Name: fluorescence recovery after photobleaching of yellow fluorescent protein tagged p62 in aggresome-like induced structures
Uploaded: 2019-03-26T14:00:00
Duration: 12 min 58 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Fluorescence Recovery after Photobleaching of Yellow Fluorescent Protein Tagged p62 in Aggresome-like Induced Structures at JoVE.com

Vi takker Dr. Seth Robia ved Loyola University Chicago for hans verdifulle kommentarer på dette manuskriptet. Dette arbeidet ble støttet av NIH grant 1R01NS073967-01A1 til Joanna C. Bakowska.

<ol>
	<li>Axelrod, D., Koppel, D. E., Schlessinger, J., Elson, E., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mobility+measurement+by+analysis+of+fluorescence+photobleaching+recovery+kinetics.">Mobility measurement by analysis of fluorescence photobleaching recovery kinetics.</a> Biophysical Journal. 16 (9), 1055-1069 (1976).</li><li>Peters, R., Peters, J., Tews, K. H., Bahr, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microfluorimetric+study+of+translational+diffusion+in+erythrocyte+membranes.">A microfluorimetric study of translational diffusion in erythrocyte membranes.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 367 (3), 282-294 (1974).</li><li>Patterson, G., Day, R. N., Piston, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+protein+spectra.">Fluorescent protein spectra.</a> Journal of Cell Science. 114, 837-838 (2001).</li><li>Rabut, G., Ellenberg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photobleaching+techniques+to+study+mobility+and+molecular+dynamics+of+proteins+in+live+cells:+FRAP,+iFRAP,+and+FLIP.">Photobleaching techniques to study mobility and molecular dynamics of proteins in live cells: FRAP, iFRAP, and FLIP.</a> Live Cell Imaging: A Laboratory Manual (1st ed). , 101-126 (2004).</li><li>Fritzsche, M., Charras, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+protein+reaction+dynamics+in+living+cells+by+fluorescence+recovery+after+photobleaching.">Dissecting protein reaction dynamics in living cells by fluorescence recovery after photobleaching.</a> Nature Protocols. 10 (5), 660-680 (2015).</li><li>Goodwin, J. S., Kentworthy, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photobleaching+approaches+to+investigate+diffusional+mobility+and+trafficking+of+Ras+in+living+cells.">Photobleaching approaches to investigate diffusional mobility and trafficking of Ras in living cells.</a> Methods. 37 (2), 154-164 (2005).</li><li>Hildick, K. L., Gonz&#224;lez-Gonz&#224;lez, I. M., Jaskolski, F., Henley, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lateral+diffusion+and+exocytosis+of+membrane+proteins+in+cultured+neurons+assessed+using+fluorescence+recovery+and+fluorescence-loss+photobleaching.">Lateral diffusion and exocytosis of membrane proteins in cultured neurons assessed using fluorescence recovery and fluorescence-loss photobleaching.</a> Journal of Visualized Experiments. (60), e3747 (2012).</li><li>Nissim-Rafinia, M., Meshorer, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photobleaching+assays+(FRAP+&amp;+FLIP)+to+measure+chromatin+protein+dynamics+in+living+embryonic+stem+cells.">Photobleaching assays (FRAP &amp; FLIP) to measure chromatin protein dynamics in living embryonic stem cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (52), e2696 (2011).</li><li>Zheng, C., Petralia, R. S., Wang, Y., Kachar, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+recovery+after+photobleaching+(FRAP)+of+fluorescence+tagged+proteins+in+dendritic+spines+of+cultured+hippocampal+neurons.">Fluorescence recovery after photobleaching (FRAP) of fluorescence tagged proteins in dendritic spines of cultured hippocampal neurons.</a> Journal of Visualized Experiments. (50), e2568 (2011).</li><li>Thevenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+pyramid+approach+to+subpixel+registration+based+on+intensity.">A pyramid approach to subpixel registration based on intensity.</a> IEEE Transactions on Image Processing. 7 (1), 27-41 (1998).</li><li>Ishikawa-Ankerhold, H. C., Ankerhold, R., Drummen, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+fluorescence+microscopy+techniques--FRAP,+FLIP,+FLAP,+FRET+and+FLIM.">Advanced fluorescence microscopy techniques--FRAP, FLIP, FLAP, FRET and FLIM.</a> Molecules. 17 (4), 4047-4132 (2012).</li><li>Cabe, M., Rademacher, D. J., Karlsson, A. B., Cherukuri, S., Bakowska, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PB1+and+UBA+domains+of+p62+are+essential+for+aggresome-like+induced+structure+formation.">PB1 and UBA domains of p62 are essential for aggresome-like induced structure formation.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 503 (4), 2306-2311 (2018).</li><li>Brown, E. B., Wu, E. S., Zipfel, W., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+molecular+diffusion+in+solution+by+multiphoton+fluorescence+photobleaching+recovery.">Measurement of molecular diffusion in solution by multiphoton fluorescence photobleaching recovery.</a> Biophysical Journal. 77 (5), 2837-2849 (1999).</li><li>Centonze, V., Pawley, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tutorial+on+practical+confocal+microscopy+and+the+use+of+the+confocal+test+specimen.">Tutorial on practical confocal microscopy and the use of the confocal test specimen.</a> Handbook of biological confocal microscopy. , 549-570 (1995).</li><li>Chudakov, D. M., Matz, M. V., Lukyanov, S., Lukyanov, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+proteins+and+their+applications+in+imaging+living+cells+and+tissues.">Fluorescent proteins and their applications in imaging living cells and tissues.</a> Physiological Reviews. 90 (3), 1103-1163 (2010).</li></ol>

