Name: fluorescence recovery after photobleaching of yellow fluorescent protein tagged p62 in aggresome-like induced structures
Uploaded: 2019-03-26T14:00:00
Duration: 12 min 58 s
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हम इस पांडुलिपि पर अपनी बहुमूल्य टिप्पणियों के लिए लोयोला विश्वविद्यालय शिकागो में डॉ सेठ रोबिया का शुक्रिया अदा करते हैं । इस काम के लिए NIH अनुदान 1R01NS073967-01A1 जोआना सी. Bakowska द्वारा समर्थित किया गया ।

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लेखकों के हित का कोई विरोध प्रकट नहीं है.

हम लाइव कोशिकाओं के साथ FRAP प्रयोगों के लिए एक व्यापक, व्यावहारिक, और सरल कदम दर कदम प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं । इस के साथ साथ, प्रोटोकॉल के लिए yfp की गतिशीलता को मापने के लिए इस्तेमाल किया गया था p62 कच्चे 264.7 macrophages में ALIS में, लेकिन यह लेजर स्कैनिंग संनाभि माइक्रोस्कोप सिस्टम के कई और आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग फ्लोरोसेंट प्रोटीन है कि अब उपलब्ध है लागू किया जा सकता है । किसी भी माइक्रोस्कोपी प्रणाली के लिए, पायलट प्रयोगों अधिग्रहण, ब्लीच, और नियंत्रण रॉय आकार, photoब्लीचिंग के लिए लेजर तीव्रता, और prebleach और postbleach छवि अधिग्रहण सहित इष्टतम FRAP मापदंडों का निर्धारण करने के लिए महत्वपूर्ण हैं । यह इष्टतम FRAP मापदंडों प्रत्येक आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग फ्लोरोसेंट प्रोटीन और सेल लाइन के लिए अलग करने की उंमीद करने के लिए उचित है ।
महत्वपूर्ण कारकों पर विचार करने के लिए जब एक FRAP प्रयोग आयोजित करने में शामिल है (क) उपयुक्त ब्लीच गहराई को प्राप्त करने, (ख) एक संक्षिप्त विरंजन कदम के उपयोग, (ग) पर्याप्त समय postbleach पूर्ण वसूली समारोह का निरीक्षण करने की अनुमति, (घ) photoब्लीचिंग दक्षता, (ई) दोहराया frap के साथ कोशिका आविषता, और (च) दोहराया इमेजिंग के कारण प्रतिदीप्ति हानि के लिए एक नियंत्रण का समावेश । हम अनुशंसा करते है कि ब्लीच गहराई, जो धारा 3.3.1 में प्रदान समीकरण के अनुसार गणना की जा सकती है, ≥ ९०13। जब ब्लीच गहराई 90 < है, postbleach प्रतिदीप्ति वसूली की डिग्री को कम करके आंका जाएगा, और मैंएफ, एमएफके मूल्यों, और टी1/2 गलत हो जाएगा । हालांकि अवधि और ब्लीच की तीव्रता-लेजर दालों inducing FRAP प्रयोगों के बीच भिंन हो सकते हैं, यह महत्वपूर्ण है कि photoब्लीचिंग कदम संक्षिप्त और काफी तेजी से प्रतिदीप्ति वसूली समारोह की तुलना में है । यदि ऐसा नहीं है, तो प्रतिदीप्ति वसूली की एक महत्वपूर्ण राशि विरंजन कदम के दौरान हो सकता है । एक लंबे ब्लीच समय के साथ, विरंजन कदम के दौरान प्रतिदीप्ति वसूली मापा नहीं होगा, और यह मैंएफ, एमएफ, औरटी1/2के गलत माप करने के लिए नेतृत्व करेंगे । इसके अलावा, मैंएफके लिए सही मूल्यों को प्राप्त करने के लिए,एमएफ, और टी1/2, अधिग्रहण रॉय postbleach मनाया जाना चाहिए जब तक ब्लीच रॉय में प्रतिदीप्ति स्तर एक पठार तक पहुंच गया है । उदाहरण के लिए, हमारे FRAP प्रयोगों में, वहां मैंएफ, एमएफके बीच कोई अंतर नहीं था, और टी1/2 मूल्यों जब हम yfp-३२.२ ंयूनतम POSTBLEACH के लिए ब्लीच रॉय में p62 प्रतिदीप्ति मनाया बनाम जब हम YFP मनाया-ब्लीच रॉय में p62 के लिए १५.१ min postbleach; इस प्रकार, हम निष्कर्ष निकाला है कि वसूली समारोह में १५.१ मिनट पर एक पठार पहुंचे12postbleach । photoब्लीचिंग दक्षता के संबंध में, ऑप्टिकल ज़ूम फैक्टर14के वर्ग के साथ photoब्लीचिंग बढ़ जाती है । इस प्रकार, उच्च ऑप्टिकल ज़ूम लेंस का उपयोग तेजी से photoब्लीचिंग के लिए अनुकूल है, लेकिन अधिग्रहण के दौरान अवांछनीय photoब्लीचिंग में परिणाम कर सकते हैं; बाद इमेजिंग एक नियंत्रण रॉय द्वारा के लिए जिंमेदार हो सकता है । दोहराया photoब्लीचिंग के रूप में यह साइटोटोक्सिक प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों (आरओज) की पीढ़ी के लिए नेतृत्व कर सकते है से बचना होगा । हालांकि, एक उच्च तीव्रता लेजर के लिए जोखिम के कारण ROS पीढ़ी की डिग्री रासायनिक फ्लोरोफोरस (जैसे, फ्लोरोसेंट एंटीबॉडी) के लिए की तुलना में आनुवंशिक रूप से फ्लोरोसेंट प्रोटीन के लिए कम है15, और उत्पन्न ros अधिक प्रतिक्रिया करने की संभावना है भीतर आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग फ्लोरोसेंट प्रोटीन के साथ सेल में अंय अणुओं4। साइटोटोक्सिक ROS पैदा करने की वृद्धि की संभावना के अलावा, दोहराया photoब्लीचिंग के रूप में इसे नियंत्रित करने के लिए मुश्किल है बचा जा करने के लिए है । अंत में, हालांकि कम लेजर संचरण के लिए सभी गैर ब्लीच छवियों को प्राप्त करने के लिए प्रयोग किया जाता है, कुछ photoब्लीचिंग निरपवाद रूप से घटित होगा, जो नियंत्रित किया जाना चाहिए. इस के लिए संभव नियंत्रण अधिग्रहण रॉय के भीतर एक नियंत्रण रॉय में निगरानी प्रतिदीप्ति शामिल हैं, एक पड़ोसी अविरंजित सेल में नियंत्रण छवियों को प्राप्त करने, और में इस्तेमाल किया उन लोगों के लिए समान सेटिंग्स के साथ नियंत्रण प्रयोगों प्रदर्शन photoब्लीचिंग प्रयोगों लेकिन photoब्लीचिंग घटना के बिना.

