Name: fluorescence recovery after photobleaching of yellow fluorescent protein tagged p62 in aggresome-like induced structures
Uploaded: 2019-03-26T14:00:00
Duration: 12 min 58 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Fluorescence Recovery after Photobleaching of Yellow Fluorescent Protein Tagged p62 in Aggresome-like Induced Structures at JoVE.com

Мы благодарим д-р Сет Робия Университет Лойолы за его ценные комментарии на этой рукописи. Эта работа была поддержана NIH Грант 1R01NS073967-01A1 для Joanna C. Bakowska.

<ol>
	<li>Axelrod, D., Koppel, D. E., Schlessinger, J., Elson, E., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mobility+measurement+by+analysis+of+fluorescence+photobleaching+recovery+kinetics.">Mobility measurement by analysis of fluorescence photobleaching recovery kinetics.</a> Biophysical Journal. 16 (9), 1055-1069 (1976).</li><li>Peters, R., Peters, J., Tews, K. H., Bahr, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microfluorimetric+study+of+translational+diffusion+in+erythrocyte+membranes.">A microfluorimetric study of translational diffusion in erythrocyte membranes.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 367 (3), 282-294 (1974).</li><li>Patterson, G., Day, R. N., Piston, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+protein+spectra.">Fluorescent protein spectra.</a> Journal of Cell Science. 114, 837-838 (2001).</li><li>Rabut, G., Ellenberg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photobleaching+techniques+to+study+mobility+and+molecular+dynamics+of+proteins+in+live+cells:+FRAP,+iFRAP,+and+FLIP.">Photobleaching techniques to study mobility and molecular dynamics of proteins in live cells: FRAP, iFRAP, and FLIP.</a> Live Cell Imaging: A Laboratory Manual (1st ed). , 101-126 (2004).</li><li>Fritzsche, M., Charras, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+protein+reaction+dynamics+in+living+cells+by+fluorescence+recovery+after+photobleaching.">Dissecting protein reaction dynamics in living cells by fluorescence recovery after photobleaching.</a> Nature Protocols. 10 (5), 660-680 (2015).</li><li>Goodwin, J. S., Kentworthy, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photobleaching+approaches+to+investigate+diffusional+mobility+and+trafficking+of+Ras+in+living+cells.">Photobleaching approaches to investigate diffusional mobility and trafficking of Ras in living cells.</a> Methods. 37 (2), 154-164 (2005).</li><li>Hildick, K. L., Gonz&#224;lez-Gonz&#224;lez, I. M., Jaskolski, F., Henley, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lateral+diffusion+and+exocytosis+of+membrane+proteins+in+cultured+neurons+assessed+using+fluorescence+recovery+and+fluorescence-loss+photobleaching.">Lateral diffusion and exocytosis of membrane proteins in cultured neurons assessed using fluorescence recovery and fluorescence-loss photobleaching.</a> Journal of Visualized Experiments. (60), e3747 (2012).</li><li>Nissim-Rafinia, M., Meshorer, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photobleaching+assays+(FRAP+&amp;+FLIP)+to+measure+chromatin+protein+dynamics+in+living+embryonic+stem+cells.">Photobleaching assays (FRAP &amp; FLIP) to measure chromatin protein dynamics in living embryonic stem cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (52), e2696 (2011).</li><li>Zheng, C., Petralia, R. S., Wang, Y., Kachar, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+recovery+after+photobleaching+(FRAP)+of+fluorescence+tagged+proteins+in+dendritic+spines+of+cultured+hippocampal+neurons.">Fluorescence recovery after photobleaching (FRAP) of fluorescence tagged proteins in dendritic spines of cultured hippocampal neurons.</a> Journal of Visualized Experiments. (50), e2568 (2011).</li><li>Thevenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+pyramid+approach+to+subpixel+registration+based+on+intensity.">A pyramid approach to subpixel registration based on intensity.</a> IEEE Transactions on Image Processing. 7 (1), 27-41 (1998).</li><li>Ishikawa-Ankerhold, H. C., Ankerhold, R., Drummen, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+fluorescence+microscopy+techniques--FRAP,+FLIP,+FLAP,+FRET+and+FLIM.">Advanced fluorescence microscopy techniques--FRAP, FLIP, FLAP, FRET and FLIM.</a> Molecules. 17 (4), 4047-4132 (2012).</li><li>Cabe, M., Rademacher, D. J., Karlsson, A. B., Cherukuri, S., Bakowska, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PB1+and+UBA+domains+of+p62+are+essential+for+aggresome-like+induced+structure+formation.">PB1 and UBA domains of p62 are essential for aggresome-like induced structure formation.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 503 (4), 2306-2311 (2018).</li><li>Brown, E. B., Wu, E. S., Zipfel, W., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+molecular+diffusion+in+solution+by+multiphoton+fluorescence+photobleaching+recovery.">Measurement of molecular diffusion in solution by multiphoton fluorescence photobleaching recovery.</a> Biophysical Journal. 77 (5), 2837-2849 (1999).</li><li>Centonze, V., Pawley, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tutorial+on+practical+confocal+microscopy+and+the+use+of+the+confocal+test+specimen.">Tutorial on practical confocal microscopy and the use of the confocal test specimen.</a> Handbook of biological confocal microscopy. , 549-570 (1995).</li><li>Chudakov, D. M., Matz, M. V., Lukyanov, S., Lukyanov, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+proteins+and+their+applications+in+imaging+living+cells+and+tissues.">Fluorescent proteins and their applications in imaging living cells and tissues.</a> Physiological Reviews. 90 (3), 1103-1163 (2010).</li></ol>