Forfatterne har noen interessekonflikt avsløre.

Vi gir en omfattende, praktisk og enkel trinnvise protokoll for FRAP eksperimenter med levende celler. Her, protokollen ble brukt til å måle mobilitet av YFP-p62 innenfor ALIS i RAW264.7 makrofager, men det kan brukes til mange av laser skanning AC confocal mikroskop systemer og genetisk kodet fluorescerende proteiner som er nå tilgjengelig. For alle mikroskopi system er piloten eksperimenter kritiske for å bestemme optimale FRAP parametere, inkludert kjøp, blekemiddel og kontroll ROI størrelser, laser intensitet for photobleaching, og prebleach og postbleach bilde. Det er rimelig å forvente parameterne for optimal FRAP forskjellig for hver genetisk kodet fluorescerende protein og cellen linje.
Viktigste faktorene når gjennomfører en FRAP eksperiment omfatter (a) oppnå egnet blekemiddel dybde, (b) bruk av et kort bleking skritt (c) tillater nok tid postbleach å observere full gjenoppretting funksjon, (d) photobleaching effektivitet, (e). cytotoksisitet med gjentatte FRAP, og (f) inkludering av en kontroll for fluorescens tap på grunn av gjentatte bildebehandling. Vi anbefaler at blekemiddel dybde, som kan beregnes i henhold til formelen i punkt 3.3.1, ≥9013. Når blekemiddel dybde er < 90, graden av postbleach fluorescens utvinning vil undervurderes, og verdiene av jegf, Mfog t1/2 vil være feil. Selv om varigheten og intensiteten av blekemiddel-inducing laser pulser kan variere mellom FRAP eksperimenter, er det viktig at photobleaching trinnet være kort og betydelig raskere enn funksjonen fluorescens utvinning. Hvis ikke kan en betydelig mengde fluorescens utvinning oppstå under bleking trinnet. Med en lang blekemiddel, fluorescens utvinning under bleking trinnet skulle ikke måles, og det vil føre til feil målinger av jegf, Mf, ogt1/2. I tillegg til få riktige verdier for jegf, Mf, ogt1/2, oppkjøpet ROI observeres postbleach til fluorescens nivået i blekemiddel Avkastningen har nådd et platå. For eksempel i våre FRAP eksperimenter, det var ingen forskjell mellom If, Mfog t1/2 verdier når vi observert YFP-p62 fluorescens i blekemiddel avkastning i 32.2 min postbleach versus når vi observert YFP-p62 i blekemiddel avkastning for 15,1 min postbleach; Derfor vi konkluderte med at utvinning funksjonen nådd et platå på 15,1 min postbleach12. Med hensyn til photobleaching effektivitet øker photobleaching med kvadratet av optisk zoom faktor14. Dermed bruk av høy optisk zoom objektiver er gunstig for rask photobleaching, men kan resultere i uønskede photobleaching under oppkjøpet; sistnevnte kan forklares av imaging en kontroll avkastning. Gjentatte photobleaching er unngås siden det kan føre til generering av cytotoksiske reaktive oksygen arter (ROS). Men graden av ROS generasjon skyldes eksponering for en høy intensitet laser er lavere for genetisk kodet fluorescerende proteiner enn kjemiske fluorophores (f.eks fluorescerende antistoffer)15og ROS generert er mer sannsynlig å reagere innen genetisk kodet fluorescerende protein enn med andre molekyler i cellen4. Økt sannsynlighet for å generere cytotoksiske ROS er gjentatt photobleaching unngås som det er vanskelig å kontrollere. Til slutt, selv om lavt laser overføring brukes til å hente alle ikke-blekemiddel bilder, noen photobleaching alltid skjer, som må kontrolleres. Mulig for dette omfatter overvåking fluorescens i en kontroll avkastning i oppkjøpet avkastning, få kontroll bilder i en nærliggende ubleket celle og utføre kontroll eksperimenter med identiske innstillinger for de som brukes i den photobleaching eksperimenter, men uten hendelsen photobleaching.