प्रकाशविरंजन (frap) के बाद प्रतिदीप्ति वसूली एक माइक्रोस्कोपी तकनीक है कि जीवित कोशिकाओं1,2में प्रोटीन गतिशीलता यों तो करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । frap की लोकप्रियता क्योंकि उच्च संकल्प, गति, और संवेदनशीलता के साथ संनाभि सूक्ष्मदर्शी स्कैनिंग लेजर की व्यापक वाणिज्यिक उपलब्धता की वृद्धि हुई है, और आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग फ्लोरोसेंट प्रोटीन की एक "इंद्रधनुष", इस तरह के रूप में हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन (जीएफपी) और पीला फ्लोरोसेंट प्रोटीन (YFP)3. आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग फ्लोरोसेंट प्रोटीन ब्याज के एक प्रोटीन के लिए संगलित कर रहे है के लिए ब्याज के प्रोटीन के subcellular स्थानीयकरण के लिए अनुमति देते हैं । एक ठेठ FRAP प्रयोग में, एक सेल के भीतर ब्याज (ROI) के अधिग्रहण क्षेत्र में स्थिर राज्य प्रतिदीप्ति कम तीव्रता लेजर प्रकाश के साथ कि रॉय की दोहराया इमेजिंग के माध्यम से मनाया जाता है । बाद में, फ्लोरोसेंट अणुओं तेजी से और अचल अधिग्रहण रॉय के एक पूर्वनिर्धारित सबसेट में बिगड़ा, इसके बाद ब्लीच रॉय के रूप में संदर्भित, उच्च तीव्रता लेजर प्रकाश के लिए संक्षिप्त जोखिम द्वारा । के रूप में नए अविरंजित प्रोटीन समय के साथ प्रक्षालित प्रोटीन की भरपाई, गति और ब्लीच रॉय में प्रतिदीप्ति वसूली की तीव्रता प्रोटीन गतिशीलता के बारे में जानकारी प्रदान करता है (चित्रा 1)4।
बैबैरिन बाध्यकारी प्रोटीन p62 की गतिशीलता का निर्धारण करने में हमारी रुचि (भी sequestosome के रूप में जाना जाता है-1) में आक्रामक की तरह प्रेरित संरचनाओं (एलिस) के साथ उत्तेजना के बाद मुरीन रॉ 264.7 मैक्रोफेज में लाइपोपोलिएसकेराइड (LPS) हमें FRAP की समीक्षा करने के लिए नेतृत्व किया साहित्य. दुर्भाग्य से, मौजूदा frap प्रोटोकॉल के कई अपूर्ण या inordinately5,6,7,8,9जटिल हैं । कुछ लेजर सेटिंग्स, बीम पथ विंयास, और छवि अधिग्रहण पैरामीटर5,6,7,8,9के बारे में विस्तृत जानकारी प्रदान नहीं करते । अंय डेटा विश्लेषण, जैसे ब्लीच रॉय बहाव6,9 या कैसे महत्वपूर्ण वसूली मापदंडों की गणना करने के लिए, मोबाइल अंश (एमएफ), स्थिर अंश सहित की समस्या को संबोधित करने के लिए के बारे में प्रमुख विवरण लोप (If), और पुनर्प्राप्ति का आधा समय (t1/2)5,7. इसके विपरीत, दूसरों के जटिल गणितीय फार्मूले पर बहुत अधिक जोर रखा एमएफ, मैंएफ, और टी1/25,6,8,9की गणना करने के लिए इस्तेमाल किया । इस प्रकार, हमारे उद्देश्य के लिए एक व्यापक, व्यावहारिक प्रदान करना है, और सीधा कदम-दर-कदम प्रोटोकॉल के लिए जीना कोशिकाओं के साथ FRAP प्रयोगों के लिए ।