Авторы имеют никакого конфликта интересов раскрыть.

Мы предлагаем всеобъемлющий, практический и простой шаг за шагом протокол для FRAP экспериментов с живой клетки. Здесь протокол был использован для измерения мобильности рекламы ЯФП p62 в ALIS в RAW264.7 макрофагов, но он может быть применен к многие из лазерного конфокального микроскопа системы сканирования и генетически закодированный флуоресцентных белков, которые теперь доступны. Для любой системы, микроскопия экспериментальные эксперименты имеют решающее значение для определения оптимальных параметров FRAP, включая приобретение, отбеливатель и управления ROI размеров, интенсивности лазера для Фотообесцвечивание и приобретение целлюлоз и postbleach изображения. Это разумно ожидать оптимальные параметры FRAP отличаются для каждой генетически закодированный флуоресцентный белок и ячейки строки.
Важные факторы, которые следует учитывать при проведении эксперимента FRAP a обеспечение подходящих отбеливатель глубины, (b) использование краткого отбеливания шаг, (c) позволяет достаточно времени postbleach наблюдать полное восстановление функции, эффективность (d) Фотообесцвечивание, (e). цитотоксичность неоднократные FRAP, и (f) включение элемента управления для флуоресценции потери из-за повторяющихся изображений. Мы рекомендуем что отбеливатель глубины, которая может быть рассчитана по формуле, в разделе 3.3.1, ≥9013. Когда это отбеливатель глубина < 90, степень postbleach флуоресценции восстановления будет нельзя недооценивать и значения яf, Mfи t1/2 будет неверным. Хотя продолжительность и интенсивность лазерных импульсов, вызывая отбеливатель может варьироваться между FRAP эксперименты, важно, что Фотообесцвечивание шаг быть краткими и значительно быстрее, чем функцию восстановления флуоресценции. Если это не так, то значительное количество флуоресцирования восстановления может произойти во время отбеливания шаг. С временем длинные отбеливатель, флуоресценции восстановления во время отбеливания шага не будет оцениваться, и это приведет к неправильным измерениям яf, Mf, иt1/2. Кроме того, чтобы получить правильные значения для яf, Mf, ит1/2, приобретение ROI должны соблюдаться postbleach до тех пор, пока уровень флюоресценции в отбеливатель ROI достиг плато. Например, в наших экспериментах FRAP, там был никакой разницы между If, Mfи t1/2 значения когда мы наблюдали рекламы ЯФП p62 флуоресценции в отбеливатель ROI 32.2 мин postbleach по сравнению с когда мы наблюдали рекламы ЯФП p62 в отбеливатель ROI для 15.1 мин postbleach; Таким образом мы пришли к выводу, что функции восстановления достигли плато 15.1 мин postbleach12. Что касается эффективности Фотообесцвечивание Фотообесцвечивание увеличивается с площади оптический зум фактор14. Таким образом использование высоким оптическим зум-объективы благоприятна для быстрого Фотообесцвечивание, но может привести к нежелательным Фотообесцвечивание во время приобретения; последний можно объяснить для визуализации элемент управления ROI. Неоднократно Фотообесцвечивание является следует избегать, поскольку это может привести к генерации цитотоксических реактивнооксигенных видов (ров). Однако степень ROS поколения из-за воздействия высокой интенсивности лазерного ниже для генетически закодированный флуоресцентных белков, чем для химических флуорофоров (например, флуоресцентные антитела)15, и генерируется рос более склонны реагировать в пределах генетически закодированный флуоресцентного белка, чем с другими молекулами в ячейки4. Помимо увеличение вероятности генерирования цитотоксических ROS неоднократно Фотообесцвечивание — следует избегать, поскольку это трудно контролировать. Наконец хотя низкий лазерной передачи используется для получения всех изображений не отбеливатель, некоторые Фотообесцвечивание неизбежно произойдет, который должен контролироваться. Возможные элементы для этого включают в себя мониторинг флуоресценции в элементе управления ROI в рамках приобретения ROI, получение изображений управления в соседней ячейке небеленой и выполнение контроля эксперименты с одинаковыми параметрами для тех, которые используются в Фотообесцвечивание эксперименты, но без Фотообесцвечивание событие.