Fluorescens gjenoppretting etter photobleaching (FRAP) er en mikroskopi teknikk som kan brukes til å kvantifisere protein dynamikk i levende celler1,2. Populariteten til FRAP har økt fordi kommersielle av laserskanning AC confocal mikroskop med høy oppløsning, hastighet og sensitivitet, og en "rainbow" av genetisk kodet fluorescerende proteiner, som grønn fluorescerende protein (GFP) og gule fluorescerende protein (YFP)3. Genetisk kodet fluorescerende proteiner er smeltet til et protein av interesse å tillate den subcellular lokaliseringen av protein av interesse. I et typisk FRAP eksperiment, er stabil fluorescens i et oppkjøp område av interesse (ROI) i en celle observert via gjentatte avbilding av at Avkastningen med lav intensitet laserlys. Deretter er fluorescerende molekylene raskt og irreversibelt nedsatt i et forhåndsdefinert delsett av oppkjøpet avkastning, heretter referert til som blekemiddel avkastning, med kort eksponering for høy intensitet laserlys. Som nye ubleket proteiner fylle bleket proteiner over tid, gir fart og intensitet på fluorescens utvinning i blekemiddel ROI informasjon om protein mobilitet (figur 1)4.
Vår interesse i å bestemme mobilitet av ubiquitin binding protein p62 (også kjent som sequestosome-1) i aggresome-lignende menneskeskapte strukturer (ALIS) i murine RAW264.7 makrofager etter stimulering med lipopolysakkarid (LPS) førte oss til å vurdere FRAP litteratur. Dessverre, mange av de eksisterende FRAP protokollene er ufullstendig eller inordinately komplekse5,6,7,8,9. Noen gir ikke detaljert informasjon om laser innstillinger, strålen banen konfigurasjon og bilde oppkjøpet parametere5,6,7,8,9. Andre utelatt detaljer om dataanalyse, som hvordan å løse problemet av blekemiddel ROI drift6,9 eller beregne viktige utvinning parametere, inkludert mobile brøkdel (Mf), ubevegelig brøk (Jegf), og halv-time recovery (t½)5,7. Derimot andre plassert mye vekt på komplekse matematiske formler brukes til å beregne Mf, jegfog t,1/2,5,,6,,8,,9. Dermed er vårt formål å gi en omfattende, praktisk og enkel trinnvise protokoll for FRAP eksperimenter med levende celler.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:835px;" width="835">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium</td>
			<td style="width:211px;">Hyclone</td>
			<td style="width:137px;">SH30022.01</td>
			<td style="width:167px;">High Glucose (4.5 g/L)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Fetal bovine serum</td>
			<td style="width:211px;">Gemini Bio-Products</td>
			<td style="width:137px;">100-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Glass bottom dishes</td>
			<td style="width:211px;">MatTek</td>
			<td style="width:137px;">P35G-1.5-14-C</td>
			<td>35-mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Image J software</td>
			<td style="width:211px;">National Institutes of Health</td>
			<td style="width:137px;">N.A.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Lipopolysaccharide (LPS)</td>
			<td style="width:211px;">Sigma</td>
			<td style="width:137px;">L4391</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Nocodazole</td>
			<td style="width:211px;">Sigma</td>
			<td style="width:137px;">M1404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Penicillin-streptomycin solution</td>
			<td style="width:211px;">Corning</td>
			<td style="width:137px;">30-002-Cl</td>
			<td>100&#215;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Plan-Apochromat 63&#215;/1.40 oil objective</td>
			<td style="width:211px;">Carl Zeiss MicroImaging, Inc</td>
			<td style="width:137px;">4407629904000000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Polyethylenimine (PEI)</td>
			<td style="width:211px;">Polysciences</td>
			<td style="width:137px;">23966-1</td>
			<td>linear (MW 25,000)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">RAW 264.7 murine macrophages</td>
			<td style="width:211px;">ATCC</td>
			<td style="width:137px;">TIB-71</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Zeiss confocal microscope</td>
			<td style="width:211px;">Carl Zeiss MicroImaging, Inc</td>
			<td style="width:137px;">LSM 510</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fluorescence recovery after photobleaching of yellow fluorescent protein tagged p62 in aggresome-like induced structures

