Name: fluorescence recovery after photobleaching of yellow fluorescent protein tagged p62 in aggresome-like induced structures
Uploaded: 2019-03-26T14:00:00
Duration: 12 min 58 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Fluorescence Recovery after Photobleaching of Yellow Fluorescent Protein Tagged p62 in Aggresome-like Induced Structures at JoVE.com

Agradecemos o Dr. Seth Robia na Loyola University Chicago por seus valiosos comentários sobre este manuscrito. Este trabalho foi financiado pelo NIH grant 1R01NS073967-01A1 para Joanna C. Bakowska.

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	<li>Axelrod, D., Koppel, D. E., Schlessinger, J., Elson, E., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mobility+measurement+by+analysis+of+fluorescence+photobleaching+recovery+kinetics.">Mobility measurement by analysis of fluorescence photobleaching recovery kinetics.</a> Biophysical Journal. 16 (9), 1055-1069 (1976).</li><li>Peters, R., Peters, J., Tews, K. H., Bahr, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microfluorimetric+study+of+translational+diffusion+in+erythrocyte+membranes.">A microfluorimetric study of translational diffusion in erythrocyte membranes.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 367 (3), 282-294 (1974).</li><li>Patterson, G., Day, R. 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Os autores não têm nenhum conflito de interesses para divulgar.

Nós fornecemos um protocolo passo a passo abrangente, prático e simples para FRAP experimentos com células vivas. Neste documento, o protocolo foi utilizado para medir a mobilidade dos YFP-p62 no ALIS em macrófagos RAW264.7, mas pode ser aplicado a muitos dos sistemas do microscópio confocal de varredura a laser e geneticamente codificado proteínas fluorescentes que agora estão disponíveis. Para qualquer sistema de microscopia, experimentos piloto são críticos para a determinação de parâmetros ideais FRAP, incluindo aquisição, lixívia e tamanhos ROI de controle, intensidade do laser para fotobranqueamento e aquisição de imagem prebleach e postbleach. É razoável esperar que os parâmetros FRAP ideais para diferentes para cada linha fluorescente geneticamente codificada de proteína e células.
Factores importantes a considerar quando conduzindo um experimento FRAP incluem (a) realização adequada do descorante profundidade, (b) o uso de uma breve etapa de branqueamento, (c) que permite postbleach de tempo suficiente para observar a função de recuperação completa, (d) fotobranqueamento eficiência, (e). citotoxicidade com repetidas FRAP e (f) a inclusão de um controle para perda de fluorescência devido a imagem repetida. É recomendável que a profundidade de água sanitária, que pode ser calculada de acordo com a equação fornecida na seção 3.3.1, ser ≥ 9013. Quando a profundidade da água sanitária é < 90, o grau de recuperação de fluorescência postbleach ser subestimado e os valores de If, M,fe t1/2 será incorretas. Embora a duração e a intensidade dos pulsos de laser de lixívia de indução podem variar entre FRAP experimentos, é importante que a etapa de fotobranqueamento ser breve e substancialmente mais rápido do que a função de recuperação de fluorescência. Se não é, então, uma quantidade significativa de recuperação de fluorescência pode ocorrer durante a etapa de branqueamento. Com um tempo longo de lixívia, recuperação de fluorescência durante a etapa de branqueamento não seria medida, e levaria a medições incorretas de If, M,f, et1/2. Além disso, para obter os valores corretos paraf, M,f, et1/2, a aquisição de ROI deve ser observada postbleach até o nível de fluorescência em lixívia ROI atingiu um platô. Por exemplo, em nossos experimentos FRAP, não houve diferença entre o quef, M,fe t1/2 valores quando observamos YFP-p62 fluorescência em lixívia ROI para 32,2 min postbleach versus quando observamos YFP-p62 em lixívia ROI para postbleach de 15,1 min; assim, concluímos que a função de recuperação alcançado um platô em 15,1 min postbleach12. No que respeita à eficiência de fotobranqueamento, fotobranqueamento aumenta com o quadrado do fator zoom óptico14. Assim, o uso de lentes de zoom ópticos altos é favorável para fotobranqueamento rápido mas pode resultar em indesejável fotobranqueamento durante a aquisição; Este último pode ser contabilizado por um ROI de controle de imagem. Fotobranqueamento repetido é deve ser evitada pois pode levar à geração de espécies citotóxicas reativas de oxigênio (ROS). No entanto, o grau de geração de ROS devido à exposição a um laser de alta intensidade é mais baixo para proteínas fluorescentes geneticamente codificadas, do que para fluorophores química (por exemplo, anticorpos fluorescentes)15, e o ROS gerado são mais propensos a reagir dentro a proteína fluorescente geneticamente codificada do que com outras moléculas na célula4. Além da probabilidade aumentada de gerar ROS citotóxicos, repetido fotobranqueamento é deve ser evitada pois é difícil de controlar. Finalmente, embora a transmissão do laser de baixa é usado para adquirir todas as imagens não-alvejante, alguns fotobranqueamento invariavelmente ocorrerá, que deve ser controlado. Controles possíveis para isto incluem monitoramento fluorescência em um ROI de controle dentro da aquisição ROI, obtenção de imagens de controle em uma célula não-branqueada vizinha e realizando experiências de controle com as configurações idênticas para aqueles usados na experimentos de fotobranqueamento mas sem o fotobranqueamento evento.