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:835px;" width="835">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium</td>
			<td style="width:211px;">Hyclone</td>
			<td style="width:137px;">SH30022.01</td>
			<td style="width:167px;">High Glucose (4.5 g/L)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Fetal bovine serum</td>
			<td style="width:211px;">Gemini Bio-Products</td>
			<td style="width:137px;">100-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Glass bottom dishes</td>
			<td style="width:211px;">MatTek</td>
			<td style="width:137px;">P35G-1.5-14-C</td>
			<td>35-mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Image J software</td>
			<td style="width:211px;">National Institutes of Health</td>
			<td style="width:137px;">N.A.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Lipopolysaccharide (LPS)</td>
			<td style="width:211px;">Sigma</td>
			<td style="width:137px;">L4391</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Nocodazole</td>
			<td style="width:211px;">Sigma</td>
			<td style="width:137px;">M1404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Penicillin-streptomycin solution</td>
			<td style="width:211px;">Corning</td>
			<td style="width:137px;">30-002-Cl</td>
			<td>100&#215;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Plan-Apochromat 63&#215;/1.40 oil objective</td>
			<td style="width:211px;">Carl Zeiss MicroImaging, Inc</td>
			<td style="width:137px;">4407629904000000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Polyethylenimine (PEI)</td>
			<td style="width:211px;">Polysciences</td>
			<td style="width:137px;">23966-1</td>
			<td>linear (MW 25,000)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">RAW 264.7 murine macrophages</td>
			<td style="width:211px;">ATCC</td>
			<td style="width:137px;">TIB-71</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Zeiss confocal microscope</td>
			<td style="width:211px;">Carl Zeiss MicroImaging, Inc</td>
			<td style="width:137px;">LSM 510</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fluorescence recovery after photobleaching of yellow fluorescent protein tagged p62 in aggresome-like induced structures