Fluorescens utvinning etter photobleaching (FRAP) er en mikroskopi teknikk som kan brukes til å kvantifisere protein mobilitet lever celler. I et typisk FRAP eksperiment, er stabil fluorescens observert av gjentatte bildebehandling med lav intensitet laserlys. Deretter er fluorescerende molekylene raskt og irreversibelt svekket via kort eksponering for høy intensitet laserlys. Informasjon om protein mobilitet oppnås ved å overvåke utvinning av fluorescens. Vi brukte FRAP for å bestemme mobilitet av p62 i aggresome-lignende menneskeskapte strukturer (ALIS) i murine makrofager etter stimulering med lipopolysakkarid (LPS). Fordi mange eksisterende FRAP protokoller er enten ufullstendig eller komplekse, var målet vårt å gi en omfattende, praktisk og enkel trinnvise protokoll for FRAP eksperimenter med levende celler. Her beskriver vi RAW264.7 macrophage transfection med gule fluorescerende protein-p62 (YFP-p62), induksjon av ALIS ved å utsette cellene LPS, og en trinnvis metode for innsamling av prebleach og postbleach FRAP bilder og data analyse. Til slutt, vi diskutere viktige faktorer å vurdere når du utfører en FRAP eksperiment.

Vist her er resultatet av en typisk eksperiment der vi brukte FRAP undersøke graden av mobilitet for p62 innenfor ALIS i RAW264.7 celler behandlet med LPS for 3-5 h12. Figur 3 En viser rådata fra en blekemiddel, kontrollere og bakgrunn avkastning etter av bilder hadde blitt justert til rette for små mengder (< ~ 3 µm) av bildet drift av ALIS. YFP-p62 fluorescens i denne ALIS på prebleach og postbleach er vist i Figur 3E og supplerende Video 1. Figur 3 B viser disse dataene etter bakgrunn-korreksjon. Figur 3 Disse dataene viser etter korrigering til fluorescens i kontrollen avkastning. Figur 3 D viser disse dataene normalisert å bety fluorescens 5 prebleach verdiene i blekemiddel avkastning. Graden av bleking var tilstrekkelig i dette eksperimentet (bleke dybde = 91.94). YFP-p62 fluorescens innenfor denne ALIS gjenopprettet sakte, t1/2 = 128.27 s (2,14 min). YFP-p62 var ikke et svært mobile protein i dette eksperimentet, som Mf = 21.97 og jegf = 78.03.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59288/59288fig1.jpg"> Figur 1 : Et diagram av en RAW264.7 celle og trinn for bildeanalyser etter FRAP bildene har blitt justert for å korrigere bildet drift av ALIS. (A) Diagram av en RAW264.7 celle viser flere ALIS og blekemiddel, kontroll og bakgrunn ROIs i oppkjøpet avkastning. (B) en idealisert skildring av rå FRAP data innhentet i blekemiddel, kontroll og bakgrunn ROIs i panelet A. (C) en idealisert graf med rå FRAP data som har blitt bakgrunn-korrigert. (D) en idealisert graf bakgrunn-korrigert FRAP data som har blitt normalisert til fluorescens i kontrollen avkastning. (E) en idealisert graf normalisert og bakgrunn-korrigert FRAP data som har blitt normalisert til den prebleach fluorescensen i blekemiddel avkastning. Forkortelser: Con = kontroll; BG = bakgrunn. Dette tallet ble endret fra Rabut og Ellenberg4. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59288/59288fig1large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59288/59288fig2.jpg"> Figur 2: Bilder av brukergrensesnittet i AIM-programvaren (tabell av materialer) for valg av laser stråle banen konfigurasjon og bilde oppkjøpet parametere for FRAP eksperimenter. (A) Laser administrere skjermen viser Argon/2 laser linjene, produksjon og rør gjeldende brukes. (B) konfigurasjon administrere skjermen viser strålen splitter og utslipp filterinnstillinger brukes. (C) skanning administrere skjermen viser innstillingen for bildeopptak. (D) skanning administrere skjermen viser pinhole, detektor, forsterker forskyvning, forsterker gevinst, tap og overføring innstillingene for Argon/2 514 nm laser linjen. (E) tidsserier administrere skjermen viser serien tidsinnstillingene brukes. (F) blekemiddel administrere skjermen viser prebleach og postbleach parameterene anvendt. Forkortelser: HFT = Haupt Farb Teiler (primære dichroic strålen splitter); NT1 = Neben Farb Teiler 1 (første videregående dichroic stråle splitter); NT2 = Neben Farb Teiler 2 (andre sekundære dichroic strålen splitter); EF = utslipp filter. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59288/59288fig2large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59288/59288fig3.jpg"> Figur 3 : Et representativt FRAP eksperiment å studere YFP-p62 dynamikk i ALIS i RAW264.7 celler. (A) rå fluorescens intensitet data for blekemiddel, kontroll, og bakgrunnen avkastning. (B) dataene gitt i panelet A etter blekemiddel og kontroll ROI hadde rettet til fluorescens i bakgrunnen avkastning. (C) dataene gitt i paneler A og B etter normalisere fluorescens intensiteten i blekemiddel ROI kontoen til fluorescens i kontrollen bakgrunn-korrigert Avkastningen. (D) data gitt i paneler vekselstrøm etter normalisere fluorescens intensiteten i normalisert og bakgrunn-korrigert bleke ROI gjennomsnittet av de 5 første prebleach verdiene i blekemiddel avkastning. Mf = 21.97, jegf = 78.03, t1/2 = 128.27 s (2,14 min) og blekemiddel dybde = 91.94. (E) et bilde av en ALIS prebleach (1,5 min) og postbleach (0, 6 og 16 min). Skala bar = 5 µm og gjelder for alle paneler. Forkortelser: Con = kontroll; BG = bakgrunn; Corr. = rettet; Normen. = normalisert; Gj.snittlig = gjennomsnitt. Dette tallet ble endret fra Cabe et al.12<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59288/59288fig3large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Supplementary Video 1" src="/files/ftp_upload/59288/59288supvideo1.jpg"> Supplerende Video 1: en typisk ALIS i en RAW264.7 macrophage før og etter photobleaching. YFP-p62 fluorescens er langsom å gjenopprette etter photobleach; Dermed er p62 ikke et svært mobile protein. For dette eksperimentet, Mf = 25.62, jegf = 74.38, t1/2 = 442.79 s (7.38 min) og blekemiddel dybde = 90.19. Skala bar = 5 µm. Denne videoen ble endret fra Cabe et al.12<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59288/Fig_4-Vid_FINAL.avi" target="_blank">Vennligst klikk her for å vise denne videoen. (Høyreklikk for å laste ned.)</a>

Watch this Scientific Journal Video about Fluorescence Recovery after Photobleaching of Yellow Fluorescent Protein Tagged p62 in Aggresome-like Induced Structures at JoVE.com

Fluorescence Recovery after Photobleaching of Yellow Fluorescent Protein Tagged p62 in Aggresome-like Induced Structures

Fluorescens utvinning etter Photobleaching av gule fluorescerende Protein merket p62 i Aggresome-lignende indusert strukturer

Vi beskriver en omfattende og praktisk protokoll for fluorescens gjenoppretting etter photobleaching eksperimenter med live celler. Selv om protokollen ble brukt til å måle mobilitet av gule fluorescerende protein-merket p62 i aggresome-lignende menneskeskapte strukturer, kan den brukes til en rekke mikroskopi systemer og fluorescerende proteiner.