Флуоресценции восстановления после того, как Фотообесцвечивание (FRAP) является методом микроскопии, который может использоваться для количественного определения динамики белков в живой клетки1,2. Популярность FRAP возросла из-за широкой коммерческой доступности лазерного сканирования конфокальные микроскопы с высоким разрешением, скорость и чувствительность, и «Радуга» из генетически закодирована флуоресцентных белков, таких как Зеленый флуоресцентный белок (ГПУП) и желтый флуоресцентный белок (рекламы ЯФП)3. Генетически закодированный флуоресцентные белки сплавлены к протеину интереса для субцеллюлярные локализация протеина интереса. В типичном эксперименте FRAP установившегося флуоресценции в регионе приобретения интереса (ROI) в ячейке наблюдается через повторяющиеся изображения что ROI с низкой интенсивности лазерного света. Впоследствии флуоресцентных молекул быстро и необратимо нарушена в стандартное подмножество приобретения ROI, далее именуемые как отбеливатель ROI, путем кратковременного воздействия высокой интенсивности лазерного света. Как новые небеленой белки пополнить отбеленной белки с течением времени, скорость и интенсивность флуоресценции восстановления в отбеливатель ROI предоставляет сведения о белка мобильности (рис. 1)4.
Наша заинтересованность в определении подвижности убиквитин p62 связывания белка (также известный как sequestosome-1) в aggresome как искусственных структурах (ОВНМ) в мышиных RAW264.7 макрофаги после стимуляции с липополисахарида (LPS) привели нас пересмотреть FRAP литература. К сожалению многие из существующих протоколов FRAP являются неполными или чрезмерно сложной в5,6,,78,9. Некоторые не представить подробную информацию о параметрах лазер, луч путь конфигурации и изображения приобретения параметры5,6,,78,9. Другие опущены ключевые детали относительно анализа данных, таких как вопрос о отбеливатель ROI дрейф6,9 или как рассчитать важные восстановления параметров, включая мобильные дроби (fM), неподвижные фракция (Яf) и половина время восстановления (½t)5,7. И наоборот, другие делается слишком большой упор на сложных математических формул, используемых для вычисления Mf, яfи t1/25,6,8,9. Таким образом наша цель – обеспечить всеобъемлющий, практический и простой шаг за шагом протокол для FRAP экспериментов с живой клетки.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:835px;" width="835">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium</td>
			<td style="width:211px;">Hyclone</td>
			<td style="width:137px;">SH30022.01</td>
			<td style="width:167px;">High Glucose (4.5 g/L)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Fetal bovine serum</td>
			<td style="width:211px;">Gemini Bio-Products</td>
			<td style="width:137px;">100-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Glass bottom dishes</td>
			<td style="width:211px;">MatTek</td>
			<td style="width:137px;">P35G-1.5-14-C</td>
			<td>35-mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Image J software</td>
			<td style="width:211px;">National Institutes of Health</td>
			<td style="width:137px;">N.A.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Lipopolysaccharide (LPS)</td>
			<td style="width:211px;">Sigma</td>
			<td style="width:137px;">L4391</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Nocodazole</td>
			<td style="width:211px;">Sigma</td>
			<td style="width:137px;">M1404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Penicillin-streptomycin solution</td>
			<td style="width:211px;">Corning</td>
			<td style="width:137px;">30-002-Cl</td>
			<td>100&#215;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Plan-Apochromat 63&#215;/1.40 oil objective</td>
			<td style="width:211px;">Carl Zeiss MicroImaging, Inc</td>
			<td style="width:137px;">4407629904000000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Polyethylenimine (PEI)</td>
			<td style="width:211px;">Polysciences</td>
			<td style="width:137px;">23966-1</td>
			<td>linear (MW 25,000)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">RAW 264.7 murine macrophages</td>
			<td style="width:211px;">ATCC</td>
			<td style="width:137px;">TIB-71</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Zeiss confocal microscope</td>
			<td style="width:211px;">Carl Zeiss MicroImaging, Inc</td>
			<td style="width:137px;">LSM 510</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fluorescence recovery after photobleaching of yellow fluorescent protein tagged p62 in aggresome-like induced structures

