Name: fluorescence recovery after photobleaching of yellow fluorescent protein tagged p62 in aggresome-like induced structures
Uploaded: 2019-03-26T14:00:00
Duration: 12 min 58 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Fluorescence Recovery after Photobleaching of Yellow Fluorescent Protein Tagged p62 in Aggresome-like Induced Structures at JoVE.com

Agradecemos al Dr. Seth Robia en Loyola University Chicago por sus valiosos comentarios sobre este manuscrito. Este trabajo fue financiado por los NIH grant 1R01NS073967-01A1 a Joanna C. Bakowska.

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Los autores no tienen ningún conflicto de interés que revelar.

Proporcionamos un protocolo integral, práctico y sencillo paso a paso para FRAP experimentos con células vivas. Aquí, el protocolo se utilizó para medir la movilidad de YFP-p62 en ALIS en 264.7 macrófagos, pero se puede aplicar a muchos sistemas del microscopio confocal de escaneo láser y genéticamente codificado proteínas fluorescentes que están ahora disponibles. Para cualquier sistema de microscopía, experiencias piloto son fundamentales para determinar los parámetros óptimos de FRAP, incluyendo adquisición, lejía y tamaños de retorno de la inversión de control, intensidad de láser de fotoblanqueo y adquisición de imágenes prebleach y postbleach. Es razonable esperar que los parámetros óptimos del FRAP que difieren para cada línea de proteínas y células fluorescente genéticamente codificado.
Factores importantes a considerar cuando llevar a cabo un experimento FRAP incluyen (a) lograr adecuado bleach profundidad, (b) el uso de un breve paso blanqueo, postbleach de tiempo suficiente (c) que permite observar la recuperación completa, photobleaching (d) eficiencia, (e). citotoxicidad con FRAP y (f) la inclusión de un control para la pérdida de fluorescencia debido a la proyección de imagen repetida repetida. Se recomienda que la profundidad de bleach, que se puede calcular según la ecuación proporcionada en la sección 3.3.1, sea ≥ 9013. Cuando la profundidad de la lejía es < 90, a subestimar el grado de recuperación de fluorescencia postbleach y los valores de IfMfy t1/2 serán incorrectos. Aunque la duración e intensidad de los pulsos del láser de inducir la lejía pueden variar entre los experimentos FRAP, es importante que el paso de fotoblanqueo ser breve y sustancialmente más rápido que la función de recuperación de fluorescencia. Si no es así, podría ocurrir una cantidad importante de recuperación de fluorescencia durante la etapa de blanqueaba. Con un tiempo de mucho cloro, recuperación de fluorescencia durante la etapa de blanqueaba no se mediría, y daría lugar a mediciones erróneas de If, Mf, yt1/2. Además, para obtener valores correctos para If, Mf, yt1/2, la adquisición ROI debe observarse postbleach hasta que el nivel de fluorescencia en el blanqueador ROI ha alcanzado una meseta. Por ejemplo, en nuestros experimentos FRAP, no hubo diferencias entre laf, Mfy t1/2 valores cuando observamos YFP-p62 fluorescencia en el blanqueador ROI min 32,2 postbleach versus cuando observamos YFP-p62 en lejía y retorno de la inversión para postbleach min 15,1; así, concluimos que la función de recuperación alcanzado una meseta en el min 15,1 postbleach12. Con respecto a la eficacia de fotoblanqueo, photobleaching aumenta con el cuadrado del factor de zoom óptico de14. Así, el uso de lentes de zoom ópticos alta es favorable para el fotoblanqueo rápido pero puede resultar en fotoblanqueo indeseable durante la adquisición; Este último puede explicarse por un control de retorno de la inversión de imagen. Fotoblanqueo repetida debe evitarse ya que puede conducir a la generación de especies reactivas del oxígeno citotóxico (ROS). Sin embargo, el grado de generación de ROS debido a la exposición a un láser de alta intensidad es menor para las proteínas fluorescentes genéticamente codificadas que fluoróforos química (p. ej., anticuerpos fluorescentes)15, y los ROS generados son más propensos a reaccionar dentro de la proteína fluorescente genéticamente codificada que con otras moléculas en la célula4. Además de la mayor probabilidad de generar ROS citotóxicos, photobleaching repetido debe ser evitada ya que es difícil de controlar. Finalmente, aunque la transmisión de láser de baja se utiliza para adquirir imágenes de bleach no todos, algunos fotoblanqueo invariablemente ocurrirá, que deben ser controlados. Controles posibles para esto incluyen monitoreo de la fluorescencia en un control de retorno de la inversión en la adquisición de ROI, obtención de imágenes de control en una celda sin blanquear vecina y realizar experimentos de control con los valores idénticos para los que se utilizan en la photobleaching experimentos pero sin el evento de fotoblanqueo.

