Name: fluorescence recovery after photobleaching of yellow fluorescent protein tagged p62 in aggresome-like induced structures
Uploaded: 2019-03-26T14:00:00
Duration: 12 min 58 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Fluorescence Recovery after Photobleaching of Yellow Fluorescent Protein Tagged p62 in Aggresome-like Induced Structures at JoVE.com

אנו מודים ד ר סת Robia אוניברסיטת לויולה שיקגו על הערותיו יקר על כתב היד הזה. עבודה זו נתמכה על ידי NIH גרנט 1R01NS073967-01A1 כדי ג'ואנה ג Bakowska.

<ol>
	<li>Axelrod, D., Koppel, D. E., Schlessinger, J., Elson, E., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mobility+measurement+by+analysis+of+fluorescence+photobleaching+recovery+kinetics.">Mobility measurement by analysis of fluorescence photobleaching recovery kinetics.</a> Biophysical Journal. 16 (9), 1055-1069 (1976).</li><li>Peters, R., Peters, J., Tews, K. H., Bahr, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microfluorimetric+study+of+translational+diffusion+in+erythrocyte+membranes.">A microfluorimetric study of translational diffusion in erythrocyte membranes.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 367 (3), 282-294 (1974).</li><li>Patterson, G., Day, R. N., Piston, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+protein+spectra.">Fluorescent protein spectra.</a> Journal of Cell Science. 114, 837-838 (2001).</li><li>Rabut, G., Ellenberg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photobleaching+techniques+to+study+mobility+and+molecular+dynamics+of+proteins+in+live+cells:+FRAP,+iFRAP,+and+FLIP.">Photobleaching techniques to study mobility and molecular dynamics of proteins in live cells: FRAP, iFRAP, and FLIP.</a> Live Cell Imaging: A Laboratory Manual (1st ed). , 101-126 (2004).</li><li>Fritzsche, M., Charras, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+protein+reaction+dynamics+in+living+cells+by+fluorescence+recovery+after+photobleaching.">Dissecting protein reaction dynamics in living cells by fluorescence recovery after photobleaching.</a> Nature Protocols. 10 (5), 660-680 (2015).</li><li>Goodwin, J. S., Kentworthy, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photobleaching+approaches+to+investigate+diffusional+mobility+and+trafficking+of+Ras+in+living+cells.">Photobleaching approaches to investigate diffusional mobility and trafficking of Ras in living cells.</a> Methods. 37 (2), 154-164 (2005).</li><li>Hildick, K. L., Gonz&#224;lez-Gonz&#224;lez, I. M., Jaskolski, F., Henley, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lateral+diffusion+and+exocytosis+of+membrane+proteins+in+cultured+neurons+assessed+using+fluorescence+recovery+and+fluorescence-loss+photobleaching.">Lateral diffusion and exocytosis of membrane proteins in cultured neurons assessed using fluorescence recovery and fluorescence-loss photobleaching.</a> Journal of Visualized Experiments. (60), e3747 (2012).</li><li>Nissim-Rafinia, M., Meshorer, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photobleaching+assays+(FRAP+&amp;+FLIP)+to+measure+chromatin+protein+dynamics+in+living+embryonic+stem+cells.">Photobleaching assays (FRAP &amp; FLIP) to measure chromatin protein dynamics in living embryonic stem cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (52), e2696 (2011).</li><li>Zheng, C., Petralia, R. S., Wang, Y., Kachar, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+recovery+after+photobleaching+(FRAP)+of+fluorescence+tagged+proteins+in+dendritic+spines+of+cultured+hippocampal+neurons.">Fluorescence recovery after photobleaching (FRAP) of fluorescence tagged proteins in dendritic spines of cultured hippocampal neurons.</a> Journal of Visualized Experiments. (50), e2568 (2011).</li><li>Thevenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+pyramid+approach+to+subpixel+registration+based+on+intensity.">A pyramid approach to subpixel registration based on intensity.</a> IEEE Transactions on Image Processing. 7 (1), 27-41 (1998).</li><li>Ishikawa-Ankerhold, H. C., Ankerhold, R., Drummen, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+fluorescence+microscopy+techniques--FRAP,+FLIP,+FLAP,+FRET+and+FLIM.">Advanced fluorescence microscopy techniques--FRAP, FLIP, FLAP, FRET and FLIM.</a> Molecules. 17 (4), 4047-4132 (2012).</li><li>Cabe, M., Rademacher, D. J., Karlsson, A. B., Cherukuri, S., Bakowska, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PB1+and+UBA+domains+of+p62+are+essential+for+aggresome-like+induced+structure+formation.">PB1 and UBA domains of p62 are essential for aggresome-like induced structure formation.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 503 (4), 2306-2311 (2018).</li><li>Brown, E. B., Wu, E. S., Zipfel, W., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+molecular+diffusion+in+solution+by+multiphoton+fluorescence+photobleaching+recovery.">Measurement of molecular diffusion in solution by multiphoton fluorescence photobleaching recovery.</a> Biophysical Journal. 77 (5), 2837-2849 (1999).</li><li>Centonze, V., Pawley, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tutorial+on+practical+confocal+microscopy+and+the+use+of+the+confocal+test+specimen.">Tutorial on practical confocal microscopy and the use of the confocal test specimen.</a> Handbook of biological confocal microscopy. , 549-570 (1995).</li><li>Chudakov, D. M., Matz, M. V., Lukyanov, S., Lukyanov, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+proteins+and+their+applications+in+imaging+living+cells+and+tissues.">Fluorescent proteins and their applications in imaging living cells and tissues.</a> Physiological Reviews. 90 (3), 1103-1163 (2010).</li></ol>