Флуоресценции восстановления после Фотообесцвечивание (FRAP) микроскопии технику, которая может использоваться для количественной оценки подвижности белков в живых клеток. В типичном эксперименте FRAP установившегося флуоресценции наблюдается при повторных изображений с низкой интенсивности лазерного света. Впоследствии флуоресцентных молекул быстро и необратимо зрением через кратковременного воздействия высокой интенсивности лазерного света. Информация о мобильности белок получается путем мониторинга восстановления флуоресценции. Мы использовали FRAP для определения мобильности p62 в искусственных структур (ОВНМ) aggresome как в мышиных макрофаги после стимуляции с липополисахарида (LPS). Потому что многие существующие протоколы FRAP являются либо неполными, либо сложные, нашей целью было обеспечить всеобъемлющий, практический и простой шаг за шагом протокол для FRAP экспериментов с живой клетки. Здесь мы описываем transfection RAW264.7 макрофагов с желтый флуоресцентный белок p62 (рекламы ЯФП p62), индукции ALIS, подвергая клетки ПЛАСТИНОК и шаг за шагом метод для сбора целлюлоз и postbleach FRAP изображений и анализа данных. Наконец мы обсудим важные факторы, которые следует учитывать при проведении FRAP эксперимент.

Показанный здесь являются результатом типичного эксперимент, в котором мы использовали FRAP для изучения степени мобильности p62 в ALIS в RAW264.7 клетках, обработанных с ПЛАСТИНОК для 3-5 h12. Рисунок 3 A показывает необработанные данные, полученные от отбеливателя, контролировать и фон ROI после того, как стек изображений были согласованы исправить для небольших количествах (< ~ 3 мкм) изображения дрейфа ALIS. Рекламы ЯФП p62 флуоресценции в этом Алиса в prebleach и postbleach показан на рисунке 3E и дополнительного видео 1. Рисунок 3 B показывает эти данные после фон коррекции. Рисунок 3 C показывает эти данные после исправления для флуоресценции в элементе управления ROI. Рисунок 3 D показывает эти данные нормированы среднее флуоресценции 5 целлюлоз значения в отбеливатель ROI. Степень отбеливания было достаточно в этом эксперименте (отбеливатель глубина = 91,94). Рекламы ЯФП p62 флуоресценции в этом ALIS восстановлены медленно, как t1/2 = 128,27 s (2,14 мин). Рекламы ЯФП p62 был не очень мобильный белка в этом эксперименте, как Mf = 21,97 и яf = 78.03.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59288/59288fig1.jpg"> Рисунок 1 : Схема RAW264.7 клеток и шаги для анализа изображений после FRAP изображения были согласованы для коррекции изображения дрейф ALIS. (A) схема RAW264.7 ячейки с изображением несколько ALIS и отбеливатель, управления и трансформирования фон в пределах приобретение ROI. (B) идеализированной изображением сырья FRAP данные получены в отбеливателя, управления и фон ROIs панели а. (C) идеализированной граф необработанных данных FRAP, были исправлены фон. (D) идеализированной граф фон исправлены FRAP данные были нормализованы по флуоресценции в элементе управления ROI. (E) идеализированной граф нормализованные и фон исправлены данные FRAP, нормализовались для целлюлоз флуоресценции в отбеливатель ROI. Сокращения: Con = контроль; BG = фон. Эта цифра была изменена от Рабю и Элленберга4. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59288/59288fig1large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59288/59288fig2.jpg"> Рисунок 2: Изображения пользовательского интерфейса в цель программного обеспечения (таблица материалов) для выбора лазер, луч путь конфигурации и параметров получения изображений для экспериментов FRAP. (A) лазерной контролировать экране лазерные линии аргон/2, вывода и трубки тока используется. (B) конфигурации управления экрана показаны пучка сплиттер и выбросов фильтрации параметров используется. (C) сканирования управления экрана показаны параметры, используемые для захвата изображений. (D) проверка управления экране обскуры, детектор усиление, смещение усилитель, усилитель выгоды и параметры передачи для аргона/2 514 Нм лазерной линии. (E) временных рядов управления экрана показаны параметры серии времени. (F) дезинфицирующие средства управления экрана показаны prebleach и postbleach используемые параметры. Сокращения: HFT = Хаупт Farb Teiler (первичный дихроичных пучка сплиттер); NT1 = Neben Farb Teiler 1 (первый средней дихроичных пучка сплиттер); NT2 = Neben Farb Teiler 2 (второй вторичный дихроичных пучка сплиттер); EF = фильтр выбросов. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59288/59288fig2large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59288/59288fig3.jpg"> Рисунок 3 : Представитель FRAP эксперимент для изучения рекламы ЯФП p62 динамика в ALIS в клетках RAW264.7. (A) Raw флуоресценции интенсивность данных для отбеливатель, управления и фона ROI. (B) данные, приведенные в группе A после того, как дезинфицирующие средства и управления ROI были исправлены для флуоресценции в фоновом режиме ROI. (C) данные, приведенные в панели A и B после нормализации интенсивности флуоресценции в отбеливатель ROI для счета для флуоресценции в фон исправлены управления ROI. (D) по данным в панели A-C после нормализации интенсивности флуоресценции в нормализованные и фон исправлены отбеливатель ROI для среднего значения первых 5 целлюлоз в отбеливатель ROI. Mf = 21,97, яf = 78.03,1/2 t = 128,27 с (2,14 мин) и отбеливатель глубина = 91,94. (E) изображение Алиса в prebleach (1,5 мин) и postbleach (0, 6 и 16 min). Шкалы бар = 5 мкм и действительна для всех панелей. Сокращения: Con = контроль; BG = фон; Корр = исправлено; Норма. = нормализованы; СР = среднее. Эта цифра была изменена с Cabe et al.12<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59288/59288fig3large.jpg" target="_blank">пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.</a>
<img alt="Supplementary Video 1" src="/files/ftp_upload/59288/59288supvideo1.jpg"> Дополнительные видео 1: типичный Алиса в RAW264.7 макрофагов, до и после Фотообесцвечивание. Рекламы ЯФП p62 флуоресценции медленно восстанавливаться после photobleach; Следовательно p62 является не очень мобильный белок. Для этого эксперимента, Mf = 25.62, яf = 74,38, т1/2 = 442.79 s (7.38 мин) и отбеливатель глубина = 90,19. Шкалы бар = 5 мкм. Это видео был изменен с Cabe et al.12<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59288/Fig_4-Vid_FINAL.avi" target="_blank">пожалуйста нажмите здесь для просмотра этого видео. (Правой кнопкой мыши для загрузки.)</a>

Watch this Scientific Journal Video about Fluorescence Recovery after Photobleaching of Yellow Fluorescent Protein Tagged p62 in Aggresome-like Induced Structures at JoVE.com

Fluorescence Recovery after Photobleaching of Yellow Fluorescent Protein Tagged p62 in Aggresome-like Induced Structures

Флуоресценции восстановления после Фотообесцвечивание Жёлтый флуоресцентный белок, помеченный p62 в Aggresome-индуцированной структуры

Мы описываем всеобъемлющий и практический протокол для флуоресценции восстановления после Фотообесцвечивание экспериментов с живой клетки. Хотя протокол был использован для измерения мобильности Жёлтый флуоресцентный протеин тегами p62 в aggresome-индуцированной структуры, он может применяться для различных систем микроскопии и флуоресцентных белков.