प्रकाशविरंजन (FRAP) के बाद प्रतिदीप्ति वसूली एक माइक्रोस्कोपी तकनीक है कि जीवित कोशिकाओं में प्रोटीन गतिशीलता मात्रा निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । एक ठेठ FRAP प्रयोग में, स्थिर राज्य प्रतिदीप्ति कम तीव्रता लेजर प्रकाश के साथ दोहराया इमेजिंग द्वारा मनाया जाता है । बाद में, फ्लोरोसेंट अणुओं तेजी से और अचल उच्च तीव्रता लेजर प्रकाश के लिए संक्षिप्त जोखिम के माध्यम से बिगड़ रहे हैं । प्रोटीन गतिशीलता के बारे में जानकारी प्रतिदीप्ति की वसूली की निगरानी के द्वारा प्राप्त की है । हम FRAP उपयोग के लिए आक्रामक में p62 की गतिशीलता का निर्धारण-प्रेरित संरचनाओं (एलिस) की तरह म्यूरिन मैक्रोफेज में लिपोपॉलिसैकेराइड (LPS) के साथ उत्तेजना के बाद । क्योंकि कई मौजूदा FRAP प्रोटोकॉल या तो अधूरा है या जटिल है, हमारा लक्ष्य के लिए एक व्यापक, व्यावहारिक प्रदान किया गया था, और सीधा कदम दर कदम के लिए live कोशिकाओं के साथ FRAP प्रयोगों के लिए प्रोटोकॉल । यहां, हम पीले फ्लोरोसेंट प्रोटीन-p62 (yfp-p62), एलपीएस के लिए कोशिकाओं को उजागर द्वारा ALIS के प्रेरण, और prebleach और postbleach frap छवियों और डेटा विश्लेषण इकट्ठा करने के लिए एक कदम दर कदम विधि के साथ कच्चे 264.7 मैक्रोफेज अभिकर्मक का वर्णन । अंत में, हम महत्वपूर्ण कारकों पर विचार के लिए जब एक FRAP प्रयोग आयोजित करने पर चर्चा ।