Fluorescence recovery after photobleaching (FRAP)&#160;is a microscopy technique that can be used to quantify protein mobility in live cells. In a typical ...

Eksisterende fluorescensgjenoppretting etter fotobleaching, FRAP-protokoller, er enten ufullstendige eller altfor komplekse. Protokollen som presenteres i denne videoen er betydelig ved at den er omfattende, praktisk og grei. Den største fordelen med denne FRAP-teknikken er at den gir mulighet for kvantifisering av proteinmobilitet i og mellom subcellulære rom i levende celler.FRAP studeres for både terapeutiske og diagnostiske formål. En slik bruk er å kvantifisere diffusjon i legemiddelleveringssystemer i forskjellige vev in vivo. Denne informasjonen kan brukes til å optimalisere en legemiddelstruktur og sammensetning.FRAP-mikroskopiteknikken har gitt innsikt i et bredt spekter av felt der forståelse av diffusjonsfenomen er av interesse. Disse inkluderer celle- og molekylærbiologi, utviklingsbiologi, nevrovitenskap, materialvitenskap, avanserte biomaterialer og narkotikaoppdagelse. Selv om protokollen som er beskrevet er for bruk med pattedyrceller, kan begrepene brukes på andre systemer, for eksempel planteceller, gjærceller og bakterier.En person som aldri har utført denne teknikken, kan slite med å bestemme de optimale bildeanskaffelsesparametrene, skape et oppkjøpsområde av interesse som er egnet for eksperimentet, og beregne mobilfraksjon og pause for utvinning. Når du prøver denne prosedyren for første gang, må du utføre flere piloteksperimenter for å optimalisere protokollen i sammenheng med målene for eksperimentet. Å demonstrere prosedyren vil være Maleen Cabe, en tekniker fra laboratoriet mitt, og David Rademacher, sjefen for avbildningsanlegget.Til å begynne med, klargjør en plate med YFP-p62 transfected RAW264.7 makrofager, og behandle dem med Lipopolysakkarid som beskrevet i den medfølgende tekstprotokollen. Skyll deretter de behandlede cellene med iskald Tyrodes buffer en gang. Deretter legger du til to milliliter nocodazol-supplert Tyrodes buffer til platen, og la platene inkubere ved fire grader Celsius i 15 til 20 minutter før FRAP-avbildning og analyse.La platene inkubere ved fire grader Celsius i 15 til 20 minutter før FRAP-bildebehandling og analyse. Over på bildeoppsettet, velg 514 nanometer linjen av Argon /2 laser, som fluorescens markør har en topp eksitasjon på 512 nanometer, og en topp utslipp på 527 nanometer. Deretter klikker du Argon/2, 458, 477, 488, 514, i laserkontrollvinduet, og deretter klikker du på Standby-knappen.Når du har ventet omtrent tre minutter på at laseren skal varmes opp, klikker du på På-knappen. Sett deretter laserkraften til laseren til 100%, og trykk Enter. Deretter setter du overføringen av laserlinjen til 5%På mikroskopet, slå til Plan-Apochromat 63x forstørrelse 1,40 numerisk blenderåpning olje mål.Se prøven gjennom mikroskopets okular og plasser en aggresom-lignende indusert struktur i midten av synsfeltet. Deretter, i anskaffelsesprogramvaren, setter du bildestørrelsen til 512 med 512 piksler, skannehastigheten til åtte og datadybden til 12 Bit. Sett også skannegjennomsnittet til ett, den optiske zoomen til tre, og trykk Enter.Deretter se pinhole til 1,95 feilenheter og detektor gevinst til 582, som er like under metning. Opprett et firkantet område av interesse for bildeanskaffelsen, som har dimensjonene 150 og 150 piksler. Konfigurer tidsserien slik at interesseområdet skannes 35 ganger, én gang hvert 30.Deretter angir du blekemiddelkontrollen slik at fotobleaching vil skje etter skanning nummer fem, for å samle fem prebleach bilder av interesseområdet. Trykk enter-tasten for å bekrefte. Deretter går du til Bleach Regions-vinduet og oppretter et sirkulært blekemiddelområde av interesse innenfor det aggresomlignende induserte strukturområdet, som har en diameter på 10 piksler.Nå angir du antall iterasjoner til 300, og trykk igjen enter-tasten. Deretter setter du laserlinjen til 100 % strøm, og skriver inn 100 i feltet for overføringsprosent for laseren, og trykker Enter. Til slutt kjører du bildeanskaffelsesprogrammet for å samle frap-data fra 10 aggresome-lignende induserte strukturer i 10 celler med mindre enn tre mikrometer drift.For å starte dataanalyse, først overføre AIM lsm filer til en personlig datamaskin for dataanalyse. Riktig for bildedrift ved å justere eller matche bunken med tidsseriebilder