Recuperación de fluorescencia después de photobleaching (FRAP) es una técnica de microscopía que puede utilizarse para cuantificar la dinámica de la proteína en vivo las células1,2. La popularidad de FRAP ha aumentado debido a la amplia disponibilidad comercial de láser de barrido confocales Microscopios con alta resolución, velocidad y sensibilidad, y un "arco iris" de codificado genéticamente las proteínas fluorescentes, como el verde fluorescente la proteína (GFP) y proteína fluorescente amarilla (YFP)3. Proteínas fluorescentes genéticamente codificadas están fusionadas a la proteína de interés para permitir la localización subcelular de la proteína de interés. En un experimento típico de FRAP, se observa la fluorescencia de estado estacionario en una región de interés (ROI) dentro de una célula de adquisición vía proyección de imagen repetida de ROI con luz láser de baja intensidad. Posteriormente, las moléculas fluorescentes son rápidamente e irreversiblemente deterioradas en un subconjunto predefinido de la adquisición de ROI, en adelante el retorno de la inversión, el blanqueador por la breve exposición a la luz de láser de alta intensidad. Como nuevas proteínas sin blanquear reponer proteínas decoloradas con el tiempo, la velocidad y la intensidad de la recuperación de la fluorescencia en el blanqueador ROI proporciona información sobre la proteína movilidad (figura 1)4.
Nuestro interés en la determinación de la movilidad de la ubiquitina Unión proteína p62 (también conocido como sequestosome-1) en aggresome inducidas estructuras (ALIS) en macrófagos murinos de 264.7 después de estimulación con lipopolisacáridos (LPS) nos llevó a revisar el FRAP literatura. Desafortunadamente, muchos de los protocolos existentes de FRAP son incompletos o excesivamente complejos5,6,7,8,9. Algunos no proporcionan toda la información sobre la configuración de láser, haz ruta configuración e imagen adquisición parámetros5,6,7,8,9. Otros omiten detalles claves sobre análisis de datos, como forma de abordar el tema de bleach ROI deriva6,9 o cómo calcular los parámetros de recuperación importante, incluyendo la fracción móvil (Mf), la fracción inmóvil (If) y tiempo de recuperación (t½)5,7. Por el contrario, otros colocan mucho énfasis en complejas fórmulas matemáticas para calcular Mf,fy t1/25,6,8,9. Por lo tanto, nuestro propósito es proporcionar un protocolo integral, práctico y sencillo paso a paso para FRAP experimentos con células vivas.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:835px;" width="835">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium</td>
			<td style="width:211px;">Hyclone</td>
			<td style="width:137px;">SH30022.01</td>
			<td style="width:167px;">High Glucose (4.5 g/L)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Fetal bovine serum</td>
			<td style="width:211px;">Gemini Bio-Products</td>
			<td style="width:137px;">100-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Glass bottom dishes</td>
			<td style="width:211px;">MatTek</td>
			<td style="width:137px;">P35G-1.5-14-C</td>
			<td>35-mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Image J software</td>
			<td style="width:211px;">National Institutes of Health</td>
			<td style="width:137px;">N.A.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Lipopolysaccharide (LPS)</td>
			<td style="width:211px;">Sigma</td>
			<td style="width:137px;">L4391</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Nocodazole</td>
			<td style="width:211px;">Sigma</td>
			<td style="width:137px;">M1404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Penicillin-streptomycin solution</td>
			<td style="width:211px;">Corning</td>
			<td style="width:137px;">30-002-Cl</td>
			<td>100&#215;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Plan-Apochromat 63&#215;/1.40 oil objective</td>
			<td style="width:211px;">Carl Zeiss MicroImaging, Inc</td>
			<td style="width:137px;">4407629904000000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Polyethylenimine (PEI)</td>
			<td style="width:211px;">Polysciences</td>
			<td style="width:137px;">23966-1</td>
			<td>linear (MW 25,000)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">RAW 264.7 murine macrophages</td>
			<td style="width:211px;">ATCC</td>
			<td style="width:137px;">TIB-71</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Zeiss confocal microscope</td>
			<td style="width:211px;">Carl Zeiss MicroImaging, Inc</td>
			<td style="width:137px;">LSM 510</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fluorescence recovery after photobleaching of yellow fluorescent protein tagged p62 in aggresome-like induced structures

