Name: fluorescence recovery after photobleaching of yellow fluorescent protein tagged p62 in aggresome-like induced structures
Uploaded: 2019-03-26T14:00:00
Duration: 12 min 58 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Fluorescence Recovery after Photobleaching of Yellow Fluorescent Protein Tagged p62 in Aggresome-like Induced Structures at JoVE.com

Ringraziamo il dottor Seth Robia alla Loyola University Chicago per i suoi preziosi commenti su questo manoscritto. Questo lavoro è stato supportato da NIH grant 1R01NS073967-01A1 a Joanna C. Bakowska.

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	<li>Axelrod, D., Koppel, D. E., Schlessinger, J., Elson, E., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mobility+measurement+by+analysis+of+fluorescence+photobleaching+recovery+kinetics.">Mobility measurement by analysis of fluorescence photobleaching recovery kinetics.</a> Biophysical Journal. 16 (9), 1055-1069 (1976).</li><li>Peters, R., Peters, J., Tews, K. H., Bahr, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microfluorimetric+study+of+translational+diffusion+in+erythrocyte+membranes.">A microfluorimetric study of translational diffusion in erythrocyte membranes.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 367 (3), 282-294 (1974).</li><li>Patterson, G., Day, R. 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Gli autori non hanno alcun conflitto di interessi di divulgare.

Forniamo un protocollo completo, pratico e semplice passo-passo per FRAP esperimenti con cellule vive. Nel presente documento, il protocollo è stato utilizzato per misurare la mobilità di YFP-p62 in ALIS in macrofagi RAW 264.7, ma può essere applicato a molti del microscopio confocale sistemi di scansione laser e geneticamente codificato proteine fluorescenti che sono ora disponibili. Per qualsiasi sistema di microscopia, esperimenti pilota sono fondamentali per determinare i parametri ottimali di FRAP, tra cui acquisizione, candeggina e misure di controllo di ROI, intensità del laser per photobleaching e acquisizione di immagini prebleach e postbleach. È ragionevole aspettarsi che i parametri ottimali di FRAP differiscano per ogni linea di proteine e cellule fluorescente geneticamente codificato.
Fattori importanti da considerare quando un esperimento di FRAP includono (a) raggiungimento adatto candeggina profondità, (b) l'uso di un breve passo d'imbianchimento, postbleach tempo sufficiente (c) che consente di osservare la funzione di recupero con registrazione completa, l'efficienza di photobleaching (d), (e). citotossicità con ripetute FRAP e (f) l'inclusione di un controllo per la perdita di fluorescenza dei ripetuti delle immagini. Si consiglia che la profondità di candeggina, che può essere calcolata secondo l'equazione fornita nella sezione 3.3.1, essere ≥ 9013. Quando la profondità di candeggina è < 90, il grado di recupero postbleach fluorescenza verrà essere sottovalutato e i valori di If, Mfe t1/2 sarà errati. Sebbene la durata e l'intensità degli impulsi laser che inducono candeggina può variare tra FRAP esperimenti, è importante che il passo di photobleaching essere breve e sostanzialmente più veloce rispetto alla funzione di recupero di fluorescenza. Se non è, una quantità significativa di recupero fluorescenza potrebbe verificarsi durante la fase di candeggina. Con un tempo lungo candeggina, recupero di fluorescenza durante la fase di candeggina non sarebbe misurato, e porterebbe a