Name: fluorescence recovery after photobleaching of yellow fluorescent protein tagged p62 in aggresome-like induced structures
Uploaded: 2019-03-26T14:00:00
Duration: 12 min 58 s
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우리는에 대 한 그의 귀중 한 의견이이 원고 Loyola 대학 시카고 박사 세스 Robia을 감사합니다. 이 작품은 NIH 그랜트 1R01NS073967-01A1 조 안 나 C. Bakowska에 의해 지원 되었다.

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	<li>Axelrod, D., Koppel, D. E., Schlessinger, J., Elson, E., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mobility+measurement+by+analysis+of+fluorescence+photobleaching+recovery+kinetics.">Mobility measurement by analysis of fluorescence photobleaching recovery kinetics.</a> Biophysical Journal. 16 (9), 1055-1069 (1976).</li><li>Peters, R., Peters, J., Tews, K. H., Bahr, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microfluorimetric+study+of+translational+diffusion+in+erythrocyte+membranes.">A microfluorimetric study of translational diffusion in erythrocyte membranes.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 367 (3), 282-294 (1974).</li><li>Patterson, G., Day, R. 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(50), e2568 (2011).</li><li>Thevenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+pyramid+approach+to+subpixel+registration+based+on+intensity.">A pyramid approach to subpixel registration based on intensity.</a> IEEE Transactions on Image Processing. 7 (1), 27-41 (1998).</li><li>Ishikawa-Ankerhold, H. C., Ankerhold, R., Drummen, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+fluorescence+microscopy+techniques--FRAP,+FLIP,+FLAP,+FRET+and+FLIM.">Advanced fluorescence microscopy techniques--FRAP, FLIP, FLAP, FRET and FLIM.</a> Molecules. 17 (4), 4047-4132 (2012).</li><li>Cabe, M., Rademacher, D. J., Karlsson, A. B., Cherukuri, S., Bakowska, J. 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W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+molecular+diffusion+in+solution+by+multiphoton+fluorescence+photobleaching+recovery.">Measurement of molecular diffusion in solution by multiphoton fluorescence photobleaching recovery.</a> Biophysical Journal. 77 (5), 2837-2849 (1999).</li><li>Centonze, V., Pawley, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tutorial+on+practical+confocal+microscopy+and+the+use+of+the+confocal+test+specimen.">Tutorial on practical confocal microscopy and the use of the confocal test specimen.</a> Handbook of biological confocal microscopy. , 549-570 (1995).</li><li>Chudakov, D. M., Matz, M. V., Lukyanov, S., Lukyanov, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+proteins+and+their+applications+in+imaging+living+cells+and+tissues.">Fluorescent proteins and their applications in imaging living cells and tissues.</a> Physiological Reviews. 90 (3), 1103-1163 (2010).</li></ol>

저자는 공개 충돌의 관심 있다.