Recuperación de fluorescencia Tras Fotoblanqueo (FRAP) es una técnica de microscopía que puede utilizarse para cuantificar la movilidad de la proteína en células vivas. En un experimento típico de FRAP, fluorescencia de estado estacionario se observa por proyección de imagen repetida con luz láser de baja intensidad. Posteriormente, las moléculas fluorescentes se deterioran rápidamente e irreversiblemente a través de la breve exposición a la luz de láser de alta intensidad. Información sobre movilidad de la proteína se obtiene mediante el control de la recuperación de la fluorescencia. Utilizamos FRAP para determinar la movilidad de p62 en aggresome inducidas estructuras (ALIS) en macrófagos murinos Tras estimulación con lipopolisacáridos (LPS). Porque muchos protocolos FRAP existentes son incompletos o complejo, nuestra meta era proporcionar un protocolo integral, práctico y sencillo paso a paso para FRAP experimentos con células vivas. Aquí, describimos 264.7 transfección de macrófagos con amarillo fluorescente proteína-p62 (YFP-p62), inducción de ALIS exponiendo las células LPS y un método paso a paso para la recolección de prebleach y postbleach FRAP imágenes y análisis de datos. Finalmente, se discuten factores importantes a considerar al realizar un experimento FRAP.

Se muestran aquí los resultados de un experimento típico en el cual utilizamos FRAP para examinar el grado de movilidad de p62 en ALIS en 264.7 células tratadas con LPS para 3-5 h12. Figura 3 A se muestran los datos crudos obtenidos de un blanqueador, control y retorno de la inversión del fondo después de que la pila de imágenes había sido alineada para corregir pequeñas cantidades (< ~ 3 μm) de deriva de la imagen de los ALIS. Fluorescencia de YFP-p62 en este ALIS en prebleach y postbleach se muestra en la figura 3E y 1 de Video suplementaria. Figura 3 B muestra estos datos después de la corrección de fondo. Figura 3 C muestra estos datos después de corregir por fluorescencia en el control de retorno de la inversión. Figura 3 D muestra estos datos normalizados a la fluorescencia promedio de los 5 valores prebleach de lejía y ROI. El grado de blanqueamiento era suficiente en este experimento (bleach profundidad = 91.94). Fluorescencia de YFP-p62 dentro esta ALIS se recuperó lentamente, como t1/2 = 128.27 s (min 2,14). YFP-p62 no era una proteína muy móvil en este experimento, como Mf = 21.97 y If = 78.03.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59288/59288fig1.jpg"> Figura 1 : Un diagrama de una célula 264.7 y pasos para el análisis de la imagen después de que las imágenes FRAP han sido alineadas para corregir para la deriva de la imagen de los ALIS. (A) esquema de una célula de 264.7 representando varios ALIS y la lejía, control y ROIs de fondo en la adquisición de ROI. (B) una descripción idealizada del FRAP crudo datos obtienen en el blanqueador, el control y el fondo ROIs en panel A. (C) una gráfica idealizada de FRAP datos que han sido corregidos por el fondo. (D) un gráfico idealizado de corrección de fondo FRAP datos que han sido normalizados a fluorescencia en el control de retorno de la inversión. (E) un idealizado gráfico de datos FRAP normalizados y corrección de fondo que han sido normalizados a la fluorescencia prebleach en lejía y ROI. Abreviaturas: Con = control; BG = fondo. Esta figura fue modificada de Rabut y Ellenberg4. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59288/59288fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59288/59288fig2.jpg"> Figura 2: Imágenes de la interfaz de usuario en el software objetivo (tabla de materiales) para la selección del láser, haz ruta configuración y parámetros de adquisición de imagen para los experimentos FRAP. Láser (A) control de pantalla que muestra las líneas de láser argón/2, con salida y corriente del tubo utilizado. (B) configuración control de pantalla que muestra la viga splitter y emisión filtro de configuración utilizada. (C) la exploración control de pantalla que muestra la configuración utilizada para la adquisición de la imagen. (D) exploración control de pantalla que muestra el agujero de alfiler, detector ganancia, offset del amplificador, ganancia del amplificador y configuración de la transmisión de la línea de láser argón/2 514 nm. (E) control de series de tiempo pantalla que muestra la configuración de serie de tiempo utilizada. Bleach (F) control de pantalla que muestra la prebleach y postbleach parámetros utilizados. Abreviaturas: HFT = Haupt Farb Teiler (divisor de haz dicroicos primaria); NT1 = Neben Farb Teiler 1 (primera secundaria dicroico beam splitter); NT2 = Neben Farb Teiler 2 (divisor de haz dicroicos segundo secundaria); EF = filtro de emisión. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59288/59288fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59288/59288fig3.jpg"> Figura 3 : Un experimento representativo de FRAP para estudiar dinámica YFP-p62 en ALIS en 264.7 células. (A) crudo fluorescencia intensidad los datos para un blanqueador, control y retorno de la inversión del fondo. (B) los datos indicados en el panel A, después de que el blanqueador y el control de retorno de la inversión habían sido corregidos por fluorescencia en el fondo, el retorno de la inversión. (C) los datos que figuran en los paneles A y B después de la normalización de la intensidad de fluorescencia en el blanqueador ROI para tener en cuenta la fluorescencia en el control de corrección de fondo ROI. (D) los datos en paneles A-C después de la normalización de la intensidad de fluorescencia en el blanqueador normalizado y corregir de fondo ROI a la media de los 5 primeros valores prebleach en el blanqueador, el retorno de la inversión. Mf = 21.97, If = 78.03, t1/2 = 128.27 s (min 2,14) y blanqueo profundidad = 91.94. (E) una imagen de un ALIS prebleach (1,5 minutos) y postbleach (0, 6 y 16 min). Barra de escala = 5 μm y es válida para todos los paneles. Abreviaturas: Con = control; BG = fondo; Corr. = corregido; Norma. = normalizado; Prom. = promedio. Esta figura fue modificada de Cabe et al12<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59288/59288fig3large.jpg" target="_blank">haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Supplementary Video 1" src="/files/ftp_upload/59288/59288supvideo1.jpg"> 1 Video complementario: un típico ALIS en macrófago 264.7 antes y después de photobleaching. Fluorescencia de YFP-p62 es lenta para recuperarse después de la photobleach; por lo tanto, p62 no es una proteína muy móvil. Para este experimento, Mf = 25.62, If = 74.38, t1/2 = 442.79 s (7,38 min) y profundidad de bleach = 90.19. Barra de escala = 5 μm. Este video fue modificado de Cabe et al12<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59288/Fig_4-Vid_FINAL.avi" target="_blank">por favor haga clic aquí para ver este video. (Clic derecho para descargar)</a>