Fluorescence recovery after photobleaching (FRAP)&#160;is a microscopy technique that can be used to quantify protein mobility in live cells. In a typical ...

Существующее восстановление флуоресценции после фотоблейлинга, протоколы FRAP, являются либо неполными, либо чрезмерно сложными. Протокол, представленный в этом видео, имеет важное значение в том смысле, что он является всеобъемлющим, практичным и простым. Основным преимуществом этого метода FRAP является то, что он позволяет количественной оценки подвижности белка внутри и между подклеточными отсеками в живых клетках.FRAP изучается как в терапевтических, так и в диагностических целях. Одним из таких методов использования является количественная оценка диффузии в системах доставки лекарств в различных тканях in vivo. Эта информация может использоваться для оптимизации структуры и состава препарата.Метод микроскопии FRAP дает представление в широком диапазоне областей, в которых понимание явления диффузии представляет интерес. К ним относятся клеточная и молекулярная биология, биология развития, неврология, материаловедения, передовые биоматериалы и открытие лекарств. Хотя описанный протокол для использования с клетками млекопитающих, концепции могут быть применены к другим системам, таким как растительные клетки, дрожжевые клетки и бактерии.Лицо, которое никогда не выполняло этот метод, может бороться в определении оптимальных параметров приобретения изображения, создании области приобретения, которая представляет интерес для их эксперимента, и расчете мобильной фракции и перерыве восстановления. При попытке этой процедуры в первый раз, не забудьте выполнить несколько экспериментальных экспериментов по оптимизации протокола в контексте целей вашего эксперимента. Демонстрация процедуры будет Малин Кейб, техник из моей лаборатории, и Дэвид Rademacher, основной менеджер объекта визуализации.Для начала подготовь тарелку YFP-p62 трансфицированных макрофагов RAW264.7 и обработайте их липополисахаридом, как описано в сопроводительном текстовом протоколе. Затем, промыть обработанные клетки с буфером ледяной Тирод один раз. Затем добавьте два миллилитров буфера Тирода, дополненного нокодазолом, и позвольте пластинам инкубировать при четырех градусах Цельсия в течение 15-20 минут до получения и анализа FRAP.Разрешить пластин инкубировать при четырех градусах по Цельсию в течение 15 до 20 минут до FRAP изображений и анализа. При установке изображений выберите 514 нанометровую линию лазера Argon/2, так как маркер флуоресценции имеет пик возбуждения на 512 нанометров и пиковое излучение на 527 нанометров. Далее, в окне лазерного управления, нажмите Argon/2, 458, 477, 488, 514, а затем нажмите кнопку Ожидания.После ожидания около трех минут для лазера, чтобы согреться, нажмите кнопку On. Затем установите лазерную мощность лазера до 100% и нажмите Enter. Далее установите передачу лазерной линии до 5%На микроскопе поверните к плану-апохромату 63x увеличению 1,40 числовой цели масла диафрагмы.Просмотр образца через микроскоп окуляр и место aggresome-как индуцированной структуры в центре поля зрения. Затем, в программном обеспечении приобретения, установите размер кадра до 512 на 512 пикселей, скорость сканирования до восьми, а глубину данных до 12 бит. Также установите среднее значение сканирования до одного, оптический зум до трех и нажмите Enter.Далее, se pinhole до 1.95 единиц ошибки и детектор получить до 582, что чуть ниже насыщения. Создайте квадратную область, интересную для получения изображения, которая имеет размеры 150 на 150 пикселей. Настройка тайм-ряда таким образом, чтобы область интереса сканировалась 35 раз, один раз в 30 секунд.Затем установите контроль отбеливателя таким образом, чтобы фотоотбелы происходили после сканирования номер пять, чтобы собрать пять предотливных изображений области интереса. Нажмите клавишу Enter, чтобы подтвердить. Далее перейдите к окну Bleach Regions и создайте круговую область отбеливателя, представляющий интерес в области aggresome-как индуцированная структура, которая имеет диаметр 10 пикселей.Теперь установите количество итераций до 300 и снова нажмите клавишу Enter. Затем установите лазерную линию до 100% мощности, и введите 100 в области передачи процентов для лазера, и нажмите Enter. Наконец, запустите программу получения изображений для сбора данных FRAP из 10 аггресомных индуцированных структур в 10 ячейках с менее чем тремя микронами дрейфа.Чтобы начать анализ данных, сначала перенесите файлы AIM lsm на персональный компьютер для анализа данных. Правильно для дрейфа изображений путем выравнивания или сопоставления стек изображений тайм-ряда области приобретения, представляющих интерес, открыв каждый файл AIM lsm с программой обработки изображений. Затем выберите плагины, регистрацию, StackReg и перевод, а затем выберите плагины, регистрацию, StackReg, а затем Rigid Body.