라이브 셀 FRAP 실험, 실용적인 포괄적이 고 간단한 단계별 프로토콜을 제공합니다. 여기, 프로토콜 RAW264.7 세포에 YFP-p62 ALIS에서의 이동성을 측정 하는 데 사용 했다 하지만 레이저 confocal 현미경 시스템을 스캔의 많은에 적용할 수 있는 유전자 인코딩 형광 단백질을 사용할 수 있습니다. 모든 현미경 시스템에 대 한 파일럿 실험이 photobleaching, 및 prebleach 및 postbleach 이미지 수집에 대 한 수집, 표 백제, 및 제어 ROI 크기, 레이저 강도 포함 한 최적의 FRAP 매개 변수를 결정 합니다. 그것은 각 유전자 인코딩된 형광 단백질 및 세포 라인에 대 한 다를 최적의 FRAP 기대 하입니다.
(A) 적합 한 달성 포함 FRAP 실험 실시 때 고려해 야 할 중요 한 요소는 깊이, (b) 간략 한 표백 단계, (c) 수 있도록 충분 한 시간 postbleach 전체 복구 기능, (d) photobleaching 효율성, 관찰의 사용 표 백제 (e). 반복 FRAP와 (f) 반복된 이미징 인해 형광 손실에 대 한 컨트롤의 포함 세포 독성. 3.3.1 섹션에 제공 된 공식에 따르면 산출 될 수 있다, 표 백제 깊이 ≥ 9013수 하는 것이 좋습니다. 때 표 백제 깊이 < 90, postbleach 형광 복구의 정도 과소평가 될 것입니다, 그리고 값의f, Mf, t1/2 것 이다 잘못 될. 기간 및 표 백제 유도 레이저 펄스의 강도 FRAP 실험 사이 다를 수 있습니다, 비록 photobleaching 단계 짧고 형광 복구 기능 보다 실질적으로 더 빠른 것이 중요 하다. 그것은, 상당한 양의 형광 복구 표백 단계 동안 발생할 수 있습니다. 긴 표 백제 시간, 형광 표백 단계에서 복구 하지 측정 것입니다, 그리고 그것은 나의 잘못 된 측정으로 이어질 것 이다f, Mf, 그리고t1/2. 또한,f, Mf, 나에 대 한 올바른 값을 얻을 수 및t1/2, 수집 투자 수익 관찰 해야 postbleach 표 백제 ROI에에서 형광 수준 고원에 도달 했습니다 때까지. 예를 들어 우리의 FRAP 실험에서 때 차이 If, Mf및 t1/2 값 32.2 분에 대 한 투자 수익 표 백제 때 우리가 투자 수익 표 백제 YFP-p62 관찰 대 postbleach의 YFP p62 형광 관찰에 대 한 15.1 분 postbleach; 따라서, 우리는 복구 기능 15.1 분 postbleach12에서 정점에 도달 하는 결론을 내렸다. Photobleaching 효율성, 관련 photobleaching 광학 줌 요인14의 제곱으로 증가 한다. 따라서, 높은 광학 줌 렌즈를 사용 하 여 신속한 photobleaching에 대 한 유리한 이지만; 중 바람직하지 않는 photobleaching 귀 착될 수 있다 후자 수 수 차지 제어 투자 수익을 이미징 하 여. 반복된 photobleaching 세포 독성 반응 산소 종 (ROS)의 발생으로 이어질 수 있습니다 피해 야 하는 것입니다. 그러나, 높은 강도 레이저에 노출으로 인해 선생님 세대의 정도 화학 fluorophores (예를 들어, 형광 항 체)15, 보다 유전자 인코딩된 형광 단백질에 대 한 낮은 그리고 생성 선생님 반응 더 높습니다. 내는 유전자 인코딩된 형광 단백질 보다 셀4에 다른 분자와. 생성 하는 세포 독성 선생님의 증가 가능성, 뿐만 아니라 반복된 photobleaching 그것은 제어 하기 어려운 피할 것입니다. 마지막으로, 낮은 레이저 전송은 모든 비 블리치 이미지 사용, 일부 photobleaching 변함없이 발생 합니다 하지,이 제어 해야 합니다. 이 가능한 컨트롤 포함 수집 투자 수익 내 컨트롤 ROI에에서 형광 모니터링, 이웃 표백된 셀에 컨트롤 이미지 획득 및 그 사용에 대 한 동일한 설정 제어 실험을 수행 합니다 photobleaching 실험 photobleaching 이벤트 없이.