המחברים יש אין ניגוד אינטרסים לחשוף.

אנו מספקים פרוטוקול צעד אחר צעד מקיף, מעשיים, פשוטים FRAP ניסויים עם תאים חיים. בזאת, הפרוטוקול שימש כדי למדוד את הניידות של YFP-p62 ב- ALIS ב מקרופאגים RAW264.7, אבל זה יכול להיות מיושם רבים של הלייזר סריקת מערכות מיקרוסקופ קונפוקלי גנטית המקודדים חלבונים פלורסנט זמינים כעת. עבור כל מערכת מיקרוסקופ, טייס הניסויים הם קריטיים עבור קביעת פרמטרים FRAP אופטימליים, כולל רכישה, אקונומיקה, ומידות שליטה רועי, עוצמת לייזר photobleaching, ייבוא תמונות prebleach ו- postbleach. סביר לצפות פרמטרים FRAP אופטימליים כדי להיות שונה עבור כל מקודדים גנטית פלורסנט חלבון ותא קו.
גורמים חשובים שיש לקחת בחשבון בעת עריכת ניסוי FRAP כוללים (א) להשגת מתאימים אקונומיקה עומק, (ב) השימוש צעד הלבנת קצרה, postbleach (ג) דבר המאפשר זמן מספיק כדי לבחון את תפקוד החלמה מלאה, יעילות (ד) photobleaching, (ה). cytotoxicity עם חוזרות FRAP, (נ) ההכללה של פקד עבור אובדן פלורסצנטיות עקב הדמיה חוזרות ונשנות. אנו ממליצים כי אקונומיקה עומק, אשר יכול להיות מחושב על פי המשוואה המפורטת בסעיף 3.3.1, להיות ≥9013. כאשר הוא מלבין עומק < 90, מידת ההתאוששות זריחה postbleach לזלזל, ואת הערכים של אניf, Mf, ו- t1/2 יהיו שגויים. למרות משך ועוצמת פעימות לייזר בתדר אקונומיקה עשויים להשתנות בין ניסויים FRAP, חשוב כי הצעד photobleaching להיות קצר ומהיר באופן משמעותי יותר מאשר הפונקציה שחזור זריחה. אם לא, אז כמות משמעותית של קרינה פלואורסצנטית שחזור יכול להתרחש במהלך השלב הלבנת. עם זמן ארוך מלבין, קרינה פלואורסצנטית שחזור במהלך השלב הלבנת לא ניתן למדוד ולאחר שזה יוביל מדידות שגויות של אניf, Mf, ו-t1/2. בנוסף, כדי להשיג את הערכים הנכונים עבור אניf, Mf, ו-t1/2, רכישת רועי להתייחס postbleach עד רמת קרינה פלואורסצנטית האקונומיקה רועי הגיע מישור. לדוגמה, בניסויים שלנו FRAP, לא היה הבדל בין ה-אניf, Mfו- t1/2 ערכים כאשר הבחנו פלורסצנטיות YFP-p62 ב האקונומיקה רועי 32.2 דקות postbleach לעומת כאשר הבחנו YFP-p62 ב האקונומיקה ROI עבור מין נמצא 15.1 postbleach; לפיכך, הגענו למסקנה כי הפונקציה שחזור הגיעו מישור דקות נמצא 15.1 postbleach12. לגבי יעילות photobleaching, photobleaching עולה עם הריבוע של מקדם זום אופטי14. לפיכך, שימוש בעדשות זום אופטי גבוה היא חיובית על photobleaching המהירה אבל יכול לגרום photobleaching לא רצויה במהלך הרכישה; האחרון יכול להיות אחראים על ידי הדמיה פקד ROI. Photobleaching חוזרות היא להימנע ככל זה יכול להוביל הדור של מינים חמצן תגובתי ציטוטוקסיות (ROS). עם זאת, מידת ROS דור עקב חשיפה לייזר בעוצמה גבוהה הוא נמוך יותר עבור חלבונים פלורסנט מקודדים גנטית מאשר כימי fluorophores (למשל, נוגדנים פלורסנט)15, האבחון שנוצר נוטים יותר להגיב בתוך גנטית פלורסנט החלבונים המקודדים מאשר עם מולקולות אחרות התא4. בנוסף ההסתברות גדלה של יצירת ROS ציטוטוקסיות, photobleaching חוזרות היא ניזונה גם ככה קשה לשלוט. בסופו של דבר, למרות שידור נמוכה לייזר משמש כדי לרכוש כל התמונות ללא אקונומיקה, כמה photobleaching תמיד יתרחשו, אשר חייבים להיות מבוקרים. פקדים אפשרי בשביל זה כוללים ניטור קרינה פלואורסצנטית בפקד ROI במסגרת הרכישה, רועי, קבלת תמונות בקרה בתא מולבן שכנות, ביצוע בקרת ניסויים עם ההגדרות זהים לאלה המשמשים ניסויים photobleaching אבל בלי האירוע photobleaching.