Далее, создать регион интересов менеджера для измерения интенсивности сигнала в области отбеливателя интересов. Для этого выберите овальный инструмент, затем нарисуйте круг в области отбеливателя, представляющий интерес с диаметром 10 пикселей, а затем нажмите кнопку Добавить. После добавления, создать программу для измерения интенсивности сигнала в области контроля интересов.Выберите инструмент прямоугольника, затем нарисуйте квадрат 20 на 20 пикселей в области управления и нажмите кнопку Добавить. Наконец, создать регион интересов менеджера для измерения интенсивности сигнала в фоновом регионе, представляющих интерес. Выберите инструмент прямоугольника, нарисуйте квадрат 20 на 20 пикселей в фоновом режиме, а затем нажмите кнопку Добавить.После добавления регионов, которые будут проанализированы в ROI Manager, переименуйте их в ROI Bleach, Control ROI и Background ROI соответственно. Измерьте интенсивность сигнала в каждом регионе. Для достижения этой цели выберите рентабельность инвестиций bleach, рентабельность инвестиций управления и справочную рентабельность инвестиций, а затем перейдите в More и выберите Multi Measure.Вставьте результаты в электронную таблицу в столбцы с пометкой BLEACH ROI, Control ROI и Background ROI соответственно. Начните с фоновой коррекции интенсивности сигнала в рентабельности инвестиций Bleach и ROI Control, вычитая значения в столбце, помеченные Фоновой рентабельностью инвестиций, из значений в столбце с пометкой Bleach ROI и столбца с пометкой Control ROI. Наклеить этикетку на эти новые столбцы Исправлена рентабельность инвестиций bleach и исправлена рентабельность инвестиций в управление.Далее нормализуется сигнал в рентабельности инвестиций bleach к фоновому коррекции сигнала в рентабельности управления. Разделите значения в столбце, помеченные исправленной рентабельностью инвестиций Bleach, значениями в столбце, помеченными Исправленной рентабельностью управления. Наклеить этикетку на эту новую колонку, нормализованную исправленную рентабельность инвестиций bleach.Затем нормализует сигнал в нормализованной исправленной колонке окупаемости bleach в среднем до пяти значений преблейга в рентабельности инвестиций Bleach. Разделите значения в столбце с пометкой Нормализованная исправленная рентабельность инвестиций bleach в среднем на пять значений преблейга в рентабельности инвестиций Bleach. Наклеить этикетку на эту новую колонку, нормализованную исправленную среднюю рентабельность инвестиций в отбеливание Prebleach.Наконец, откройте программу для обработки изображений. Кривая соответствует нормализованным и исправленным данным roi bleach путем копирования нормализованных исправленных значений рентабельности инвестиций отбеливателя и соответствующих значений времени. Вставьте их в окно Curve Fitter, выберите экспоненциальное восстановление из меню высадки Curve Fitter и выберите Fit.Здесь показано типичное видео восстановления флуоресценции после фотоотливов для клеток RAW264.7, обработанных LPS. Восстановление флуоресценции в пределах aggresome-как индуцированной структуры области интереса, медленно. В этом эксперименте используется фотоотлив для изучения степени подвижности p62.p62 флуоресценция в аггресомоподобных индуцированных структурах, преблейхе и постблехе, показана здесь. Как описано в этом видео, интенсивность флуоресценции можно отслеживать с течением времени. После коррекции фона и нормализации, флуоресценция p62 может быть рассчитана, чтобы описать мобильную фракцию как 22%-ную недвижимую долю как 78% и описывает перерыв восстановления в аггремоподобных индуцированных структурах, как 2,14 минуты.Помните, что особенно важно правильно определить область приобретения, представляющий интерес, так что она включает в себя ALIS интересов, контрольный регион, представляющий интерес, и фоновый регион, представляющий интерес. После этой процедуры могут применяться другие количественные методы флуоресцентной микроскопии, такие как потеря флуоресценции при фотоотбеле, FLIP и селективном фотоотбеле. В то время как FLIP измеряет степень непрерывности и связи между субклеточными отсеками, селективное фотоотлив обеспечивает кинетическую информацию об активной и пассивной транспортировке белков в органеллы или между богатыми белками областями.FRAP был первоначально разработан для количественной оценки бокового движения белков в клеточных мембранах. Впоследствии он был использован для количественной оценки подвижности белка внутри и между различными подклеточными отсеками, которые проложили путь для исследователей, чтобы ответить на вопросы в различных областях, включая клеточной и молекулярной биологии, биологии развития, неврологии, материаловедения, передовых биоматериалов, и открытие наркотиков.