misurazioni errate di If, Mf, et1/2. Inoltre, per ottenere valori corretti per If, M,f, et1/2, l'acquisizione di ROI dovrebbe essere osservato postbleach fino a quando il livello di fluorescenza nella candeggina ROI ha raggiunto un plateau. Ad esempio, nei nostri esperimenti FRAP, non c'era differenza tra I valori di t1/2 , Mfefquando abbiamo osservato fluorescenza YFP-p62 la candeggina ROI per 32,2 min postbleach rispetto a quando abbiamo osservato YFP-p62 la candeggina ROI per postbleach 15,1 min; quindi, abbiamo concluso che la funzione di recupero ha raggiunto un plateau a 15,1 min postbleach12. Per quanto riguarda efficienza photobleaching, photobleaching aumenta con il quadrato del fattore zoom ottico14. Così, l'uso di obiettivi zoom ottici alte è favorevole per photobleaching rapido ma può causare indesiderati photobleaching durante acquisizione; quest'ultimo può essere contabilizzato mediante un controllo ROI di formazione immagine. Photobleaching ripetute deve essere evitata in quanto può portare alla generazione di specie reattive citotossiche dell'ossigeno (ROS). Tuttavia, il grado di generazione di ROS dovuti all'esposizione ad un laser ad alta intensità è inferiore per le proteine fluorescenti geneticamente codificate rispetto per fluorofori chimico (ad es., anticorpi fluorescenti)15, e il ROS generato è più propensi a reagire all'interno della proteina fluorescente codificata geneticamente rispetto con altre molecole in cella4. Oltre la maggiore probabilità di generare ROS citotossici, ripetute photobleaching è da evitarsi in quanto è difficile da controllare. Infine, sebbene la trasmissione laser basso viene utilizzato per acquisire tutte le immagini non-candeggina, alcuni photobleaching invariabilmente si verificherà, che deve essere controllato. Possibili controlli per questo includono monitoraggio fluorescenza in un controllo ROI entro l'acquisizione ROI, ottenendo immagini di controllo in una cella vicina greggia ed esecuzione di esperimenti di controllo con le impostazioni identiche per chi è abituato alla photobleaching esperimenti ma senza l'evento photobleaching.

Recupero di fluorescenza dopo photobleaching (FRAP) è una tecnica di microscopia che può essere utilizzata per quantificare la dinamica di proteine in vivo le cellule1,2. La popolarità di FRAP è aumentata a causa della diffusa disponibilità commerciale di microscopi confocali con alta risoluzione, la velocità e la sensibilità di scansione laser, e un "arcobaleno" di geneticamente codificati proteine fluorescenti, come il verde fluorescente Protein (GFP) e la proteina fluorescente gialla (YFP)3. Le proteine fluorescenti geneticamente codificate sono fusi ad una proteina di interesse per consentire la localizzazione sottocellulare della proteina di interesse. In un tipico esperimento FRAP, la fluorescenza allo steady-state in una regione di acquisizione di interesse (ROI) all'interno di una cella è osservata tramite ripetute immagini di quel ROI con luce laser a bassa intensità. Successivamente, le molecole fluorescenti sono rapidamente e irreversibilmente alterate in un sottoinsieme predefinito dell'acquisizione ROI, appresso denominata la candeggina ROI, da una breve esposizione alla luce laser ad alta intensità. Come nuove proteine non candeggiati ricostituire sbiancati proteine nel corso del tempo, la velocità e l'intensità del recupero di fluorescenza nella candeggina ROI fornisce informazioni sulla proteina mobilità (Figura 1)4.