Recuperação de fluorescência após fotobranqueamento (FRAP) é uma técnica de microscopia que pode ser usada para quantificar a dinâmica da proteína em vivo células1,2. A popularidade do FRAP aumentou devido a ampla disponibilidade comercial de microscópios confocal com alta resolução, velocidade e sensibilidade de exploração do laser, e um "arco-íris" de geneticamente codificado proteínas fluorescentes, como verde fluorescente proteína (GFP) e proteína fluorescente amarela (YFP)3. Proteínas fluorescentes geneticamente codificadas são fundidas para uma proteína de interesse para permitir a Localização subcellular da proteína de interesse. Em um típico experimento FRAP, a fluorescência de estado estacionário em uma região de aquisição de interesse (ROI) dentro de uma célula é observada através de imagens repetidas de que ROI com luz laser de baixa intensidade. Posteriormente, as moléculas fluorescentes são rapidamente e irreversivelmente prejudicadas em um subconjunto predefinido da aquisição ROI, doravante referida como a lixívia, ROI, pela breve exposição à luz do laser de alta intensidade. Como novas proteínas crus repor proteínas descoradas ao longo do tempo, a velocidade e a intensidade da recuperação de fluorescência em lixívia ROI fornece informações sobre proteínas de mobilidade (Figura 1)4.
Nosso interesse em determinar a mobilidade do ubiquitin ligação proteína p62 (também conhecido como sequestosome-1) na aggresome induzida por estruturas (ALIS) em murino RAW264.7 macrófagos após estimulação com lipopolissacarídeo (LPS) levou-na rever o FRAP literatura. Infelizmente, muitos dos protocolos FRAP existentes são incompletas ou excessivamente complexo5,6,7,8,9. Alguns não fornecem informações detalhadas sobre as configurações do laser, configuração de caminho do feixe e imagem aquisição parâmetros5,6,7,8,9. Outros omitido detalhes importantes sobre a análise de dados, como forma de abordar a questão da lixívia ROI deriva6,9 ou como calcular parâmetros importantes de recuperação, incluindo a fração móvel (Mf), a fração de imóvel (Euf) e metade do tempo de recuperação (t½)5,7. Por outro lado, outros ênfase demais complexas fórmulas matemáticas para calcular Mf, eufe t1/25,6,8,9. Assim, nosso objetivo é fornecer um protocolo passo a passo abrangente, prático e simples para FRAP experimentos com células vivas.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:835px;" width="835">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium</td>
			<td style="width:211px;">Hyclone</td>
			<td style="width:137px;">SH30022.01</td>
			<td style="width:167px;">High Glucose (4.5 g/L)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Fetal bovine serum</td>
			<td style="width:211px;">Gemini Bio-Products</td>
			<td style="width:137px;">100-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Glass bottom dishes</td>
			<td style="width:211px;">MatTek</td>
			<td style="width:137px;">P35G-1.5-14-C</td>
			<td>35-mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Image J software</td>
			<td style="width:211px;">National Institutes of Health</td>
			<td style="width:137px;">N.A.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Lipopolysaccharide (LPS)</td>
			<td style="width:211px;">Sigma</td>
			<td style="width:137px;">L4391</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Nocodazole</td>
			<td style="width:211px;">Sigma</td>
			<td style="width:137px;">M1404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Penicillin-streptomycin solution</td>
			<td style="width:211px;">Corning</td>
			<td style="width:137px;">30-002-Cl</td>
			<td>100&#215;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Plan-Apochromat 63&#215;/1.40 oil objective</td>
			<td style="width:211px;">Carl Zeiss MicroImaging, Inc</td>
			<td style="width:137px;">4407629904000000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Polyethylenimine (PEI)</td>
			<td style="width:211px;">Polysciences</td>
			<td style="width:137px;">23966-1</td>
			<td>linear (MW 25,000)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">RAW 264.7 murine macrophages</td>
			<td style="width:211px;">ATCC</td>
			<td style="width:137px;">TIB-71</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Zeiss confocal microscope</td>
			<td style="width:211px;">Carl Zeiss MicroImaging, Inc</td>
			<td style="width:137px;">LSM 510</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fluorescence recovery after photobleaching of yellow fluorescent protein tagged p62 in aggresome-like induced structures