Research

JoVE Journal

Biology

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

Окрашивание белков в гелях Кумасси G-250 без органических растворителей и уксусной кислоты

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Fluorescent Labeling of Drosophila Heart Structures

Fluorescent Labeling of Drosophila Heart Structures

Флуоресцентная маркировка Drosophila Структур сердца

The Drosophila melanogaster dorsal vessel, or heart, is a tubular structure comprised of a single layer of contractile cardiomyocytes, pericardial cells ...

Measuring Diffusion Coefficients via Two-photon Fluorescence Recovery After Photobleaching

Измерение коэффициентов диффузии через двухфотонной флуоресценции Восстановление после фотообесцвечивания

Multi-fluorescence recovery after photobleaching is a microscopy technique used to measure the diffusion coefficient (or analogous transport parameters) ...

Using the GELFREE 8100 Fractionation System for Molecular Weight-Based Fractionation with Liquid Phase Recovery

Использование GELFREE 8100 Фракционирование Система Молекулярный вес основе фракционирования с жидким этапе восстановления

The GELFREE 8100 Fractionation System is a novel protein fractionation system designed to maximize protein recovery during molecular weight based ...

Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection

Покадровый Визуализация Митоз После трансфекции миРНК

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and ...

Photobleaching Assays (FRAP &amp; FLIP) to Measure Chromatin Protein Dynamics in Living Embryonic Stem Cells

Photobleaching Assays FRAP & FLIP to Measure Chromatin Protein Dynamics in Living Embryonic Stem Cells

Фотообесцвечивания Анализы (FRAP и FLIP), чтобы измерить хроматина Динамика белков в живых эмбриональных стволовых клеток

Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) and Fluorescence Loss In Photobleaching (FLIP) enable the study of protein dynamics in living cells with ...

Determination of Lipid Raft Partitioning of Fluorescently-tagged Probes in Living Cells by Fluorescence Correlation Spectroscopy (FCS)

Determination of Lipid Raft Partitioning of Fluorescently-tagged Probes in Living Cells by Fluorescence Correlation Spectroscopy FCS

Определение липидного плота разделов флуоресцентно с метками зонды в живых клетках при флуоресцентной спектроскопии корреляции (FCS)

In the past fifteen years the notion that cell membranes are not homogenous and rely on microdomains to exert their functions has become widely accepted. ...

Intravital Microscopy for Imaging Subcellular Structures in Live Mice Expressing Fluorescent Proteins

Прижизненные микроскопия для визуализации субклеточных структур в живых мышей, экспрессирующих флуоресцентные белки

Here we describe a procedure to image subcellular structures in live rodents that is based on the use of confocal intravital microscopy. As a model organ, ...

Simultaneous Multicolor Imaging of Biological Structures with Fluorescence Photoactivation Localization Microscopy

Одновременное Многоцветный изображений биологических структур с флуоресцентной фотоактивации локализации микроскопии

Localization-based super resolution microscopy can be applied to obtain a spatial map (image) of the distribution of individual fluorescently labeled ...

Protein-protein Interactions Visualized by Bimolecular Fluorescence Complementation in Tobacco Protoplasts and Leaves

Белок-белковых взаимодействий визуализируется бимолекулярного флуоресценции комплементации табачными протопластов и листья

Many proteins interact transiently with other proteins or are integrated into multi-protein complexes to perform their biological function. Bimolecular ...