1,2세포를 형광 복구 후 photobleaching (FRAP) 라이브에서 단백질 역동성을 계량 하는 데 사용할 수 있는 현미경 기술 이다. FRAP의 인기와 높은 해상도, 속도, 감도, confocal 현미경 스캐닝 레이저의 광범위 한 상업적인 가용성 때문에 증가 하 고의 "무지개" 유전자 형광 단백질, 형광 녹색 같은 인코딩 단백질 (GFP) 고 노란 형광 성 단백질 (YFP)3. 인코딩된 유전자 형광 성 단백질 관심사의 단백질의 subcellular 지 방화에 대 한 허용 하는 관심사의 단백질에 융합 된다. 전형적인 FRAP 실험에서 관심 (ROI) 셀 내에서 수집 지역에서 정상 형광 낮은 강도 레이저 빛으로 그 투자 수익의 반복된 영상 통해 관찰 됩니다. 그 후, 형광 분자는 신속 하 고 irreversibly 나쁘게 라 함 표 백제 ROI, 고 강도 레이저 광에 짧은 노출에 의해 인수 투자 수익, 미리 정의 된 하위 집합에. 으로 새로운 표백된 단백질 시간이 지남에 표백된 단백질 보충, 형광 표 백제 ROI에에서 복구의 강도와 속도 단백질 이동성 (그림 1)4에 대 한 정보를 제공 합니다.
우리의 관심이 murine RAW264.7 세포에 aggresome 같은 유도 구조 (ALIS)에서 유비퀴틴 바인딩 단백질 p62 (sequestosome 1)의 이동성 lipopolysaccharide (LPS)와 자극 주도하는 FRAP 검토 후 결정 문학입니다. 불행히도, 많은 기존 FRAP 프로토콜의 불완전 하거나 지나치게 복잡 한5,6,7,,89입니다. 일부 레이저 설정, 빔 경로 구성 및 이미지 수집 매개 변수5,6,7,,89에 대 한 자세한 정보를 제공 하지 않습니다. 다른 표 백제 ROI 드리프트6,9 의 문제를 해결 하는 방법 또는 모바일 분수 (Mf), 움직이기 힘 드는 분수를 포함 하 여 중요 한 복구 매개 변수를 계산 하는 방법 등의 데이터 분석에 관한 주요 내용 생략 (나f), 그리고 복구 (t½)5,7의 하프 타임. 반대로, 다른 Mf, 계산 하는 데 사용 하는 복잡 한 수학 공식에 너무 많은 중점을 배치 나f및 t1/25,6,,89. 따라서, 우리의 목적은 라이브 셀 FRAP 실험에 대 한 포괄적인, 실용적인, 그리고 간단한 단계별 프로토콜을 제공 하는 것 이다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:835px;" width="835">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium</td>
			<td style="width:211px;">Hyclone</td>
			<td style="width:137px;">SH30022.01</td>
			<td style="width:167px;">High Glucose (4.5 g/L)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Fetal bovine serum</td>
			<td style="width:211px;">Gemini Bio-Products</td>
			<td style="width:137px;">100-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Glass bottom dishes</td>
			<td style="width:211px;">MatTek</td>
			<td style="width:137px;">P35G-1.5-14-C</td>
			<td>35-mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Image J software</td>
			<td style="width:211px;">National Institutes of Health</td>
			<td style="width:137px;">N.A.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Lipopolysaccharide (LPS)</td>
			<td style="width:211px;">Sigma</td>
			<td style="width:137px;">L4391</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Nocodazole</td>
			<td style="width:211px;">Sigma</td>
			<td style="width:137px;">M1404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Penicillin-streptomycin solution</td>
			<td style="width:211px;">Corning</td>
			<td style="width:137px;">30-002-Cl</td>
			<td>100&#215;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Plan-Apochromat 63&#215;/1.40 oil objective</td>
			<td style="width:211px;">Carl Zeiss MicroImaging, Inc</td>
			<td style="width:137px;">4407629904000000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Polyethylenimine (PEI)</td>
			<td style="width:211px;">Polysciences</td>
			<td style="width:137px;">23966-1</td>
			<td>linear (MW 25,000)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">RAW 264.7 murine macrophages</td>
			<td style="width:211px;">ATCC</td>
			<td style="width:137px;">TIB-71</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Zeiss confocal microscope</td>
			<td style="width:211px;">Carl Zeiss MicroImaging, Inc</td>
			<td style="width:137px;">LSM 510</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fluorescence recovery after photobleaching of yellow fluorescent protein tagged p62 in aggresome-like induced structures