Il nostro interesse nella determinazione della mobilità dell'ubiquitina associazione proteina p62 (noto anche come sequestosome-1) in aggresome-come le strutture indotte (ALIS) in macrofagi murini RAW 264.7 dopo stimolazione con il lipopolysaccharide (LPS) ci ha portato a rivedere la FRAP letteratura. Purtroppo, molti dei protocolli FRAP esistenti sono incompleti o eccessivamente complesso5,6,7,8,9. Alcuni non forniscono informazioni dettagliate sulle impostazioni di laser, configurazione di percorsi di larghezza e immagine acquisizione parametri5,6,7,8,9. Altri omesso dettagli chiave relative all'analisi di dati, ad esempio come affrontare il problema di candeggina ROI drift6,9 o come calcolare i parametri di recupero importanti, tra cui il mobile frazione (Mf), frazione di immobile (Hof) e metà-tempo di recupero (t½)5,7. Al contrario, gli altri messo troppa enfasi su complesse formule matematiche utilizzate per calcolare Mf, hofe t1/25,6,8,9. Così, il nostro scopo è di fornire un protocollo completo, pratico e semplice passo-passo per FRAP esperimenti con cellule vive.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:835px;" width="835">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium</td>
			<td style="width:211px;">Hyclone</td>
			<td style="width:137px;">SH30022.01</td>
			<td style="width:167px;">High Glucose (4.5 g/L)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Fetal bovine serum</td>
			<td style="width:211px;">Gemini Bio-Products</td>
			<td style="width:137px;">100-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Glass bottom dishes</td>
			<td style="width:211px;">MatTek</td>
			<td style="width:137px;">P35G-1.5-14-C</td>
			<td>35-mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Image J software</td>
			<td style="width:211px;">National Institutes of Health</td>
			<td style="width:137px;">N.A.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Lipopolysaccharide (LPS)</td>
			<td style="width:211px;">Sigma</td>
			<td style="width:137px;">L4391</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Nocodazole</td>
			<td style="width:211px;">Sigma</td>
			<td style="width:137px;">M1404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Penicillin-streptomycin solution</td>
			<td style="width:211px;">Corning</td>
			<td style="width:137px;">30-002-Cl</td>
			<td>100&#215;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Plan-Apochromat 63&#215;/1.40 oil objective</td>
			<td style="width:211px;">Carl Zeiss MicroImaging, Inc</td>
			<td style="width:137px;">4407629904000000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Polyethylenimine (PEI)</td>
			<td style="width:211px;">Polysciences</td>
			<td style="width:137px;">23966-1</td>
			<td>linear (MW 25,000)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">RAW 264.7 murine macrophages</td>
			<td style="width:211px;">ATCC</td>
			<td style="width:137px;">TIB-71</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Zeiss confocal microscope</td>
			<td style="width:211px;">Carl Zeiss MicroImaging, Inc</td>
			<td style="width:137px;">LSM 510</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fluorescence recovery after photobleaching of yellow fluorescent protein tagged p62 in aggresome-like induced structures

Recupero di fluorescenza dopo photobleaching (FRAP) è una tecnica di microscopia che può essere utilizzata per quantificare la mobilità della proteina in cellule vive. In un tipico esperimento FRAP, fluorescenza allo steady-state è osservato da formazione immagine ripetuta con luce laser a bassa intensità. Successivamente, le molecole fluorescenti sono rapidamente e irreversibilmente alterate tramite una breve esposizione alla luce laser ad alta intensità. Informazioni sulla mobilità della proteina sono ottenuti monitorando il recupero della fluorescenza. Abbiamo usato FRAP per determinare la mobilità di p62 in aggresome-come le strutture indotte (ALIS) in macrofagi murini dopo stimolazione con il lipopolysaccharide (LPS). Poiché molti protocolli FRAP esistenti sono incompleti o complesso, il nostro obiettivo era di fornire un protocollo completo, pratico e semplice passo-passo per FRAP esperimenti con cellule vive. Qui, descriviamo la transfezione dei macrofagi RAW 264.7 con giallo fluorescente proteina-p62 (YFP-p62), induzione di ALIS esponendo le cellule a LPS e un metodo passo passo per la raccolta di prebleach e postbleach FRAP immagini e analisi dei dati. Infine, si discute di fattori importanti da considerare quando un esperimento di FRAP.