Recuperação de fluorescência após fotobranqueamento (FRAP) é uma técnica de microscopia que pode ser usada para quantificar a mobilidade de proteínas nas células vivas. Em um típico experimento FRAP, fluorescência de estado estacionário é observada por imagem repetida com luz laser de baixa intensidade. Posteriormente, as moléculas fluorescentes são rapidamente e irreversivelmente prejudicadas através de breve exposição à luz do laser de alta intensidade. Informações sobre mobilidade de proteína são obtidas pelo monitoramento da recuperação de fluorescência. Costumávamos FRAP para determinar a mobilidade de p62 em aggresome induzida por estruturas (ALIS) em macrófagos murino após estimulação com lipopolissacarídeo (LPS). Porque muitos protocolos FRAP existentes são incompletas ou complexo, nosso objetivo era fornecer um protocolo passo a passo abrangente, prático e simples para FRAP experimentos com células vivas. Aqui, descrevemos a transfeccao de macrófagos RAW264.7 com amarelo fluorescente proteína-p62 (YFP-p62), indução de ALIS, expondo as células de LPS e um método passo a passo para a coleta de prebleach e postbleach FRAP imagens e análise de dados. Finalmente, discutimos factores importantes a considerar quando conduzindo um experimento FRAP.

Aqui são mostrados os resultados de um experimento típico em que costumávamos FRAP para examinar o grau de mobilidade dos p62 no ALIS em células RAW264.7 tratados com LPS para 3-5 h12. Figura 3 A mostra os dados brutos obtidos de um alvejante, controlar e depois que a pilha de imagens tinha sido alinhada para corrigir para pequenas quantidades de fundo ROI (< ~ 3 µm) de deriva de imagem das ALIS. YFP-p62 fluorescência nesta ALIS em prebleach e postbleach é mostrada na Figura 3E e complementar Video 1. Figura 3 B mostra estes dados após a correção de fundo. Figura 3 C mostra estes dados após a correção para fluorescência no controle de ROI. Figura 3 D mostra esses dados normalizados para a fluorescência média dos 5 valores prebleach em lixívia ROI. O grau de branqueamento era suficiente neste experimento (lixívia profundidade = 91.94). Fluorescência YFP-p62 dentro desta ALIS recuperou-se lentamente, como t1/2 = 128.27 s (2,14 min). YFP-p62 não era uma proteína muito móvel neste experimento, como Mf = 21.97 e euf = 78.03.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59288/59288fig1.jpg"> Figura 1 : Um diagrama de uma célula RAW264.7 e as etapas para análise de imagem depois que as imagens da FRAP foram alinhadas para corrigir desvio de imagem dos ALIS. (A) diagrama de uma célula RAW264.7 retratando vários ALIS e a água sanitária, controle e ROIs de fundo dentro da aquisição ROI. (B) uma representação idealizada da FRAP cru dados obtidos na lixívia, controle e fundo ROIs em painel r. (C) um gráfico idealizado dos dados brutos do FRAP que foram fundo-corrigido. (D) um gráfico idealizado de fundo-corrigido FRAP dados que têm sido normalizados para fluorescência no controle de ROI. (E) uma idealizada gráfico de dados FRAP normalizados e correção de fundo que têm sido normalizados para a fluorescência prebleach em lixívia ROI. Abreviaturas: Con = controle; BG = plano de fundo. Esta figura foi modificada de Rabut e Ellenberg4. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59288/59288fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59288/59288fig2.jpg"> Figura 2: Imagens da interface do usuário do software AIM (tabela de materiais) para a seleção do laser, feixe caminho configuração e parâmetros de aquisição de imagem para os experimentos FRAP. (A) Laser controle tela mostrando as linhas de laser argônio/2, saída e corrente do tubo utilizado. (B) configuração controle de tela que mostra o feixe divisor e emissão de filtram as configurações usadas. (C) Scan controle de tela que mostra a configuração usada para aquisição de imagens. Scan (D) controlar a tela mostrando o pinhole, detector ganho, deslocamento de amplificador, amplificador e configurações de transmissão para a linha de laser argônio/2 514 nm. (E) séries temporais controlam de tela que mostra as configurações de série de tempo usadas. Bleach (F) controle de tela que mostra a prebleach e postbleach parâmetros usados. Abreviaturas: HFT = Haupt Farb Teiler (divisor de feixe primário de dicroicas); NT1 = Neben Farb Teiler 1 (divisor de feixe dicroicas primeira secundária); NT2 = Neben Farb Teiler 2 (divisor de feixe dicroicas segundo secundário); EF = filtro de emissão. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59288/59288fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59288/59288fig3.jpg"> Figura 3 : Um experimento FRAP representativo para estudar a dinâmica YFP-p62 no ALIS em células RAW264.7. (A) dados de intensidade de fluorescência Raw para um alvejante, controle e fundo ROI. (B) os dados apresentados no painel A após a lixívia e controle ROI tinham sido corrigidos para fluorescência no fundo ROI. (C) os dados fornecidos em painéis A e B após normalizar a intensidade de fluorescência em lixívia ROI para dar conta da fluorescência no controle de correção de fundo ROI. (D) os dados fornecidos em painéis A C após normalizar a intensidade de fluorescência na lixívia normalizada e correção de fundo ROI para a média dos 5 primeiros valores prebleach em lixívia ROI. Mf = 21.97, euf = 78.03, t1/2 = 128.27 s (2,14 min) e profundidade de lixívia = 91.94. (E), uma imagem de um ALIS em prebleach (1,5 min) e postbleach (0, 6 e 16 min). Barra de escala = 5 µm e é válido para todos os painéis. Abreviaturas: Con = controle; BG = plano de fundo; Corr. = corrigida; Norm. = normalizados; Média = média. Esta figura foi modificada de Cabe et al12<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59288/59288fig3large.jpg" target="_blank">clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Supplementary Video 1" src="/files/ftp_upload/59288/59288supvideo1.jpg"> Complementar Video 1: um típico ALIS em um macrófago RAW264.7 antes e depois de fotobranqueamento. P62-YFP fluorescência é lenta para se recuperar após a photobleach; Portanto, p62 não é uma proteína muito móvel. Para este experimento, Mf = 25.62, euf = 74.38, t1/2 = 442.79 s (7,38 min) e profundidade de lixívia = 90.19. Barra de escala = 5 µm. Este vídeo foi modificado da Cabe et al12<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59288/Fig_4-Vid_FINAL.avi" target="_blank">por favor clique aqui para ver este vídeo. (Botão direito do mouse para fazer o download.)</a>

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Fluorescence Recovery after Photobleaching of Yellow Fluorescent Protein Tagged p62 in Aggresome-like Induced Structures

Recuperação de fluorescência após p62 fotobranqueamento de amarelo fluorescente proteína marcados em Aggresome induzida por estruturas

Descreveremos um protocolo abrangente e prático para recuperação de fluorescência após fotobranqueamento experimentos com células vivem. Embora o protocolo foi usado para medir a mobilidade dos p62 com tag proteína fluorescente amarelo em estruturas aggresome induzidas, pode ser aplicado a uma variedade de sistemas de microscopia e proteínas fluorescentes.

Fluorescence recovery after photobleaching (FRAP)&#160;is a microscopy technique that can be used to quantify protein mobility in live cells. In a typical ...