Photobleaching (FRAP) 후 형광 복구 라이브 세포에서 단백질 이동성을 계량 하는 데 사용할 수 있는 현미경 기술 이다. 전형적인 FRAP 실험에서 정상 형광 반복된 이미징 낮은 강도 레이저 빛에 의해 관찰 된다. 그 후, 형광 분자는 고 강도 레이저 광에 짧은 노출을 통해 신속 하 고 irreversibly 장애인. 단백질 이동성에 대 한 정보는 형광의 복구를 모니터링 하 여 얻어진 다. 우리 사용 FRAP lipopolysaccharide (LPS)와 자극 후 p62 murine 세포에 aggresome 같은 유도 구조 (ALIS)에서 이동성을 확인 합니다. 많은 기존 FRAP 프로토콜 불완전 하거나 복잡 한 때문에, 우리의 목표 FRAP 실험 라이브 셀을 위한 포괄적인, 실용적인, 그리고 간단한 단계별 프로토콜을 제공 했다. 여기, 우리 RAW264.7 macrophage transfection 노란 형광 성 단백질-p62 (YFP-p62), 유도 ALIS의 LPS와 prebleach 및 postbleach FRAP 이미지 및 데이터 분석을 수집 하기 위한 단계적인 방법 셀을 노출 하 여 함께 설명 합니다. 마지막으로, 우리는 FRAP 실험을 실시 하는 때 고려해 야 할 중요 한 요소 토론.

여기는 우리가 사용 FRAP p62 LPS와 RAW264.7 세포 치료에 ALIS에 3-5 h12의 이동성의 정도 검사 하는 일반적인 실험의 결과입니다. 그림 3 A 표시는 표 백제에서 얻은 원시 데이터 및 제어, 이미지의 스택 작은 금액에 대 한 올바른 정렬 했다 후 ROI를 배경 (< ~ 3 µ m)는 ALIS의 이미지의. Prebleach와 postbleach이이 ALIS에 YFP p62 형광 그림 3E 와 보조 비디오 1에 표시 됩니다. 그림 3 B 배경 보정 후 이러한 데이터를 보여줍니다. 그림 3 C 형광 제어 투자 수익에에서 대 한 수정 후 이러한 데이터를 보여줍니다. 그림 3 D 투자 수익 표 백제에서 5 prebleach 값의 평균 형광으로 정규화이 데이터를 보여줍니다. 표백의 학위는이 실험에 충분 한 (깊이 블리치 91.94 =). 이 ALIS 내 YFP p62 형광 복구 천천히, t1/2 = 128.27 s (2.14 분). YFP p62 아니었다이 실험에서 매우 모바일 단백질 Mf = 21.97 나f 78.03 =.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59288/59288fig1.jpg"> 그림 1 : RAW264.7 세포 및 FRAP 이미지는 ALIS의 이미지 드리프트에 대 한 올바른 정렬 되었습니다 후 이미지 분석을 위한 단계 다이어그램. (A) 여러 ALIS 표 백제, 제어, 및 수집 투자 수익 내 배경 ROIs 묘사 RAW264.7 세포의 다이어그램. (B) 원시 FRAP의 이상 화 한 묘사 데이터 얻을 표 백제, 제어, 및 배경 ROIs 패널 A. (C)에서 배경 수정 되었습니다 원시 FRAP 데이터의 이상적인된 그래프. (D) 배경 수정 FRAP 제어 ROI에에서 형광으로 정규화 된 데이터의 이상적인된 그래프. (E)는 이상적인된 그래프 정규화 및 배경 수정 FRAP 데이터를 표 백제 투자 수익에에서 prebleach 형광으로 정규화 되었습니다. 약어: 콘 컨트롤; = BG 배경 =. 