קרינה פלואורסצנטית התאוששות לאחר photobleaching (FRAP) היא טכניקה מיקרוסקופית שניתן לכמת חלבון דינאמיקה של חיים תאים1,2. הפופולריות של FRAP גדל כתוצאה מהזמינות מסחרי נרחב של סריקת מיקרוסקופ קונפוקלי עם רזולוציה גבוהה, מהירות ורגישות לייזר, "קשת" של מקודדים גנטית חלבונים פלורסנט, כגון ירוק ניאון חלבון (GFP), חלבון פלואורסצנטי צהוב (YFP)3. חלבונים פלורסנט מקודדים גנטית הם התמזגו כדי חלבון עניין כדי לאפשר לוקליזציה subcellular של החלבון עניין. בניסוי FRAP טיפוסי, קרינה פלואורסצנטית מצב יציב באזור רכישה של עניין (ROI) בתוך תא הוא ציין באמצעות הדמיה חוזרות ונשנות של רועי זה עם אור לייזר בעוצמה נמוכה. לאחר מכן, מולקולות פלורסנט הן במהירות ובאופן בלתי הפיך לקוי בקבוצת משנה מוגדרים מראש של רכישת רועי, ןלהל האקונומיקה רועי, על ידי חשיפה קצרה אור לייזר בעוצמה גבוהה. כמו חלבונים חדשים מולבן לחדש חלבונים מולבן לאורך זמן, המהירות ואת עוצמת קרינה פלואורסצנטית השחזור של האקונומיקה ROI מספק מידע אודות חלבון ניידות (איור 1)4.
האינטרס שלנו בקביעת הניידות של אוביקוויטין מחייב חלבון p62 (הידוע גם sequestosome-1) במבנים דמויי aggresome מושרה (ALIS) ב מקרופאגים RAW264.7 מאתר לאחר גירוי עם ליפופוליסכריד (LPS) הביאה אותנו כדי לסקור את FRAP ספרות. למרבה הצער, רבים מן הפרוטוקולים הקיימים FRAP הם חלקיים או מורכבים באופן מופרז5,6,7,8,9. חלקם אינם מספקים מידע מפורט אודות הגדרות לייזר, קרן נתיב תצורה, התמונה רכישה פרמטרים5,6,7,8,9. אחרים להשמיט פרטים חשובים לגבי ניתוח נתונים, כגון כיצד הנושא של אקונומיקה רועי להיסחף6,9 או כיצד לחשב פרמטרים חשובים שחזור, לרבות שבר ניידים (נז), שבר משותק (אניf), ואת המחצית של השחזור (t½)5,7. לעומת זאת, אחרים דגש רב מדי על נוסחאות מתמטיות מורכבות המשמש לחישוב Mf, אניf, ו- t1/25,6,8,9. לכן, המטרה שלנו היא לספק פרוטוקול צעד אחר צעד מקיף, מעשית וישירה לניסויים FRAP עם תאים חיים.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:835px;" width="835">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium</td>
			<td style="width:211px;">Hyclone</td>
			<td style="width:137px;">SH30022.01</td>
			<td style="width:167px;">High Glucose (4.5 g/L)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Fetal bovine serum</td>
			<td style="width:211px;">Gemini Bio-Products</td>
			<td style="width:137px;">100-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Glass bottom dishes</td>
			<td style="width:211px;">MatTek</td>
			<td style="width:137px;">P35G-1.5-14-C</td>
			<td>35-mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Image J software</td>
			<td style="width:211px;">National Institutes of Health</td>
			<td style="width:137px;">N.A.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Lipopolysaccharide (LPS)</td>
			<td style="width:211px;">Sigma</td>
			<td style="width:137px;">L4391</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Nocodazole</td>
			<td style="width:211px;">Sigma</td>
			<td style="width:137px;">M1404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Penicillin-streptomycin solution</td>
			<td style="width:211px;">Corning</td>
			<td style="width:137px;">30-002-Cl</td>
			<td>100&#215;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Plan-Apochromat 63&#215;/1.40 oil objective</td>
			<td style="width:211px;">Carl Zeiss MicroImaging, Inc</td>
			<td style="width:137px;">4407629904000000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Polyethylenimine (PEI)</td>
			<td style="width:211px;">Polysciences</td>
			<td style="width:137px;">23966-1</td>
			<td>linear (MW 25,000)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">RAW 264.7 murine macrophages</td>
			<td style="width:211px;">ATCC</td>
			<td style="width:137px;">TIB-71</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Zeiss confocal microscope</td>
			<td style="width:211px;">Carl Zeiss MicroImaging, Inc</td>
			<td style="width:137px;">LSM 510</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fluorescence recovery after photobleaching of yellow fluorescent protein tagged p62 in aggresome-like induced structures