Qui sono i risultati di un tipico esperimento in cui abbiamo usato FRAP per esaminare il grado di mobilità di p62 in ALIS in cellule RAW 264.7 trattati con LPS per 3-5 h12. Figura 3 A Mostra i dati grezzi ottenuti da una candeggina, controllare e ROI in background dopo lo stack di immagini era stato allineato per correggere per piccole quantità (< ~ 3 µm) della deriva di immagine dell'ALIS. Fluorescenza YFP-p62 in questo ALIS a prebleach e postbleach è mostrato in Figura 3E e complementare Video 1. Figura 3 B Mostra questi dati dopo correzione del fondo. Figura 3 C Mostra questi dati dopo la correzione per fluorescenza nel controllo ROI. Figura 3 D Mostra questi dati normalizzati alla fluorescenza media dei 5 valori prebleach la candeggina ROI. Il grado di sbiancamento era sufficiente in questo esperimento (candeggina profondità = 91,94). YFP-p62 fluorescenza all'interno di questo ALIS ha recuperato lentamente, come t1/2 = 128.27 s (min 2,14). YFP-p62 non era una proteina molto mobile in questo esperimento, come Mf = 21,97 e If = 78,03.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59288/59288fig1.jpg"> Figura 1 : Un diagramma di una cella di RAW 264.7 e passaggi per l'analisi di immagine dopo le immagini FRAP sono state allineate per correggere la deriva di immagine dell'ALIS. (A) diagramma di una cella di RAW 264.7 raffiguranti diversi ALIS e la candeggina, controllo e sfondo ROIs entro l'acquisizione ROI. (B), una rappresentazione idealizzata di FRAP raw dati ottenuti nella candeggina, di controllo e sfondo ROIs nel pannello A. (C) un grafico idealizzato di dati grezzi di FRAP che sono stati corretti di sfondo. (D) un grafico idealizzato di sottofondo-rettificato FRAP dati che sono stati normalizzati a fluorescenza nel controllo ROI. (E) un idealizzato grafico di dati FRAP normalizzati e sfondo-corretti che sono stati normalizzati per la fluorescenza prebleach la candeggina ROI. Abbreviazioni: Con = controllo; BG = sfondo. Questa figura è stata modificata da Rabut ed Ellenberg4. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59288/59288fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59288/59288fig2.jpg"> Figura 2: Immagini dell'interfaccia utente del software AIM (tabella materiali) per selezione laser, fascio percorso configurazione e parametri di acquisizione immagine per gli esperimenti FRAP. Laser (A) controllare la schermata che mostra le linee laser Argon/2, uscita e corrente del tubo utilizzato. (B) configurazione controllo schermo mostrando il fascio splitter ed emissione filtrare le impostazioni utilizzate. (C) scansione di controllo schermo mostrando l'impostazione utilizzata per acquisizione di immagini. (D) scansione di controllo schermo mostrando il foro stenopeico, rivelatore guadagno, amplificatore offset, guadagno dell'amplificatore e le impostazioni di trasmissione per la linea di laser di Argon/2 514 nm. (E) serie di tempo controllo schermo che mostra le impostazioni di serie di tempo utilizzate. Bleach (F) controllo schermo mostrando la prebleach e postbleach i parametri utilizzati. Abbreviazioni: HFT = Haupt Farb Teiler (divisore di fascio dicroico primaria); NT1 = Neben Farb Teiler 1 (divisore di fascio prima secondaria dicroico); NT2 = Neben Farb Teiler 2 (divisore di fascio dicroico secondo secondario); EF = filtro di emissione. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59288/59288fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59288/59288fig3.jpg"> Figura 3 : Un esperimento FRAP rappresentativo per studiare la dinamica di YFP-p62 in ALIS in cellule RAW 264.7. (A) dati di intensità di fluorescenza Raw per un candeggina, controllo e sfondo del ROI. (B) i dati riportati nel pannello A dopo la candeggina e il controllo ROI era stato corretto per la fluorescenza in background ROI. (C) i dati riportati in pannelli A e B dopo normalizzazione l'intensità di fluorescenza nella candeggina ROI al conto per fluorescenza nel controllo sfondo-rettificato ROI. (D) i dati riportati