이 그림은 Rabut 및 Ellenberg4에서 수정 되었습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59288/59288fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59288/59288fig2.jpg"> 그림 2: 레이저 선택 AIM 소프트웨어 (자료 테이블)에서 사용자 인터페이스의 이미지 경로 구성 및 FRAP 실험에 대 한 이미지 수집 매개 변수 빔. (A) 레이저 아르곤/2 레이저 라인, 출력, 및 사용 하는 관 전류를 보여주는 화면을 제어. (B) 구성 제어 화면 빔 스플리터 및 방출 필터 설정 사용. (C) 스캔 화면 이미지 취득에 사용 하는 설정을 제어 합니다. (D) 스캔 화면 pinhole, 감지기 이득, 오프셋 증폭기, 증폭기 이득, 및 아르곤/2 514 nm 레이저 라인에 대 한 전송 설정을 제어 합니다. (E) 시계열 사용 시간 시리즈 설정을 보여주는 화면을 제어. (F) 표 백제는 prebleach를 보여주는 화면을 제어 하 고 사용 된 매개 변수를 postbleach. 약어: HFT Haupt Farb Teiler (기본 dichroic beam splitter); = NT1 = Neben Farb Teiler 1 (첫 번째 보조 dichroic 광속 쪼개는 도구); NT2 = Neben Farb Teiler 2 (두 번째 보조 dichroic 빔 스플리터); EF = 방출 필터. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59288/59288fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59288/59288fig3.jpg"> 그림 3 : RAW264.7 세포에 ALIS YFP p62 역학을 연구 하는 대표적인 FRAP 실험. (A) 표 백제, 제어, 및 배경 투자 수익에 대 한 원시 형광 강도 데이터입니다. (B) 데이터 패널 A에에서 주어진 후에 표 백제 및 제어 ROI ROI 배경에서 형광에 대 한 수정 되었습니다 했다. (C) 형광 배경-수정 제어 투자 수익에에서 대 한 계정에 표 백제 ROI의 형광 강도 정상화 후 패널 A와 B에에서 주어진 데이터. (D) 패널 A C에에서 정규화 및 배경 수정 표 백제 투자 수익 투자 수익 표 백제에서 처음 5 prebleach 값의 평균을의 형광 강도 정상화 후 주어진 데이터. Mf = 21.97, 난f 78.03, t1/2 = 128.27 = s (2.14 분), 그리고 표 백제 깊이 91.94 =. (E) prebleach (1.5 분)와 postbleach ALIS의 이미지 (0, 6, 및 16 분). 눈금 막대 = 5 µ m 이며 모든 패널에 대해 유효. 약어: 콘 컨트롤; = BG = 배경; Corr. = 수정; 규범입니다. = 정규화. 평균 = 평균. 이 그림에서 Cabe 외.12수정 된<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59288/59288fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Supplementary Video 1" src="/files/ftp_upload/59288/59288supvideo1.jpg"> 보충 비디오 1: photobleaching 전후 RAW264.7 macrophage에 전형적인 ALIS. YFP p62 형광 photobleach; 후 복구 하는 따라서, p62 매우 모바일 단백질 아니다. 이 실험, Mf = 25.62, 난f 74.38, t1/2 = 442.79 = s (7.38 분), 그리고 표 백제 깊이 = 90.19. 눈금 막대 5 µ m를 =. 이 비디오 수정 되었습니다 Cabe 외12<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59288/Fig_4-Vid_FINAL.avi" target="_blank">하시기 바랍니다 여기를 클릭이이 비디오를 볼. (다운로드 오른쪽 클릭.)</a>