קרינה פלואורסצנטית התאוששות לאחר photobleaching (FRAP) היא טכניקה מיקרוסקופית שניתן לכמת ניידות חלבונים בתאים חיים. בניסוי FRAP טיפוסי, מצב יציב פלורסצנטיות נצפית על ידי הדמיה חוזרות עם אור לייזר בעוצמה נמוכה. לאחר מכן, מולקולות פלורסנט הם במהירות ובאופן בלתי הפיך לקוי באמצעות חשיפה קצרה אור לייזר בעוצמה גבוהה. מידע על חלבון ניידות מתקבל על-ידי ניטור ההתאוששות של זריחה. השתמשנו FRAP כדי לקבוע את הניידות של p62 במבנים דמויי aggresome מושרה (ALIS) ב מקרופאגים מאתר לאחר גירוי עם ליפופוליסכריד (LPS). בגלל פרוטוקולים רבים FRAP הקיים או לא שלם או מורכבים, המטרה שלנו הייתה לספק פרוטוקול צעד אחר צעד מקיף, מעשית וישירה לניסויים FRAP עם תאים חיים. כאן, אנו מתארים RAW264.7 מקרופאג תרביות תאים עם צהוב הניאון חלבון-p62 (YFP-p62), אינדוקציה של ALIS באמצעות חשיפת התאים LPS ולאחר שיטה שלב אחר שלב של איסוף prebleach postbleach FRAP תמונות ונתונים וניתוח. לבסוף, נדון גורמים חשובים שיש לקחת בחשבון בעת עריכת ניסוי FRAP.