in pannelli A-C dopo normalizzazione l'intensità di fluorescenza nella candeggina normalizzata e sfondo-rettificato ROI alla media dei primi 5 valori prebleach la candeggina ROI. Mf = 21,97, hof = 78.03, t1/2 = 128.27 s (2,14 min) e la candeggina profondità = 91,94. (E), un'immagine di un ALIS presso prebleach (1,5 min) e postbleach (0, 6 e 16 min). Barra della scala = 5 µm ed è valida per tutti i pannelli. Abbreviazioni: Con = controllo; BG = sfondo; Corr. = corretto; Norm. = normalizzato; Medio a = media. Questa figura è stata modificata da Cabe et al.12<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59288/59288fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Supplementary Video 1" src="/files/ftp_upload/59288/59288supvideo1.jpg"> Supplementare Video 1: un tipico ALIS in un RAW 264.7 del macrofago prima e dopo photobleaching. Fluorescenza YFP-p62 è lento a recuperare dopo il photobleach; quindi, p62 non è una proteina molto mobile. Per questo esperimento, Mf = 25,62, hof = 74.38, t1/2 = 442.79 s (7,38 min) e la candeggina profondità = 90,19. Barra della scala = 5 µm. Questo video è stato modificato da Cabe et al.12<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59288/Fig_4-Vid_FINAL.avi" target="_blank">per favore clicca qui per visualizzare questo video. (Tasto destro per scaricare.)</a>

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Fluorescence Recovery after Photobleaching of Yellow Fluorescent Protein Tagged p62 in Aggresome-like Induced Structures

Recupero di fluorescenza dopo Photobleaching di giallo fluorescente proteine Tagged p62 in Aggresome-come le strutture indotta

Descriviamo un protocollo completo e pratico per il recupero di fluorescenza dopo photobleaching esperimenti con cellule vivono. Anche se il protocollo è stato utilizzato per misurare la mobilità di giallo fluorescente proteina-etichetta p62 in aggresome-come le strutture indotte, può essere applicato ad una varietà di sistemi di microscopia e proteine fluorescenti.

Fluorescence recovery after photobleaching (FRAP)&#160;is a microscopy technique that can be used to quantify protein mobility in live cells. In a typical ...

Il recupero della fluorescenza esistente dopo il fotobleaching, i protocolli FRAP, sono incompleti o estroppo complessi. Il protocollo presentato in questo video è significativo in quanto è completo, pratico e diretto. Il principale vantaggio di questa tecnica FRAP è che consente la quantificazione della mobilità proteica all'interno e tra i compartimenti subcellulari nelle cellule vive.La FRAP è allo studio sia a fini terapeutici che diagnostici. Uno di questi usi è quantificare la diffusione all'interno dei sistemi di somministrazione dei farmaci in diversi tessuti in vivo. Queste informazioni possono essere utilizzate per ottimizzare una struttura e una composizione del farmaco.La tecnica di microscopia FRAP ha fornito approfondimenti in un'ampia gamma di campi in cui la comprensione del fenomeno di diffusione è di interesse. Questi includono biologia cellulare e molecolare, biologia dello sviluppo, neuroscienze, scienza dei materiali, biomateriali avanzati e scoperta di farmaci. Sebbene il protocollo descritto sia per l'uso con cellule di mammiferi, i concetti possono essere applicati ad altri sistemi, come cellule vegetali, cellule di lievito e batteri.Un individuo che non ha mai eseguito questa tecnica può avere difficoltà a determinare i parametri ottimali di acquisizione delle immagini, creare una regione di interesse di acquisizione adatta al proprio esperimento e calcolare la frazione mobile e l'intervallo di tempo di recupero. Quando si tenta questa procedura per la prima volta, assicurarsi di eseguire diversi esperimenti pilota per ottimizzare il protocollo nel contesto degli obiettivi dell'esperimento. A dimostrare la procedura saranno Maleen Cabe, un tecnico del mio laboratorio, e David Rademacher, il responsabile della struttura di imaging principale.Per iniziare, preparare una lastra di