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Fluorescence Recovery after Photobleaching of Yellow Fluorescent Protein Tagged p62 in Aggresome-like Induced Structures

Aggresome 같은 유도 구조에서 Photobleaching의 황색 형광 단백질 태그 p62 후 형광 복구

우리는 photobleaching 실험 라이브 셀 후 형광 복구에 대 한 포괄적이 고 실용적인 프로토콜을 설명 합니다. 프로토콜은 aggresome 같은 유발된 구조에 노란색 형광 단백질 태그 p62의 이동성 측정 하는 데 사용 됩니다, 하지만 그것은 현미경 시스템 및 형광 단백질의 다양 한에 적용할 수 있습니다.

Fluorescence recovery after photobleaching (FRAP)&#160;is a microscopy technique that can be used to quantify protein mobility in live cells. In a typical ...

광표백 후 기존의 형광 복구, FRAP 프로토콜은 불완전하거나 지나치게 복잡합니다. 이 비디오에 제시된 프로토콜은 포괄적이고 실용적이며 간단하다는 점에서 중요합니다. 이 FRAP 기술의 주요 장점은 살아있는 세포내및 세포체 구획 사이의 단백질 이동성의 정량화를 허용한다는 것입니다.FRAP는 치료 및 진단 목적으로 모두 연구되고 있습니다. 이러한 용도 중 하나는 생체 내의 다른 조직에서 약물 전달 시스템 내의 확산을 정량화하는 것입니다. 이 정보는 약물 구조 및 조성을 최적화하는 데 사용할 수 있습니다.FRAP 현미경 기술은 확산 현상을 이해하는 것이 관심있는 필드의 넓은 범위에 있는 통찰력을 제공했습니다. 여기에는 세포 및 분자 생물학, 발달 생물학, 신경 과학, 재료 과학, 고급 생체 재료 및 약물 발견이 포함됩니다. 설명된 프로토콜은 포유류 세포와 함께 사용하기 위한 것이지만, 개념은 식물 세포, 효모 세포 및 박테리아와 같은 다른 시스템에 적용될 수 있다.이 기술을 수행한 적이 없는 개인은 최적의 이미지 획득 매개 변수를 결정하고 실험에 적합한 관심 획득 영역을 만들고 모바일 분획 및 복구 하프타임을 계산하는 데 어려움을 겪을 수 있습니다. 이 절차를 처음 시도할 때는 실험 목표의 맥락에서 프로토콜을 최적화하기 위해 여러 파일럿 실험을 수행해야 합니다. 절차를 시연하는 것은 내 실험실의 기술자 인 말렌 카베와 핵심 이미징 시설 관리자 인 데이비드 라데마허 (David Rademacher)가 될 것입니다.시작하려면, YFP-p62 의 플레이트를 전자 로264.7 대식세포로 준비하고, 동반 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 Lipopolysaccharide로 치료한다. 다음으로, 처리된 세포를 얼음 차가운 티로드의 버퍼로 한 번 헹구는 다. 그런 다음, 접시에 노코다졸 보충 티로의 버퍼의 두 밀리리터를 추가하고, FRAP 이미징 및 분석 전에 15 ~20 분 동안 4 섭씨에서 배양 플레이트를 허용합니다.FRAP 이미징 및 분석 전에 플레이트가 섭씨 4도에서 15~20분 동안 배양하도록 허용합니다. 이미징 설정에서 형광 마커가 512 나노미터에서 피크 흥분을 가지고 527 나노미터에서 최대 방출을 하므로 Argon/2 레이저의 514 나노미터 라인을 선택하십시오. 다음으로 레이저 제어 창에서 Argon/2, 458, 477, 488, 514를 클릭한 다음 대기 버튼을 클릭합니다.레이저가 따뜻해지도록 약 3분을 기다린 후 On 버튼을 클릭합니다. 그런 다음 레이저의 레이저 전력을 100 %로 설정하고 Enter를 누릅니다. 다음으로, 레이저 라인의 전송을 현미경으로 5%로 설정하고, 계획-아포크로마트 63x 배율 1.40 숫자 조리개 오일 목표를 설정한다.현미경 접실을 통해 표본을 보고 시야의 중앙에 아그리솜과 같은 유도된 구조를 놓습니다. 그런 다음, 인수 소프트웨어에서 프레임 크기를 512 x 512 픽셀로 설정하고 스캔 속도를 8픽셀로 설정하고 데이터 깊이를 12비트로 설정합니다. 또한 스캔 평균을 1로 설정하고 광학 줌을 3으로 설정하고 Enter를 누릅니다.다음으로 핀홀을 1.95 오차 단위로 세이고 검출기게는 582로 증가하여 채도 바로 아래에 있습니다. 크기 150 x 150 픽셀을 사용하는 이미지 수집에 대한 사각형 모양의 관심 영역을 만듭니다. 관심 영역을 30초마다 한 번씩 35번 스캔할 수 있도록 타임시리즈를 설정합니다.이어서, 5번 스캔 후 광표백이 발생되도록 표백제 제어를 설정하고, 관심 영역의 5개의 프리블리치 영상을 수집한다. Enter 키를 눌러 확인합니다. 