המוצגות כאן הן התוצאות של ניסוי טיפוסי שבו השתמשנו FRAP לבחון את מידת הניידות של p62 ב- ALIS בתאים RAW264.7 מטופלים עם LPS h 3-512. איור 3 א מציג הנתונים הגולמיים המתקבל מלבין, לשלוט, רקע רועי לאחר הערימה של תמונות היו מיושרים כדי לתקן עבור כמויות קטנות (< ~ 3 מיקרומטר) של התמונה סחיפה של ALIS. קרינה פלואורסצנטית YFP-p62 ב- ALIS הזה ב prebleach ו postbleach מוצג באיור 3E ו- 1 וידאו משלימים. איור 3 B מראה נתונים אלה לאחר תיקון רקע. איור 3 ג מראה נתונים אלה לאחר תיקון עבור קרינה פלואורסצנטית בפקד ROI. איור 3 D מציגה נתונים אלה מנורמל ל פלורסצנטיות הממוצע של הערכים prebleach 5 האקונומיקה רועי. די בניסוי זה היה מידת הלבנה (אקונומיקה עומק = 91.94). קרינה פלואורסצנטית YFP-p62 בתוך זה ALIS התאושש לאט, כמו t1/2 = 128.27 s (2.14 דקות). YFP-p62 לא היה חלבון מאד ניידים בניסוי זה, כמו Mf = 21.97 ואניf = 78.03.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59288/59288fig1.jpg"> איור 1 : דיאגרמה של תא RAW264.7 והשלבים לניתוח תמונה אחרי הדימויים FRAP מיושרים לתיקון התמונה הסחף של ALIS. (א) תרשים של תא RAW264.7 המתארים ALIS מספר אקונומיקה, שליטה לבין הרקע ROIs בתוך הרכישה ROI. (B) תיאור אידאלית של raw FRAP נתונים להשיג מלבין, שליטה ורקע ROIs בלוח א (ג) של גרף אידאלית של הנתונים הגולמיים FRAP כי כבר תוקנו-רקע. (ד) גרף אידאלית מתוקן-רקע FRAP נתונים נרמלו כדי קרינה פלואורסצנטית בפקד רועי. (E) אידאלית גרף נתונים FRAP מנורמל והיא תוקנה-רקע נרמלו זריחה prebleach ב האקונומיקה ROI. קיצורים: Con = שליטה; BG = רקע. איור זה שונה מ- Rabut ו- ellenberg החוקרים למסקנה4. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59288/59288fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59288/59288fig2.jpg"> איור 2: תמונות של ממשק המשתמש לתוכנה AIM (טבלה של חומרים) לבחירה לייזר, קרן נתיב, ותצורה של התמונה פרמטרים רכישה עבור הניסויים FRAP. (א) לייזר לשלוט המסך מציג את ארגון/2 קווי לייזר, פלט ו- tube הנוכחי השתמש. תצורה (B) שולטים המסך מציג את הקרן הפיצול, פליטה לסנן מההגדרות שנעשה בהן שימוש. (ג) סריקה לשלוט המסך מציג את ההגדרה המשמש עבור ייבוא תמונות. סריקה (D) לשלוט על המסך מציג את חריר, גלאי רווח, היסט מגבר, מגבר רווח והגדרות שידור עבור שורת 514 ארגון/2 ננומטר לייזר. (E) סדרת זמן לשלוט המסך מציג את הזמן בסדרה ההגדרות המשמשות. מלבין (F) לשלוט המסך מציג את prebleach ואת postbleach פרמטרים שנעשה בהם שימוש. קיצורים: HFT = הופט Farb פקידה (ספליטר ראשי קרן ודיקרואיק זוהר); NT1 = Neben Farb פקידה 1 (ודיקרואיק זוהר הראשון משני לשגר הפיצול); NT2 = Neben-Farb-פקידה-2 (הפיצול השני משני קרן ודיקרואיק זוהר); EF = מסנן פליטה. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59288/59288fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59288/59288fig3.jpg"> איור 3 : ניסוי FRAP נציג בחקר דינמיקה YFP-p62 ב- ALIS בתאים RAW264.7. (א) זריחה Raw נתונים בעוצמה אקונומיקה, שליטה של רקע ROI. (B) כי הנתונים שניתנו בלוח A אחרי מלבין ושליטה רועי היה תוקנה על ידי קרינה פלואורסצנטית ברקע רועי. (ג) כי הנתונים שניתנו פאנלים A ו- B לאחר נרמול עוצמת קרינה פלואורסצנטית ב האקונומיקה רואי חשבון עבור קרינה פלואורסצנטית בפקד מתוקן-רקע ROI. (יח) כי הנתונים שניתנו פאנלים A-C לאחר נרמול עוצמת קרינה פלואורסצנטית ב מנורמל והיא תוקנה-רקע המלבין רועי לממוצע של הערכים prebleach קודם 5 האקונומיקה ROI. Mf = 21.97, אניf = 78.03, t1/2 = 128.27 s (דקות 2.14) ועומק אקונומיקה = 91.94. (E) תמונה של ALIS prebleach (1.5 דקות), postbleach (0, 6 ו- 16 דקות). סרגל קנה מידה = 5 מיקרומטר, תקף עבור כל לוחות. קיצורים: Con = שליטה; BG = רקע; קור = תיקן; . נורם. = מנורמל; ממוצע = average. איור זה שונה מקייב ואח12<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59288/59288fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Supplementary Video 1" src="/files/ftp_upload/59288/59288supvideo1.jpg"> 1 וידאו משלימים: ALIS טיפוסי ב macrophage RAW264.7 לפני ואחרי photobleaching. קרינה YFP-p62 פלואורסצנטית איטי להתאושש לאחר photobleach; לפיכך, p62 הוא לא חלבון מאד ניידים. עבור ניסוי זה, Mf = 25.62, אניf = 74.38, t1/2 = 442.79 s (7.38 דקות) ועומק אקונומיקה = 90.19. סרגל קנה מידה = 5 מיקרומטר. וידאו זה שונתה קייב ואח12<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59288/Fig_4-Vid_FINAL.avi" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג וידאו זה. (לחיצה ימנית כדי להוריד.)</a>

Watch this Scientific Journal Video about Fluorescence Recovery after Photobleaching of Yellow Fluorescent Protein Tagged p62 in Aggresome-like Induced Structures at JoVE.com

Fluorescence Recovery after Photobleaching of Yellow Fluorescent Protein Tagged p62 in Aggresome-like Induced Structures

קרינה פלואורסצנטית התאוששות לאחר Photobleaching של צהוב הניאון חלבון מתויג p62 במבנים המושרה כמו Aggresome

נתאר פרוטוקול מקיף ומעשי פלורסצנטיות שחזור לאחר photobleaching ניסויים עם חיים תאים. למרות הפרוטוקול שימש כדי למדוד את הניידות של צהוב הניאון מתויג חלבון p62 במבנים המושרה, כמו aggresome, ניתן להחיל אותה למגוון רחב של מערכות מיקרוסקופ וחלבונים פלורסנט.

Fluorescence recovery after photobleaching (FRAP)&#160;is a microscopy technique that can be used to quantify protein mobility in live cells. In a typical ...