macrofagi RAW264.7 trasfettato da YFP-p62 e trattarli con lipopolysaccharide come descritto nel protocollo di testo di accompagnamento. Quindi, sciacquare le cellule trattate con il tampone di Tyrode ghiacciato una volta. Quindi, aggiungere due millilitri del tampone del tirolo integrato con Nocodazolo alla piastra e lasciare che le piastre incubano a quattro gradi Celsius per 15-20 minuti prima dell'imaging e dell'analisi FRAP.Lasciare che le piastre incubano a quattro gradi Celsius per 15-20 minuti prima dell'imaging e dell'analisi FRAP. Durante la configurazione dell'imaging, selezionare la linea di 514 nanometri del laser Argon/2, poiché il marcatore di fluorescenza ha un'eccitazione di picco a 512 nanometri e un'emissione di picco a 527 nanometri. Nella finestra Controllo laser fare clic su Argon/2, 458, 477, 488, 514 e quindi sul pulsante Standby.Dopo aver atteso circa tre minuti per il riscaldamento del laser, fare clic sul pulsante On. Quindi impostare la potenza laser del laser sul 100% e premere INVIO. Successivamente, impostare la trasmissione della linea laser sul 5% Al microscopio, rivolgersi all'obiettivo dell'olio ad apertura numerica Plan-Apochromat 63x ingrandimento 1.40.Guarda il campione attraverso l'oculare del microscopio e posiziona una struttura indotta simile a un aggresome al centro del campo visivo. Quindi, nel software di acquisizione, impostare la dimensione del fotogramma su 512 per 512 pixel, la velocità di scansione su otto e la profondità dei dati su 12 Bit. Impostare anche la media di scansione su uno, lo zoom ottico su tre e premere INVIO.Successivamente, se il foro stenopeica a 1,95 unità di errore e il guadagno del rilevatore a 582, che è appena al di sotto della saturazione. Creare un'area di interesse a forma quadrata per l'acquisizione dell'immagine, con dimensioni 150 per 150 pixel. Impostare le serie temporali in modo che l'area di interesse viene scansionata 35 volte, una volta ogni 30 secondi.Quindi, impostare il controllo della candeggina in modo che il fotobleaching avvenga dopo la scansione numero cinque, per raccogliere cinque immagini di prebleach della regione di interesse. Premere INVIO per confermare. Quindi, vai alla finestra Regioni candeggina e crea una regione di interesse della candeggina a forma circolare all'interno dell'area della struttura indotta simile a un aggresome, che ha un diametro di 10 pixel.A questo punto, impostare il numero di iterazioni su 300 e premere nuovamente INVIO. Quindi, impostare la linea laser sul 100% di potenza, immettere 100 nel campo percentuale di trasmissione per il laser e premere INVIO. Infine, esegui il programma di acquisizione di immagini per raccogliere dati FRAP da 10 strutture indotte simili ad aggresome in 10 celle con meno di tre micron di deriva.Per iniziare l'analisi dei dati, trasferire innanzitutto i file AIM lsm su un personal computer per l'analisi dei dati. Correggere la deriva dell'immagine allineando o abbinando la pila di immagini in serie temporali dell'area di interesse di acquisizione aprendo ogni file AIM lsm con un programma di elaborazione delle immagini. Quindi, selezionare Plugin, Registrazione, StackReg e Traduzione, seguito selezionando Plugin, Registrazione, StackReg e quindi Corpo rigido.Successivamente, impostare il gestore della regione di interesse per misurare l'intensità del segnale nella regione di interesse della candeggina. Per questo, selezionare lo strumento ovale, quindi disegnare un cerchio nella regione di interesse della candeggina con un diametro di 10 pixel e quindi fare clic sul pulsante Aggiungi. Una volta aggiunto, impostare il programma per misurare l'intensità del segnale nella regione di controllo di interesse.Selezionare lo strumento rettangolo, quindi disegnare un quadrato di 20 per 20 pixel nell'area del controllo e fare clic sul pulsante Aggiungi. Infine, istituire il gestore della regione di interesse per misurare l'intensità del segnale nella regione di interesse di fondo. Selezionare