A recuperação da fluorescência existente após o fotobleaching, os protocolos FRAP, são incompletos ou excessivamente complexos. O protocolo apresentado neste vídeo é significativo por ser abrangente, prático e direto. A principal vantagem desta técnica FRAP é que ela permite a quantificação da mobilidade proteica dentro e entre compartimentos subcelulares em células vivas.O FRAP está sendo estudado para fins terapêuticos e diagnósticos. Um desses usos é quantificar a difusão dentro de sistemas de distribuição de medicamentos em diferentes tecidos in vivo. Essas informações podem ser usadas para otimizar uma estrutura e composição de medicamentos.A técnica de microscopia FRAP forneceu insights em uma ampla gama de campos nos quais a compreensão do fenômeno de difusão é de interesse. Estes incluem biologia celular e molecular, biologia do desenvolvimento, neurociência, ciência material, biomateriais avançados e descoberta de drogas. Embora o protocolo descrito seja para uso com células de mamíferos, os conceitos podem ser aplicados a outros sistemas, como células vegetais, células de levedura e bactérias.Um indivíduo que nunca realizou essa técnica pode ter dificuldade em determinar os parâmetros ideais de aquisição de imagem, criando uma região de aquisição de interesse adequada para seu experimento, e calculando a fração móvel e o intervalo da recuperação. Ao tentar este procedimento pela primeira vez, certifique-se de realizar vários experimentos piloto para otimizar o protocolo no contexto dos objetivos do seu experimento. Demonstrando o procedimento estarão Maleen Cabe, um técnico do meu laboratório, e David Rademacher, o gerente do centro de imagens.Para começar, prepare uma placa de macrófagos RAW264.7 transfectados YFP-p62 e trate-os com lipopolisacarida, conforme descrito no protocolo de texto que acompanha. Em seguida, enxágue as células tratadas com o tampão de Tyrode gelado uma vez. Em seguida, adicione dois mililitros do tampão de Tyrode complementado com Nocodazol à placa, e permita que as placas incubam a quatro graus Celsius por 15 a 20 minutos antes da imagem e análise frap.Deixe as placas incubarem a quatro graus Celsius por 15 a 20 minutos antes da imagem e análise frap. Na configuração de imagem, selecione a linha de 514 nanômetros do laser argon/2, já que o marcador de fluorescência tem um pico de excitação em 512 nanômetros, e uma emissão máxima de 527 nanômetros. Em seguida, na janela laser control, clique em Argon/2, 458, 477, 488, 514 e clique no botão Standby.Depois de esperar cerca de três minutos para o laser aquecer, clique no botão On. Em seguida, defina a potência laser do laser para 100% e pressione Enter. Em seguida, defina a transmissão da linha laser para 5% No microscópio, vire para o Plano-Apochromat 63x ampliação 1,40 objetivo de óleo de abertura numérica.Veja o espécime através da ocular do microscópio e coloque uma estrutura induzida em forma de aggresome no centro do campo de visão. Em seguida, no software de aquisição, defina o tamanho do quadro para 512 por 512 pixels, a velocidade de varredura para oito e a profundidade de dados para 12 Bit. Também defina a média de varredura para um, o zoom óptico para três e pressione Enter.Em seguida, se o pinhole para 1,95 unidades de erro e detector ganhar para 582, que está logo abaixo da saturação. Crie uma região de interesse em forma quadrada para a aquisição de imagens, que tem as dimensões de 150 por 150 pixels. Configure a série de tempo de tal forma que a região de interesse seja digitalizada 35 vezes, uma vez a cada 30 segundos.Em seguida, defina o controle de alvejante de tal forma que o fotobleaching ocorrerá após a varredura número cinco, para coletar cinco imagens prebleach da região de interesse. Pressione a tecla Enter para confirmar. Em seguida, vá para a janela Regionais de Alvejante e crie uma região de alvejante em forma circular de interesse dentro da área de estrutura induzida em forma de aggresome, que tem um diâmetro de 10 pixels.Agora, defina o número de iterações para 300 e pressione novamente a tecla Enter. Em seguida, defina a linha laser para 100% de potência, e digite 100 no campo percentual de transmissão para o laser, e pressione Enter. Finalmente, execute o programa de aquisição de imagens para coletar dados FRAP de 10 estruturas induzidas semelhantes a aggresome em 10 células com menos de três mícrons de deriva.Para iniciar a análise de dados, primeiro transfira os arquivos AIM lsm para um computador pessoal para análise de dados. Corrija para deriva de imagem alinhando ou correspondendo à pilha de imagens de séries temporâneas da região de aquisição