התאוששות פלואורסצנטיות קיימת לאחר פוטובלאצ'ים, פרוטוקולי FRAP, אינם שלמים או מורכבים מדי. הפרוטוקול המוצג בסרטון זה הוא משמעותי גם היטב, מעשי וישיר. היתרון העיקרי של טכניקת FRAP זו הוא שהיא מאפשרת כימות של ניידות חלבונים בתוך ובין תאים תת-תאיים בתאים חיים.FRAP נחקר הן למטרות טיפוליות והן למטרות אבחון. שימוש אחד כזה הוא לכמת דיפוזיה בתוך מערכות אספקת תרופות ברקמות שונות ב vivo. מידע זה יכול לשמש כדי לייעל מבנה סמים והרכב.טכניקת המיקרוסקופיה FRAP סיפקה תובנות במגוון רחב של תחומים שבהם הבנת תופעת ההתפזרות מעניינת. אלה כוללים ביולוגיה תאית ומולקולרית, ביולוגיה התפתחותית, מדעי המוח, מדעי החומר, ביו-חומרים מתקדמים וגילוי תרופות. למרות שהפרוטוקול המתואר הוא לשימוש עם תאי יונקים, ניתן להחיל את המושגים על מערכות אחרות, כגון תאי צמחים, תאי שמרים וחיידקים.אדם שמעולם לא ביצע טכניקה זו עשוי להיאבק בקביעת הפרמטרים האופטימליים של רכישת תמונה, יצירת אזור רכישה מעניין שמתאים לניסוי שלהם, וחישוב החלק הנייד ומחצית ההחלמה. בעת ניסיון הליך זה בפעם הראשונה, הקפד לבצע מספר ניסויי פיילוט כדי לייעל את הפרוטוקול בהקשר של מטרות הניסוי שלך. הדגימו את ההליך יהיו מאלן קייב, טכנאי מהמעבדה שלי, ודיוויד רדמאכר, מנהל מתקן ההדמיה המרכזי.כדי להתחיל, להכין צלחת של מקרופאגים YFP-p62 מגולפים RAW264.7, ולטפל בהם עם Lipopolysaccharide כמתואר בפרוטוקול הטקסט הנלווה. לאחר מכן, לשטוף את התאים המטופלים עם חיץ קר כקרח של טירודה פעם אחת. לאחר מכן, להוסיף שני מיליליטר של חיץ טירוד תוסף Nocodazole לצלחת, ולאפשר את הצלחות דגירה בארבע מעלות צלזיוס במשך 15 עד 20 דקות לפני הדמיה וניתוח FRAP.אפשר את הצלחות דגירה בארבע מעלות צלזיוס במשך 15 עד 20 דקות לפני הדמיה וניתוח FRAP. מעל במערך ההדמיה, בחר את קו 514 ננומטר של לייזר ארגון /2, כמו סמן פלואורסצנטי יש עוררות שיא ב 512 ננומטר, ו פליטת שיא ב 527 ננומטר. לאחר מכן, בחלון בקרת לייזר, לחץ על ארגון/2, 458, 477, 488, 514 ולאחר מכן לחץ על לחצן המתנה.לאחר המתנה של כשלוש דקות עד שהלייזר יתחמם, לחץ על לחצן ב. לאחר מכן הגדר את כוח הלייזר של הלייזר ל- 100% והקש Enter. לאחר מכן, הגדר את השידור של קו הלייזר ל 5%על המיקרוסקופ, לפנות Plan-Apochromat 63x הגדלה 1.40 צמצם צמצם המטרה.הצג את הדגימה דרך עינית המיקרוסקופ והצב מבנה מושרה דמוי aggresome במרכז שדה המבט. לאחר מכן, בתוכנת הרכישה, הגדר את גודל המסגרת ל- 512 על 512 פיקסלים, את מהירות הסריקה לשמונה ואת עומק הנתונים ל- 12 סיביות. הגדר גם את ממוצע הסריקה לאחד, את גודל התצוגה האופטי לשלוש והקש Enter.לאחר מכן, se חור הסיכה ל 1.95 יחידות שגיאה רווח גלאי ל 582, אשר ממש מתחת לרוויה. צור אזור מעניין בצורת ריבוע עבור רכישת התמונה, עם הממדים 150 על 150 פיקסלים. הגדר את סדרת הזמן כך שאזור העניין נסרק 35 פעמים, אחת ל-30 שניות.לאחר מכן, להגדיר את בקרת אקונומיקה כך photobleaching יתרחש לאחר סריקה מספר חמש, כדי לאסוף חמש תמונות prebleach של האזור של עניין. הקש על מקש Enter כדי לאשר. לאחר מכן, עבור לחלון אזורי אקונומיקה וצור אזור אקונומיקה עגול של עניין בתוך אזור המבנה המושרה דמוי aggresome, כי יש קוטר של 10 פיקסלים.כעת, הגדר את מספר איטראציות ל- 300 ולאחר מכן הקש שוב על מקש Enter. לאחר מכן, הגדר את קו הלייזר ל- 100%power והזן 100 בשדה אחוז השידור עבור הלייזר והקש Enter. לבסוף, הפעל את התוכנית לרכישת תמונות כדי לאסוף נתוני FRAP מ-10 מבנים מושרה דמויי aggresome ב-10 תאים עם פחות משלושה מיקרונים של סחף.כדי להתחיל בניתוח נתונים, העבר תחילה את קבצי ה- LSM AIM למחשב אישי לצורך ניתוח נתונים. נכון להיסחף תמונה על ידי יישור או התאמה של ערימה של תמונות סדרת זמן של אזור הרכישה של עניין על ידי פתיחת כל קובץ LSM AIM עם תוכנית עיבוד תמונה. לאחר מכן, בחר תוספים, רישום, StackReg, ותרגום, ואחריו בחירת תוספים, רישום, StackReg, ולאחר מכן גוף נוקשה.