av oppkjøpsområdet av interesse ved å åpne hver AIM lsm-fil med et bildebehandlingsprogram. Deretter velger du Plugins, Registrering, StackReg og Oversettelse, etterfulgt av å velge Plugins, Registrering, StackReg og deretter Rigid Body.Deretter setter du opp interesselederen for å måle signalintensiteten i blekemiddelområdet av interesse. For dette velger du det ovale verktøyet, tegn deretter en sirkel i blekemiddelområdet av interesse med en diameter på 10 piksler, og klikk deretter Legg til-knappen. Når det er lagt til, konfigurerer du programmet for å måle signalintensiteten i kontrollområdet av interesse.Merk rektangelverktøyet, tegn deretter en firkant på 20 og 20 piksler i kontrollområdet, og klikk Legg til-knappen. Til slutt setter du opp interesselederen for å måle signalintensiteten i bakgrunnsområdet av interesse. Velg rektangelverktøyet, tegn en firkant på 20 og 20 piksler i bakgrunnsområdet, og klikk deretter Legg til-knappen.Når du har lagt til områdene som skal analyseres i ROI Manager, gi dem endre navn på Bleach ROI, Control ROI og Background ROI, tilsvarende. Mål signalintensiteten i hvert område. Hvis du vil oppnå dette, velger du Blekemiddelavkastning, Kontrollavkastning og Bakgrunnsavkastning, og deretter går du til Mer og velger Flere mål.Lim inn resultatene i et regneark i kolonner merket henholdsvis Bleach ROI, Control ROI og Background ROI. Start med bakgrunn som korrigerer signalintensiteten i Bleach ROI og Kontrollavkastningen ved å trekke verdiene i kolonnen merket Bakgrunnsavkastning fra verdiene i kolonnen merket Bleach ROI, og kolonnen merket Control ROI. Merk disse nye kolonnene Korrigert Bleach ROI og Korrigert kontrollavkastning.Deretter normaliserer du signalet i Bleach ROI til det bakgrunnskorrigerte signalet i kontrollavkastningen. Del verdiene i kolonnen merket Korrigert bleach roi med verdiene i kolonnen merket Korrigert kontroll roi. Merk denne nye kolonnen, Normalisert korrigert bleach roi.Deretter normaliserer du signalet i kolonnen Normalisert korrigert bleach roi til gjennomsnittet av de fem prebleach-verdiene i Bleach ROI. Del verdiene i kolonnen merket Normalisert Korrigert Bleach ROI med gjennomsnittet av de fem prebleach-verdiene i Bleach ROI. Merk denne nye kolonnen, Normalisert korrigert prebleach gjennomsnittlig blekemiddelavkastning.Til slutt åpner du et program for bildebehandling. Curve passer til de normaliserte og korrigerte blekemiddelavkastningsdataene ved å kopiere postbleach normaliserte korrigerte blekemiddelavkastningsverdier og tilsvarende tidsverdier. Lim dem inn i kurvemontørvinduet, velg eksponentiell gjenoppretting fra rullegardinmenyen Kurvemontør, og velg Tilpass.Vist her er en typisk video av fluorescens utvinning etter photobleaching for RAW264.7 celler behandlet med LPS. Fluorescensutvinningen innenfor den aggresome-lignende induserte strukturområdet av interesse, er treg. Dette eksperimentet bruker fotobleaching for å undersøke graden av mobilitet av p62.p62 fluorescens i aggresome-lignende induserte strukturer, prebleach og postbleach, er vist her. Som beskrevet i denne videoen, kan fluorescensintensiteten spores over tid. Etter bakgrunnskorrigering og normalisering kan p62 fluorescens beregnes for å beskrive den mobile fraksjonen som 22% immobil brøkdelen som 78%, og beskriver pausen av utvinning innenfor de aggresomlignende induserte strukturer, som 2,14 minutter.Husk at det er spesielt viktig å definere oppkjøpsområdet av interesse på riktig måte, slik at det inkluderer en ALIS av interesse, et kontrollområde av interesse og en bakgrunnsregion av interesse. Etter denne prosedyren kan andre kvantitative fluorescerende mikroskopiteknikker brukes, for eksempel fluorescenstap i fotobleaching, FLIP og selektiv fotobleking. Mens FLIP måler graden av kontinuitet og kommunikasjon mellom subcellulære rom, gir selektiv fotobleking kinetisk informasjon om aktiv og passiv transport av proteiner til organeller, eller mellom proteinrike områder.FRAP ble opprinnelig utviklet for å kvantifisere den laterale bevegelsen av proteiner i cellemembraner. Deretter har det blitt brukt til å kvantifisere proteinmobilitet innenfor og mellom en rekke subcellulære rom, som banet vei for forskere å svare på spørsmål på en rekke felt, inkludert celle- og molekylærbiologi, utviklingsbiologi, nevrovitenskap, materialvitenskap, avanserte biomaterialer og narkotikaoppdagelse.