यहां दिखाया एक ठेठ प्रयोग में हम FRAP इस्तेमाल के लिए कच्चे 264.7 3-5 एच12के लिए lps के साथ इलाज की कोशिकाओं में ALIS में p62 की गतिशीलता की डिग्री की जांच के परिणाम हैं । चित्रा 3 एक कच्चे एक ब्लीच, नियंत्रण से प्राप्त डेटा से पता चलता है, और पृष्ठभूमि रॉय छवियों के ढेर के बाद छोटी मात्रा के लिए सही गठबंधन किया गया था (< ~ 3 μm) के छवि बहाव के ALIS । इस एलिस में prebleach और postbleach में YFP-p62 प्रतिदीप्ति चित्रा 3ई और अनुपूरक वीडियो 1में दिखाया गया है । चित्रा 3 बी पृष्ठभूमि सुधार के बाद इन आंकड़ों से पता चलता है । चित्रा 3 C नियंत्रण रॉय में प्रतिदीप्ति के लिए सुधार के बाद इन आंकड़ों से पता चलता है । चित्रा 3 डी इन डेटा ब्लीच रॉय में 5 prebleach मूल्यों का मतलब प्रतिदीप्ति को सामांयीकृत दिखाता है । ब्लीचिंग की डिग्री इस प्रयोग में पर्याप्त थी (ब्लीच गहराई = ९१.९४). इस ALIS के भीतर YFP-p62 प्रतिदीप्ति धीरे से बरामद, टी1/2 = १२८.२७ एस के रूप में (२.१४ मिनट) । YFP-p62 इस प्रयोग में एक बहुत मोबाइल प्रोटीन नहीं था, के रूप में एमएफ = २१.९७ और मैंएफ = ७८.०३ ।
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59288/59288fig1.jpg"> चित्रा 1 : एक कच्चा 264.7 सेल और छवि विश्लेषण के लिए कदम के बाद FRAP छवियों के एक आरेख के लिए ALIS की छवि बहाव के लिए सही गठबंधन किया गया है । (क) अधिग्रहण रॉय के भीतर कई ALIS और ब्लीच, नियंत्रण, और पृष्ठभूमि rois चित्रण एक कच्चा 264.7 सेल का आरेख । (ख) पैनल ए में ब्लीच, नियंत्रण और पृष्ठभूमि रोइस में प्राप्त कच्चे frap डेटा का एक आदर्शवादी चित्रण (ग) कच्चे frap डेटा का एक idealized ग्राफ है कि पृष्ठभूमि में सुधार किया गया है । (घ) पृष्ठभूमि के एक idealized ग्राफ-सही frap डेटा है कि नियंत्रण रॉय में प्रतिदीप्ति के लिए सामांयीकृत किया गया है । (ङ) सामान्यीकृत और पृष्ठभूमि के एक idealized ग्राफ-सही frap डेटा है कि ब्लीच रॉय में prebleach प्रतिदीप्ति को सामांयीकृत किया गया है । संक्षिप: Con = नियंत्रण; BG = पृष्ठभूमि । यह आंकड़ा रापर और ऐलेनबर्ग4से संशोधित किया गया था । <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59288/59288fig1large.jpg" target="_blank">कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59288/59288fig2.jpg"> चित्रा 2: लेजर चयन, बीम पथ विंयास, और FRAP प्रयोगों के लिए छवि अधिग्रहण मापदंडों के लिए AIM सॉफ्टवेयर (सामग्री की मेज) में उपयोगकर्ता इंटरफ़ेस की छवियां । (क) लेजर नियंत्रण स्क्रीन argon/2 लेजर लाइनों, आउटपुट, और ट्यूब वर्तमान इस्तेमाल दिखा । (ख) बीम अलगानेवाला और उत्सर्जन फिल्टर सेटिंग्स का इस्तेमाल दिखा विंयास नियंत्रण स्क्रीन । (ग) स्कैन नियंत्रण स्क्रीन छवि अधिग्रहण के लिए इस्तेमाल किया सेटिंग दिखा । (घ) आर्जिन/2 ५१४ एनएम लेजर लाइन के लिए