לאחר מכן, הקים את אזור מנהל העניין כדי למדוד את עוצמת האות באזור אקונומיקה של עניין. לשם כך, בחר בכלי אליפסה ולאחר מכן צייר עיגול באזור האקונומיקה המעניין בקוטר של 10 פיקסלים ולאחר מכן לחץ על לחצן הוסף. לאחר שנוספה, הגדר את התוכנית כדי למדוד את עוצמת האות באזור הבקרה של עניין.בחרו בכלי מלבן, ולאחר מכן ציירו ריבוע של 20 על 20 פיקסלים באזור הבקרה ולחצו על הלחצן 'הוסף'. לבסוף, הגדר את אזור מנהל העניין כדי למדוד את עוצמת האות באזור הרקע של עניין. בחרו בכלי מלבן, ציירו ריבוע של 20 על 20 פיקסלים באזור הרקע ולחצו על הלחצן 'הוסף'.לאחר הוספת האזורים שיש לנתח במנהל ההשקעות, שנה את שמם ל- Bleach ROI, Control ROI וההואריה ברקע, בהתאם. למדוד את עוצמת האות בכל אזור. כדי לבצע זאת, בחר באפשרות רוק ההשקעה של אקונומיקה, שלוט בההו על ההשקעה ובההובוי ההשקעה ברקע ולאחר מכן עבור אל עוד ובחר מולטי מידה.הדבק את התוצאות בגיליון אלקטרוני בעמודות המסופות כ- Bleach ROI, Control ROI וההוצאה על ההשקעה ברקע, בהתאמה. התחל על-ידי תיקון עוצמת האות בהחזר על ההשקעה של Bleach וההחזר על ההשקעה על-ידי חיסור הערכים בעמודה המסווים כ- Background ROI מהערכים בעמודה בשם Bleach ROI והעמודה שכותרתה Control ROI. סמן את העמודות החדשות האלה כ-RoI של אקונומיקה מתוקנת וההפקדה תוקנה.לאחר מכן, נרמל את האות בהוארי העבודה של Bleach לאות מתוקן ברקע בהו על ההשקעה של הבקרה. חלק את הערכים בעמודה המסווים כ- RoI של אקונומיקה מתוקנת לפי הערכים בעמודה שכותרתה תיקון הפקד ROI. סמן עמודה חדשה זו, תיקון מנורמל של תיקון ROI.לאחר מכן, לנרמל את האות בעמודה תיקון מנורמל אקונומיקה ROI לממוצע של חמשת הערכים prebleach בהוארי אקונומיקה. חלק את הערכים בעמודה המסומתת כ- RoI של אקונומיקה מתוקנת מנורמלת בממוצע של חמשת ערכי ההקדמה בהחלקה ROI של Bleach. סמן עמודה חדשה זו, תיקון מנורמל מראש ממוצע האקונומיקה ROI.לבסוף, פתח תוכנית לעיבוד תמונה. העקומה מתאימה את נתוני ROI הלבנה מנורמל ומתוקן על ידי העתקת postbleach מנורמל ערכי ROI הלבנה מתוקן וערכי הזמן המתאימים. הדביקו אותם בחלון 'מתאים עיקול', בחרו שחזור מעריכי מהתפריט הנפתח 'עיקול התאמה' ובחרו 'התאם'.מוצג כאן הוא וידאו טיפוסי של התאוששות פלואורסצנטיות לאחר photobleaching עבור RAW264.7 תאים שטופלו LPS. התאוששות הפלואורסצנטיות בתוך אזור המבנה המושרה דמוי ההתבגרות של עניין, היא איטית. ניסוי זה משתמש פוטובלצ'ים כדי לבחון את מידת הניידות של p62.p62 פלואורסצנטיות במבנים המושרים דמויי ההתמדה, prebleach ו postbleach, מוצג כאן. כפי שמתואר בסרטון זה, ניתן לעקוב אחר עוצמת הפלואורסצנטיות לאורך זמן. לאחר תיקון ונורמליזציה ברקע, ניתן לחשב את הפלואורסצנטיות p62 כדי לתאר את השבר הנייד כ-22% את השבר חסר התנועה כ-78% ומתאר את מחצית ההתאוששות בתוך המבנים המושרים דמויי ההאדרה, כ-2.14 דקות.זכור, חשוב במיוחד להגדיר כראוי את אזור הרכישה של עניין, כך שהוא כולל ALIS של עניין, אזור שליטה של עניין, ואזור רקע של עניין. בעקבות הליך זה, ניתן ליישם טכניקות מיקרוסקופיות פלואורסצנטיות כמותיות אחרות, כגון אובדן פלואורסצנטיות בפוטובלאצ'ינג, FLIP וצילום סלקטיבי. בעוד FLIP מודד את מידת ההמשכיות והתקשורת בין תאים תת-תאיים, פוטובלאצ'ים סלקטיביים מספקים מידע קינטי על הובלה אקטיבית ופסיבית של חלבונים לאברונים, או בין אזורים עשירים בחלבון.FRAP פותחה בתחילה כדי לכמת את התנועה השוטף של חלבונים בממברנות התא. לאחר מכן, נעשה בו שימוש לכימות ניידות חלבונים בתוך ובין מגוון תאים תת-תאיים, אשר סללו לחוקרים את הדרך לענות על שאלות במגוון תחומים, כולל ביולוגיה תאית ומולקולרית, ביולוגיה התפתחותית, מדעי המוח, מדעי החומר, ביו-חומרים מתקדמים וגילוי סמים.