Research

JoVE Journal

Biology

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Fluorescent Labeling of Drosophila Heart Structures

Fluorescent Labeling of Drosophila Heart Structures

The Drosophila melanogaster dorsal vessel, or heart, is a tubular structure comprised of a single layer of contractile cardiomyocytes, pericardial cells ...

Measuring Diffusion Coefficients via Two-photon Fluorescence Recovery After Photobleaching

Multi-fluorescence recovery after photobleaching is a microscopy technique used to measure the diffusion coefficient (or analogous transport parameters) ...

Using the GELFREE 8100 Fractionation System for Molecular Weight-Based Fractionation with Liquid Phase Recovery

The GELFREE 8100 Fractionation System is a novel protein fractionation system designed to maximize protein recovery during molecular weight based ...

Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and ...

Photobleaching Assays (FRAP &amp; FLIP) to Measure Chromatin Protein Dynamics in Living Embryonic Stem Cells

Photobleaching Assays FRAP & FLIP to Measure Chromatin Protein Dynamics in Living Embryonic Stem Cells

Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) and Fluorescence Loss In Photobleaching (FLIP) enable the study of protein dynamics in living cells with ...

Determination of Lipid Raft Partitioning of Fluorescently-tagged Probes in Living Cells by Fluorescence Correlation Spectroscopy (FCS)

Determination of Lipid Raft Partitioning of Fluorescently-tagged Probes in Living Cells by Fluorescence Correlation Spectroscopy FCS

Bestemmelse av Lipid Raft Partisjonering av fluorescently-merkede prober i levende celler ved fluorescens korrelasjon spektroskopi (FCS)

In the past fifteen years the notion that cell membranes are not homogenous and rely on microdomains to exert their functions has become widely accepted. ...

Intravital Microscopy for Imaging Subcellular Structures in Live Mice Expressing Fluorescent Proteins

Intramikros for Imaging subcellulære strukturer i levende mus Uttrykke Fluorescent Proteiner

Here we describe a procedure to image subcellular structures in live rodents that is based on the use of confocal intravital microscopy. As a model organ, ...

Simultaneous Multicolor Imaging of Biological Structures with Fluorescence Photoactivation Localization Microscopy

Localization-based super resolution microscopy can be applied to obtain a spatial map (image) of the distribution of individual fluorescently labeled ...

Protein-protein Interactions Visualized by Bimolecular Fluorescence Complementation in Tobacco Protoplasts and Leaves

Protein-protein interaksjoner visualisert ved bimolekylær fluorescens complementation i Tobakk Protoplaster og blader

Many proteins interact transiently with other proteins or are integrated into multi-protein complexes to perform their biological function. Bimolecular ...