다음으로, 표백제 영역 창으로 이동하여 직경이 10픽셀인 응집형 유도 구조 영역 내에서 관심 있는 원형 형 표백제 영역을 만듭니다.이제 반복 수를 300개로 설정하고 Enter 키를 다시 누릅니다. 그런 다음 레이저 라인을 100%의 전력으로 설정하고 레이저의 전송 퍼센트 필드에 100을 입력하고 Enter를 누릅니다. 마지막으로, 이미지 수집 프로그램을 실행하여 10개의 아그리솜 유도 구조로부터 10개의 개스미크론 미만의 드리프트를 수집합니다.데이터 분석을 시작하려면 먼저 AIM lsm 파일을 개인용 컴퓨터로 전송하여 데이터 분석을 시작하십시오. 이미지 처리 프로그램과 각 AIM lsm 파일을 열어 관심 영역의 타임시리즈 이미지를 정렬하거나 일치시켜 이미지 드리프트에 적합합니다. 그런 다음 플러그인, 등록, StackReg 및 번역을 선택한 다음 플러그인, 등록, StackReg 및 강체를 선택합니다.다음으로, 관심 있는 지역의 신호 강도를 측정하기 위해 관심 관리자 영역을 설정합니다. 이를 위해 타원형 도구를 선택한 다음 직경 10픽셀의 표백제 영역에 원을 그린 다음 추가 단추를 클릭합니다. 추가되면 관심 제어 영역에서 신호 강도를 측정하기 위해 프로그램을 설정합니다.사각형 도구를 선택한 다음 컨트롤 영역에서 20x20픽셀의 정사각형을 그린 다음 추가 단추를 클릭합니다. 마지막으로 관심 영역의 신호 강도를 측정하기 위해 관심 관리자 영역을 설정합니다. 사각형 도구를 선택하고 백그라운드 영역에서 20x20픽셀의 정사각형을 그린 다음 추가 단추를 클릭합니다.ROI 관리자에서 분석할 영역을 추가한 후 표백제 ROI, 제어 ROI 및 배경 ROI의 이름을 변경합니다. 각 영역에서 신호 강도를 측정합니다. 이를 수행하려면 표백제 ROI, 제어 ROI 및 배경 ROI를 선택한 다음 더 많은 것으로 이동한 다음 다중 측정값을 선택합니다.결과를 스프레드시트에 블리치 ROI, 제어 ROI 및 배경 ROI라고 표시된 열에 각각 붙여 넣습니다. 표백제 ROI 및 제어 ROI의 신호 강도를 백그라운드로 수정하여 배경 으로 표시된 열의 값에서 배경 ROI로 레이블이 지정된 컬럼의 값과 표지된 컨트롤 ROI의 값에서 구색을 뺍니다. 이 새로운 열에 레이블을 지정하여 표백제 ROI를 수정하고 보정된 제어 ROI를 수정했습니다.다음으로, 표백제 ROI의 신호를 제어 ROI에서 배경 보정 신호로 정규화한다. 보정된 표백제 ROI라고 표시된 열의 값을 보정된 제어 ROI라는 열의 값으로 나눕니다. 이 새 열에 레이블을 지정, 정규화 된 표백제 ROI.그런 다음, 정규화된 표백제 ROI 컬럼의 신호를 표백제 ROI의 5개의 프리블리치 값의 평균으로 정규화한다. 정규화된 표백제 ROI라고 표시된 열의 값을 표백제 ROI의 5개 프리블리치 값의 평균으로 나눕니다. 이 새 열에 레이블을 지정, 정규화 된 정표백 전 표백제 평균 표백제 ROI.마지막으로 이미지 처리를 위한 프로그램을 엽니다. 커브는 표백제 후 정규화된 표백제 ROI 값과 해당 시간 값을 복사하여 정규화 및 수정된 표백제 ROI 데이터에 맞습니다. 커브 피터 창에 붙여넣고 곡선 피터 드롭다운 메뉴에서 기하급수적 복구를 선택하고 맞춤을 선택합니다.여기에 LPS로 처리된 RAW264.7 세포에 대한 광표백 후 형광 회복의 전형적인 비디오입니다. 응집과 같은 유도된 구조 영역 내의 형광 회복은 느리다. 이 실험은 포토표백을 사용하여 p62의 이동성 정도를 검사합니다.접합과 유사한 유도 된 구조, 프리 블리치 및 포스트 표백제에서 p62 형광은 여기에 도시된다. 이 비디오에 설명된 바와 같이, 형광 강도는 시간이 지남에 따라 추적될 수 있다. 배경 보정 및 정규화에 따라 p62 형광은 이동 분획을 78%로 22%로 설명하기 위해 계산할 수 있으며, 2.14분으로 응집형 유도 구조 내에서 회복의 하프타임을 설명한다.관심 있는 ALIS, 관심 영역 및 관심 영역을 포함하도록 관심 획득 영역을 적절하게 정의하는 것이 특히 중요합니다. 이 절차에 이어, 광표백, 플립 및 선택적 광표백에서형손실과 같은 다른 정량형 형광 현미경 기술이 적용될 수 있다. FLIP는 세포전구 간 연속성과 통신 정도를 측정하는 반면, 선택적 광표백은 단백질을 세포기관으로 활성 및 수동적으로 운반하는 운동 정보를 제공하거나 단백질이 풍부한 영역 간을 제공합니다.FRAP는 세포막에 있는 단백질의 측면 운동을 정량화하기 위하여 처음에 개발되었습니다. 그 후, 세포 및 분자 생물학, 발달 생물학, 신경 과학, 물질 과학, 고급 생체 재료 및 약물 발견을 포함한 다양한 분야에서 연구원이 질문에 대답할 수있는 길을 열어 준 다양한 세포 형구 안팎의 단백질 이동성을 정량화하는 데 사용되었습니다.