Research

JoVE Journal

Biology

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

הכתמה של חלבונים עם ג&#39;ל Coomassie G-250 ללא חומצה אצטית ממס אורגני

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Fluorescent Labeling of Drosophila Heart Structures

Fluorescent Labeling of Drosophila Heart Structures

תיוג של פלורסנט תסיסנית לב מבנים

The Drosophila melanogaster dorsal vessel, or heart, is a tubular structure comprised of a single layer of contractile cardiomyocytes, pericardial cells ...

Measuring Diffusion Coefficients via Two-photon Fluorescence Recovery After Photobleaching

מדידת מקדמי דיפוזיה באמצעות שחזור שני הפוטונים Fluorescence לאחר photobleaching

Multi-fluorescence recovery after photobleaching is a microscopy technique used to measure the diffusion coefficient (or analogous transport parameters) ...

Using the GELFREE 8100 Fractionation System for Molecular Weight-Based Fractionation with Liquid Phase Recovery

באמצעות מערכת GELFREE 8100 ההיפוך חלוקה על ההיפוך חלוקה משקל מבוסס מולקולרית עם שלב החילוץ נוזלי

The GELFREE 8100 Fractionation System is a novel protein fractionation system designed to maximize protein recovery during molecular weight based ...

Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection

זמן לשגות הדמיה של מיטוזה לאחר transfection siRNA

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and ...

Photobleaching Assays (FRAP &amp; FLIP) to Measure Chromatin Protein Dynamics in Living Embryonic Stem Cells

Photobleaching Assays FRAP & FLIP to Measure Chromatin Protein Dynamics in Living Embryonic Stem Cells

מבחני photobleaching (FRAP &amp; FLIP) כדי למדוד Dynamics חלבון הכרומטין בתוך החיים בתאי גזע עובריים

Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) and Fluorescence Loss In Photobleaching (FLIP) enable the study of protein dynamics in living cells with ...

Determination of Lipid Raft Partitioning of Fluorescently-tagged Probes in Living Cells by Fluorescence Correlation Spectroscopy (FCS)

Determination of Lipid Raft Partitioning of Fluorescently-tagged Probes in Living Cells by Fluorescence Correlation Spectroscopy FCS

קביעת רפסודה ליפידים חלוקת בדיקות fluorescently-מתוייגים בתאים חיים באמצעות מתאם ספקטרוסקופיה פלואורסצנטי (FCS)

In the past fifteen years the notion that cell membranes are not homogenous and rely on microdomains to exert their functions has become widely accepted. ...

Intravital Microscopy for Imaging Subcellular Structures in Live Mice Expressing Fluorescent Proteins

מיקרוסקופית Intravital למבני ההדמיה subcellular בעכברים חיים לבטא חלבוני פלורסנט

Here we describe a procedure to image subcellular structures in live rodents that is based on the use of confocal intravital microscopy. As a model organ, ...

Simultaneous Multicolor Imaging of Biological Structures with Fluorescence Photoactivation Localization Microscopy

Localization-based super resolution microscopy can be applied to obtain a spatial map (image) of the distribution of individual fluorescently labeled ...

Protein-protein Interactions Visualized by Bimolecular Fluorescence Complementation in Tobacco Protoplasts and Leaves

חלבונים אינטראקציות דמיינו ידי bimolecular הקרינה complementation בProtoplasts הטבק ועלים

Many proteins interact transiently with other proteins or are integrated into multi-protein complexes to perform their biological function. Bimolecular ...