 20 pixels dans la région de contrôle, et cliquez sur le bouton Ajouter. Enfin, mettre sur place la région d’intérêt gestionnaire pour mesurer l’intensité du signal dans la région de fond d’intérêt. Sélectionnez l’outil rectangle, dessinez un carré de 20 par 20 pixels dans la région d’arrière-plan, puis cliquez sur le bouton Ajouter.Après avoir ajouté les régions à analyser dans roi manager, renommez-les Bleach ROI, Control ROI, et Background ROI, en conséquence. Mesurer l’intensité du signal dans chaque région. Pour ce faire, sélectionnez Bleach ROI, Control ROI et Background ROI, puis passez à More et sélectionnez Multi Measure.Coller les résultats à une feuille de calcul en colonnes étiquetées Bleach ROI, Control ROI et Background ROI, respectivement. Commencez par corriger l’intensité du signal dans le roi bleach et le retour sur investissement de contrôle en soustrayant les valeurs de la colonne étiquetée Retour sur investissement arrière des valeurs de la colonne étiquetée Bleach ROI, et la colonne étiquetée Control ROI. Étiquetez ces nouvelles colonnes Corrigé Bleach ROI et Correction du Retour sur investissement de contrôle.Ensuite, normalisez le signal dans le roi bleach au signal corrigé en arrière-plan dans le roi de contrôle. Divisez les valeurs de la colonne étiquetée Roi d’eau de Javel corrigée par les valeurs de la colonne étiquetées Roi de contrôle corrigé. Étiquetez cette nouvelle colonne, Normalized Corrected Bleach ROI.Ensuite, normalisez le signal dans la colonne normalisée de roi d’eau de Javel corrigée à la moyenne des cinq valeurs de pré-coupe dans le roi bleach. Divisez les valeurs de la colonne étiquetée Roi d’eau de Javel corrigée normalisée par la moyenne des cinq valeurs de pré-coupe dans le roi bleach. Étiquetez cette nouvelle colonne, Normalized Corrected Prebleach Average Bleach ROI.Enfin, ouvrez un programme de traitement d’image. Curve s’adapte aux données normalisées et corrigées du roi de l’eau de Javel en copiant les valeurs normalisées de retour sur investissement corrigé de l’eau de Javel postbleach et les valeurs de temps correspondantes. Passez-les dans la fenêtre Curve Fitter, sélectionnez la récupération exponentielle du menu de dropdown Curve Fitter et sélectionnez Fit.Montré ici est une vidéo typique de récupération de fluorescence après photobleaching pour RAW264.7 cellules traitées avec LPS. La récupération de fluorescence dans la région d’intérêt induite aggresome-like de structure, est lente. Cette expérience utilise le photobleaching pour examiner le degré de mobilité de p62.p62 fluorescence dans les structures induites aggresome-like, prebleach et postbleach, est montré ici. Comme décrit dans cette vidéo, l’intensité de fluorescence peut être suivie au fil du temps. Après correction et normalisation de fond, la fluorescence p62 peut être calculée pour décrire la fraction mobile comme 22%la fraction immobile comme 78%et décrit la mi-temps de récupération dans les structures induites aggresome-like, comme 2.14 minutes.N’oubliez pas qu’il est particulièrement important de bien définir la région d’acquisition d’intérêt afin qu’elle comporte un ALIS d’intérêt, une région de contrôle d’intérêt et une région d’intérêt de fond. Après cette procédure, d’autres techniques quantitatives de microscopie fluorescente peuvent être appliquées, telles que la perte de fluorescence dans le photobleaching, flip, et le photobleaching sélectif. Alors que flip mesure le degré de continuité et de communication entre compartiments subcellulaires, le photobleaching sélectif fournit des informations cinétiques sur le transport actif et passif des protéines dans les organites, ou entre les zones riches en protéines.Frap a été initialement développé pour quantifier le mouvement latéral des protéines dans les membranes cellulaires. Par la suite, il a été utilisé pour quantifier la mobilité des protéines à l’intérieur et entre une variété de compartiments subcellulaires, ce qui a ouvert la voie aux chercheurs pour répondre à des questions dans une variété de domaines, y compris la biologie cellulaire et moléculaire, la biologie du développement, les neurosciences, les sciences des matériaux, les biomatériaux avancés et la découverte de médicaments.

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