Research

JoVE Journal

Biology

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

유기 용매 및 초산없이 쿠매시 G - 250로 젤의 단백질 염색법

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

연구

생물학

Fluorescent Labeling of Drosophila Heart Structures

Fluorescent Labeling of Drosophila Heart Structures

의 형광 라벨링 Drosophila 심장 구조

The Drosophila melanogaster dorsal vessel, or heart, is a tubular structure comprised of a single layer of contractile cardiomyocytes, pericardial cells ...

Measuring Diffusion Coefficients via Two-photon Fluorescence Recovery After Photobleaching

Photobleaching 후 두 광자 형광 복구를 통해 확산 계수 측정

Multi-fluorescence recovery after photobleaching is a microscopy technique used to measure the diffusion coefficient (or analogous transport parameters) ...

Using the GELFREE 8100 Fractionation System for Molecular Weight-Based Fractionation with Liquid Phase Recovery

액상 복구와 분자량 기반 분류에 대한 GELFREE 8100 분획화 시스템을 사용하여

The GELFREE 8100 Fractionation System is a novel protein fractionation system designed to maximize protein recovery during molecular weight based ...

Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection

siRNA Transfection 후의 유사 분열의 시간 저속 영상

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and ...

Photobleaching Assays (FRAP &amp; FLIP) to Measure Chromatin Protein Dynamics in Living Embryonic Stem Cells

Photobleaching Assays FRAP & FLIP to Measure Chromatin Protein Dynamics in Living Embryonic Stem Cells

배아 줄기 세포 생활에서 염색질 단백질 역학을 측정하는 Assays (FRAP 및 플립)를 Photobleaching

Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) and Fluorescence Loss In Photobleaching (FLIP) enable the study of protein dynamics in living cells with ...

Determination of Lipid Raft Partitioning of Fluorescently-tagged Probes in Living Cells by Fluorescence Correlation Spectroscopy (FCS)

Determination of Lipid Raft Partitioning of Fluorescently-tagged Probes in Living Cells by Fluorescence Correlation Spectroscopy FCS

지질 뗏목의 결정은 형광 상관 분광학 (FCS)에 의해 살아있는 세포에서 Fluorescently 태그가 추가된 프로브의 파티션

In the past fifteen years the notion that cell membranes are not homogenous and rely on microdomains to exert their functions has become widely accepted. ...

Intravital Microscopy for Imaging Subcellular Structures in Live Mice Expressing Fluorescent Proteins

형광 단백질을 표현 라이브 마우스의 이미징 세포 이하의 구조물의 intravital 현미경

Here we describe a procedure to image subcellular structures in live rodents that is based on the use of confocal intravital microscopy. As a model organ, ...

Simultaneous Multicolor Imaging of Biological Structures with Fluorescence Photoactivation Localization Microscopy

Localization-based super resolution microscopy can be applied to obtain a spatial map (image) of the distribution of individual fluorescently labeled ...

Protein-protein Interactions Visualized by Bimolecular Fluorescence Complementation in Tobacco Protoplasts and Leaves

담배 원형질체 및 잎에 이분자 형광 보완에 의해 시각 단백질 - 단백질 상호 작용

Many proteins interact transiently with other proteins or are integrated into multi-protein complexes to perform their biological function. Bimolecular ...