पिनहोल, डिटेक्टर गेन, एम्पलीफायर ऑफसेट, एम्पलीफायर गेन, और ट्रांसमिशन सेटिंग्स को दर्शाने वाला स्कैन नियंत्रण स्क्रीन । (ङ) समय श्रृंखला नियंत्रण स्क्रीन का उपयोग कर समय सीरीज सेटिंग्स दिखा । (च) ब्लीच नियंत्रण स्क्रीन इस्तेमाल किया prebleach और postbleach मापदंडों दिखा । संक्षिप्तियां: HFT = Haupt फरब Teiler (प्राथमिक द्वि-चरिक बीम अलगानेवाला); NT1 = नेबेन फरब Teiler 1 (प्रथम द्वितीयक द्वि-चक्रीय बीम अलगानेवाला); NT2 = नेबेन फरब Teiler 2 (द्वितीय माध्यमिक द्विचरिक बीम अलगानेवाला); EF = उत्सर्जन फिल्टर । <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59288/59288fig2large.jpg" target="_blank">कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59288/59288fig3.jpg"> चित्रा 3 : एक प्रतिनिधि FRAP प्रयोग के लिए YFP-कच्चे 264.7 कोशिकाओं में ALIS में p62 गतिशीलता का अध्ययन । (क) एक ब्लीच, नियंत्रण, और पृष्ठभूमि रॉय के लिए कच्चे प्रतिदीप्ति तीव्रता डेटा । (ख) ब्लीच और नियंत्रण रॉय के बाद पैनल ए में दिए गए आंकडे़ को पृष्ठभूमि रॉय में प्रतिदीप्ति के लिए ठीक कर दिया गया था । (ग) पृष्ठभूमि-संशोधित नियंत्रण रॉय में प्रतिदीप्ति के लिए ब्लीच रॉय में प्रतिदीप्ति तीव्रता को सामान्य करने के बाद पैनलों ए और बी में दिए गए आंकडे़ । (घ) प्रसामान्यीकृत और पृष्ठभूमि में प्रतिदीप्ति तीव्रता को सामान्य करने के बाद पैनल ए-सी में दिए गए आंकडे़-ब्लीच रॉय में प्रथम 5 ब्लीच मूल्यों के औसत को विरंजित कर दिया गया है । Mf = २१.९७, If = ७८.०३, t1/2 = १२८.२७ s (२.१४ min), और ब्लीच गहराई = ९१.९४ । (ङ) प्रीब्लीच (१.५ मिनट) और postbleach (0, 6, और 16 मिनट) में एक ALIS की एक छवि । स्केल बार = 5 μm और सभी पैनलों के लिए मांय है । संक्षिप: Con = नियंत्रण; BG = पृष्ठभूमि; Corr. = सुधारा; आदर्श. = सामांयीकृत; औसत = average. यह आंकड़ा Cabe एट अल.12से संशोधित किया गया था<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59288/59288fig3large.jpg" target="_blank">कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।</a>
<img alt="Supplementary Video 1" src="/files/ftp_upload/59288/59288supvideo1.jpg"> अनुपूरक वीडियो 1: photoब्लीचिंग के पहले और बाद में एक कच्चे 264.7 मैक्रोफेज में एक ठेठ ALIS । YFP-p62 प्रतिदीप्ति photobleach के बाद ठीक करने के लिए धीमी है; इसलिए, p62 एक बहुत मोबाइल प्रोटीन नहीं है । इस प्रयोग के लिए, Mf = २५.६२, If = ७४.३८, t1/2 = ४४२.७९ s (७.३८ min), और ब्लीच गहराई = ९०.१९ । स्केल बार = 5 μm । इस वीडियो Cabe एट अल.12से संशोधित किया गया था<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59288/Fig_4-Vid_FINAL.avi" target="_blank">कृपया इस वीडियो को देखने के लिए यहां क्लिक करें । (डाउनलोड करने के लिए राइट-क्लिक करें.)</a>