lo strumento rettangolo, disegnare un quadrato di 20 per 20 pixel nell'area di sfondo e quindi fare clic sul pulsante Aggiungi.Dopo aver aggiunto le aree da analizzare in ROI Manager, rinominarle Bleach ROI, Control ROI e Background ROI, di conseguenza. Misurare l'intensità del segnale in ogni regione. A tale scopo, selezionare ROI candeggina, ROI controllo e ROI in background, quindi passare a Altro e selezionare Multi measure.Incollare i risultati in un foglio di calcolo in colonne etichettate rispettivamente ROI candeggina, ROI controllo e ROI in background. Inizia con lo sfondo correggendo l'intensità del segnale nel ROI candeggina e il ROI del controllo sottraendo i valori nella colonna etichettati ROI sfondo dai valori nella colonna etichettata ROI candeggina e colonna etichettata ROI controllo. Etichettare queste nuove colonne Corretto Bleach ROI e Corretto Control ROI.Successivamente, normalizza il segnale nel ROI Bleach al segnale corretto in background nel ROI di controllo. Dividere i valori nella colonna corretta ROI candeggina per i valori nella colonna con l'etichetta ROI controllo corretto. Etichettare questa nuova colonna, Normalized Corrected Bleach ROI.Quindi, normalizza il segnale nella colonna ROI candeggina corretta normalizzata alla media dei cinque valori di prebleach nel ROI bleach. Dividere i valori nella colonna normalizzato corretto BLEACH ROI per la media dei cinque valori di prebleach nel ROI Candeggina. Etichettare questa nuova colonna, Normalized Corrected Prebleach Average Bleach ROI.Infine, apri un programma per l'elaborazione delle immagini. La curva si adatta ai dati del ROI della candeggina normalizzati e corretti copiando i valori del ROI della candeggina corretti normalizzati postbleach e i corrispondenti valori di tempo. Incollateli nella finestra Ingombro curva (Curve Fitter), selezionate recupero esponenziale (Exponential Recovery) dal menu a discesa Attacco curva (Curve Fitter) e selezionate Adatta (Fit).Ecco un tipico video di recupero della fluorescenza dopo il fotobleaching per le cellule RAW264.7 trattate con LPS. Il recupero della fluorescenza all'interno della regione di interesse della struttura indotta simile a un aggresome è lento. Questo esperimento utilizza il fotobleaching per esaminare il grado di mobilità di p62.p62 fluorescenza nelle strutture indotte simili ad aggresome, prebleach e postbleach, è mostrato qui. Come descritto in questo video, l'intensità della fluorescenza può essere monitorata nel tempo. A seguito della correzione e normalizzazione dello sfondo, la fluorescenza p62 può essere calcolata per descrivere la frazione mobile come 22% la frazione immobile come 78%e descrive l'intervallo di recupero all'interno delle strutture indotte simili ad aggresome, come 2,14 minuti.Ricorda, è particolarmente importante definire correttamente la regione di interesse di acquisizione in modo che includa un ALIS di interesse, una regione di controllo di interesse e una regione di interesse di fondo. Seguendo questa procedura, possono essere applicate altre tecniche quantitative di microscopia fluorescente, come la perdita di fluorescenza nel fotobleaching, FLIP e il fotobleaching selettivo. Mentre FLIP misura il grado di continuità e comunicazione tra i compartimenti subcellulari, il fotobleaching selettivo fornisce informazioni cinetiche sul trasporto attivo e passivo delle proteine negli organelli o tra aree ricche di proteine.FRAP è stato inizialmente sviluppato per quantificare il movimento laterale delle proteine nelle membrane cellulari. Successivamente, è stato utilizzato per quantificare la mobilità proteica all'interno e tra una varietà di compartimenti subcellulari, il che ha spianato la strada ai ricercatori per rispondere alle domande in una varietà di campi, tra cui biologia cellulare e molecolare, biologia dello sviluppo, neuroscienze, scienza dei materiali, biomateriali avanzati e scoperta di farmaci.

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