de interesse, abrindo cada arquivo AIM lsm com um programa de processamento de imagem. Em seguida, selecione Plugins, Registro, StackReg e Tradução, seguido de selecionar Plugins, Registro, StackReg e, em seguida, Corpo Rígido.Em seguida, configure a região de gerente de interesse para medir a intensidade do sinal na região de interesse da alvejante. Para isso, selecione a ferramenta oval e, em seguida, desenhe um círculo na região de interesse alvejante com um diâmetro de 10 pixels e clique no botão Adicionar. Uma vez adicionado, configure o programa para medir a intensidade do sinal na região de controle de interesse.Selecione a ferramenta retângulo e, em seguida, desenhe um quadrado de 20 por 20 pixels na região de controle e clique no botão Adicionar. Por fim, configure a região de gerente de interesse para medir a intensidade do sinal na região de fundo de interesse. Selecione a ferramenta retângulo, desenhe um quadrado de 20 por 20 pixels na região de fundo e clique no botão Adicionar.Depois de adicionar as regiões a serem analisadas no ROI Manager, renomeie-as ROI de Alvejante, ROI de controle e ROI de fundo, em conformidade. Medir a intensidade do sinal em cada região. Para isso, selecione ROI de alvejante, ROI de controle e ROI de fundo e, em seguida, vá para Mais e selecione Multi Measure.Cole os resultados em uma planilha em colunas rotuladas ROI de Alvejante, ROI de Controle e ROI de Fundo, respectivamente. Comece por segundo plano corrigindo a intensidade do sinal no ROI de Alvejante e no ROI de controle subtraindo os valores na coluna rotulada ROI de fundo dos valores da coluna rotulada ROI de Branqueamento, e a coluna rotulada de Controle ROI. Rotule essas novas colunas ROI de alvejante corrigido e ROI de controle corrigido.Em seguida, normalize o sinal no ROI de alvejante para o sinal corrigido por fundo no ROI de controle. Divida os valores na coluna rotulada ROI de alvejante corrigido pelos valores da coluna rotulada ROI de controle corrigido. Rotule esta nova coluna, ROI de alvejante normalizado.Em seguida, normalize o sinal na coluna ROI de alvejante normalizado para a média dos cinco valores de prebleach no ROI de Alvejante. Divida os valores na coluna rotulada ROI de alvejante corrigido normalizado pela média dos cinco valores de prebleach no ROI de Alvejante. Rotule esta nova coluna, Normalizada Corrigida Prebleach Média Alvejante ROI.Por fim, abra um programa para processamento de imagens. A curva se encaixa nos dados de ROI de branqueamento normalizados e corrigidos copiando os valores de ROI de branqueamento normalizados e os valores de tempo correspondentes. Cole-os na janela Curve Fitter, selecione a recuperação exponencial do menu suspenso Do Curve Fitter e selecione Fit.Mostrado aqui é um vídeo típico de recuperação de fluorescência após fotobleaching para células RAW264.7 tratadas com LPS. A recuperação da fluorescência dentro da região de interesse da estrutura induzida de aggresome é lenta. Este experimento usa fotobleaching para examinar o grau de mobilidade do p62.p62 fluorescência nas estruturas induzidas aggresome-like, prebleach e postbleach, é mostrado aqui. Como descrito neste vídeo, a intensidade da fluorescência pode ser rastreada ao longo do tempo. Após a correção e normalização do plano de fundo, a fluorescência p62 pode ser calculada para descrever a fração móvel como 22% a fração imóvel como 78% e descreve o intervalo de recuperação dentro das estruturas induzidas semelhantes a aggresome, como 2,14 minutos.Lembre-se, é especialmente importante definir adequadamente a região de aquisição de interesse para que inclua um ALIS de interesse, uma região de controle de interesse e uma região de fundo de interesse. Após este procedimento, outras técnicas de microscopia fluorescente quantitativa podem ser aplicadas, como perda de fluorescência em fotobleaching, FLIP e fotobleaching seletivo. Considerando que a FLIP mede o grau de continuidade e comunicação entre compartimentos subcelulares, o fotobleaching seletivo fornece informações cinéticas sobre o transporte ativo e passivo de proteínas em organelas, ou entre áreas ricas em proteínas.O FRAP foi inicialmente desenvolvido para quantificar o movimento lateral das proteínas nas membranas celulares. Posteriormente, tem sido usado para quantificar a mobilidade proteica dentro e entre uma variedade de compartimentos subcelulares, o que abriu o caminho para os pesquisadores responderem a perguntas em uma variedade de campos, incluindo biologia celular e molecular, biologia do desenvolvimento, neurociência, ciência material, biomateriais avançados e descoberta de drogas.