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Fluorescence Recovery after Photobleaching of Yellow Fluorescent Protein Tagged p62 in Aggresome-like Induced Structures

पीले फ्लोरोसेंट प्रोटीन की Photoब्लीचिंग के बाद प्रतिदीप्ति वसूली आक्रामक तरह प्रेरित संरचनाओं में p62 टैग की गईं

हम लाइव कोशिकाओं के साथ photoब्लीचिंग प्रयोगों के बाद प्रतिदीप्ति वसूली के लिए एक व्यापक और व्यावहारिक प्रोटोकॉल का वर्णन. हालांकि प्रोटोकॉल में पीले फ्लोरोसेंट प्रोटीन की गतिशीलता को मापने के लिए इस्तेमाल किया गया था-p62 आक्रामक की तरह प्रेरित संरचनाओं में टैग की गईं, यह माइक्रोस्कोपी प्रणालियों और फ्लोरोसेंट प्रोटीन की एक किस्म के लिए लागू किया जा सकता है ।

Fluorescence recovery after photobleaching (FRAP)&#160;is a microscopy technique that can be used to quantify protein mobility in live cells. In a typical ...

Research

JoVE Journal

Biology

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

कार्बनिक सॉल्वेंट और एसिटिक एसिड के बिना जी 250 Coomassie के साथ जैल में प्रोटीन की धुंधला

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Fluorescent Labeling of Drosophila Heart Structures

Fluorescent Labeling of Drosophila Heart Structures

के फ्लोरोसेंट लेबलिंग ड्रोसोफिला हार्ट संरचनाएं

The Drosophila melanogaster dorsal vessel, or heart, is a tubular structure comprised of a single layer of contractile cardiomyocytes, pericardial cells ...

Measuring Diffusion Coefficients via Two-photon Fluorescence Recovery After Photobleaching

Photobleaching के बाद दो photon प्रतिदीप्ति वसूली के माध्यम से प्रसार Coefficients माप

Multi-fluorescence recovery after photobleaching is a microscopy technique used to measure the diffusion coefficient (or analogous transport parameters) ...

Using the GELFREE 8100 Fractionation System for Molecular Weight-Based Fractionation with Liquid Phase Recovery

आण्विक Fractionation वजन के आधार के लिए तरल चरण रिकवरी के साथ GELFREE 8100 Fractionation प्रणाली का उपयोग

The GELFREE 8100 Fractionation System is a novel protein fractionation system designed to maximize protein recovery during molecular weight based ...

Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection

SiRNA अभिकर्मक के बाद समय चूक सूत्रीविभाजन की इमेजिंग

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and ...

Photobleaching Assays (FRAP &amp; FLIP) to Measure Chromatin Protein Dynamics in Living Embryonic Stem Cells

Photobleaching Assays FRAP & FLIP to Measure Chromatin Protein Dynamics in Living Embryonic Stem Cells

Assays (FRAP और फ्लिप) photobleaching भ्रूण स्टेम कोशिकाओं में रहते हैं chromatin प्रोटीन गतिशीलता उपाय

Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) and Fluorescence Loss In Photobleaching (FLIP) enable the study of protein dynamics in living cells with ...

Determination of Lipid Raft Partitioning of Fluorescently-tagged Probes in Living Cells by Fluorescence Correlation Spectroscopy (FCS)

Determination of Lipid Raft Partitioning of Fluorescently-tagged Probes in Living Cells by Fluorescence Correlation Spectroscopy FCS

लिपिड बेड़ा का दृढ़ संकल्प प्रतिदीप्ति सहसंबंध स्पेक्ट्रोस्कोपी (FCS) के द्वारा जीवित कोशिकाओं में जांच fluorescently टैग की विभाजन

In the past fifteen years the notion that cell membranes are not homogenous and rely on microdomains to exert their functions has become widely accepted. ...

Intravital Microscopy for Imaging Subcellular Structures in Live Mice Expressing Fluorescent Proteins

फ्लोरोसेंट प्रोटीन व्यक्त करते रहते चूहों में इमेजिंग subcellular संरचनाओं के लिए intravital माइक्रोस्कोपी

Here we describe a procedure to image subcellular structures in live rodents that is based on the use of confocal intravital microscopy. As a model organ, ...

Simultaneous Multicolor Imaging of Biological Structures with Fluorescence Photoactivation Localization Microscopy

Localization-based super resolution microscopy can be applied to obtain a spatial map (image) of the distribution of individual fluorescently labeled ...

Protein-protein Interactions Visualized by Bimolecular Fluorescence Complementation in Tobacco Protoplasts and Leaves

तंबाकू protoplasts और पत्तियों में Bimolecular प्रतिदीप्ति complementation द्वारा कल्पना प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत

Many proteins interact transiently with other proteins or are integrated into multi-protein complexes to perform their biological function. Bimolecular ...