Research

JoVE Journal

Biology

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

Coloração de proteínas em géis com Coomassie G-250 sem ácido acético e Solventes Orgânicos

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Biologia

Fluorescent Labeling of Drosophila Heart Structures

Fluorescent Labeling of Drosophila Heart Structures

Labeling fluorescentes de Drosophila Estruturas Coração

The Drosophila melanogaster dorsal vessel, or heart, is a tubular structure comprised of a single layer of contractile cardiomyocytes, pericardial cells ...

Measuring Diffusion Coefficients via Two-photon Fluorescence Recovery After Photobleaching

Medir coeficientes de difusão através de dois fótons de fluorescência de Recuperação Após Fotodegradação

Multi-fluorescence recovery after photobleaching is a microscopy technique used to measure the diffusion coefficient (or analogous transport parameters) ...

Using the GELFREE 8100 Fractionation System for Molecular Weight-Based Fractionation with Liquid Phase Recovery

Usando o sistema de fracionamento GELFREE 8100 para Fracionamento baseada no peso molecular com Recovery Fase Líquida

The GELFREE 8100 Fractionation System is a novel protein fractionation system designed to maximize protein recovery during molecular weight based ...

Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection

Lapso de tempo de imagens de Mitose Depois de Transfection siRNA

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and ...

Photobleaching Assays (FRAP &amp; FLIP) to Measure Chromatin Protein Dynamics in Living Embryonic Stem Cells

Photobleaching Assays FRAP & FLIP to Measure Chromatin Protein Dynamics in Living Embryonic Stem Cells

Fotobranqueamento Ensaios (FRAP &amp; FLIP) a Medida Dynamics Protein Chromatin em Viver Células-Tronco Embrionárias

Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) and Fluorescence Loss In Photobleaching (FLIP) enable the study of protein dynamics in living cells with ...

Determination of Lipid Raft Partitioning of Fluorescently-tagged Probes in Living Cells by Fluorescence Correlation Spectroscopy (FCS)

Determination of Lipid Raft Partitioning of Fluorescently-tagged Probes in Living Cells by Fluorescence Correlation Spectroscopy FCS

Determinação da Raft Lipid Particionamento de Sondas marcadas com fluorescência em células vivas por Espectroscopia de Correlação de Fluorescência (FCS)

In the past fifteen years the notion that cell membranes are not homogenous and rely on microdomains to exert their functions has become widely accepted. ...

Intravital Microscopy for Imaging Subcellular Structures in Live Mice Expressing Fluorescent Proteins

Microscopia intravital para Estruturas de imagem Subcelulares em ratos vivos Expressando fluorescentes Proteínas

Here we describe a procedure to image subcellular structures in live rodents that is based on the use of confocal intravital microscopy. As a model organ, ...

Simultaneous Multicolor Imaging of Biological Structures with Fluorescence Photoactivation Localization Microscopy

Simultânea Multicolor Imagem de Estruturas Biológicas com fluorescência Fotoativação Localização Microscopia

Localization-based super resolution microscopy can be applied to obtain a spatial map (image) of the distribution of individual fluorescently labeled ...

Protein-protein Interactions Visualized by Bimolecular Fluorescence Complementation in Tobacco Protoplasts and Leaves

Interações proteína-proteína visualizado por Bimolecular Fluorescência de Complementação em tabaco Protoplastos e folhas

Many proteins interact transiently with other proteins or are integrated into multi-protein complexes to perform their biological function. Bimolecular ...