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Fluorescence Recovery after Photobleaching of Yellow Fluorescent Protein Tagged p62 in Aggresome-like Induced Structures

Recuperación de fluorescencia Tras Fotoblanqueo de amarillo fluorescente proteína Tagged p62 en estructuras Aggresome inducida por

Se describe un protocolo completo y práctico para la recuperación de fluorescencia después de photobleaching experimentos con células en vivo. Aunque el protocolo fue utilizado para medir la movilidad de amarillo fluorescente p62 etiquetado proteína de aggresome-como las estructuras inducidas, puede ser aplicado a una variedad de sistemas de microscopía y proteínas fluorescentes.

Fluorescence recovery after photobleaching (FRAP)&#160;is a microscopy technique that can be used to quantify protein mobility in live cells. In a typical ...

La recuperación de fluorescencia existente después de la fotoblancada, los protocolos FRAP, son incompletos o demasiado complejos. El protocolo presentado en este video es significativo en que es completo, práctico y directo. La principal ventaja de esta técnica FRAP es que permite cuantificar la movilidad proteica dentro y entre compartimentos subcelulares en células vivas.FraP se está estudiando tanto para fines terapéuticos como diagnósticos. Uno de estos usos es cuantificar la difusión dentro de los sistemas de administración de fármacos en diferentes tejidos in vivo. Esta información puede utilizarse para optimizar una estructura y composición de fármacos.La técnica de microscopía FRAP ha proporcionado información sobre una amplia gama de campos en los que la comprensión del fenómeno de la difusión es de interés. Estos incluyen biología celular y molecular, biología del desarrollo, neurociencia, ciencia de materiales, biomateriales avanzados y descubrimiento de fármacos. Aunque el protocolo descrito es para su uso con células de mamíferos, los conceptos se pueden aplicar a otros sistemas, como células vegetales, células de levadura y bacterias.Un individuo que nunca ha realizado esta técnica puede tener problemas para determinar los parámetros óptimos de adquisición de imágenes, crear una región de adquisición de interés que sea adecuada para su experimento y calcular la fracción móvil y el medio tiempo de recuperación. Al intentar este procedimiento por primera vez, asegúrese de realizar varios experimentos piloto para optimizar el protocolo en el contexto de los objetivos del experimento. Demostrando el procedimiento estarán Maleen Cabe, un técnico de mi laboratorio, y David Rademacher, el gerente de la instalación de imágenes.Para empezar, prepare una placa de macrófagos RAW264.7 trans infectados YFP-p62 y trátelos con Lipopolisacárido como se describe en el protocolo de texto adjunto. A continuación, enjuague las células tratadas con el tampón de Tyrode un poco frío. Luego, agregue dos mililitros de tampón de Tyrode suplementado con Nocodazol a la placa, y permita que las placas se incuban a cuatro grados centígrados durante 15 a 20 minutos antes de la toma de imágenes y el análisis frap.Deje que las placas se incuban a cuatro grados centígrados durante 15 a 20 minutos antes del diagnóstico y análisis frap de FRAP. En la configuración de imágenes, seleccione la línea de 514 nanómetros del láser Argon/2, ya que el marcador de fluorescencia tiene una excitación máxima a 512 nanómetros y una emisión máxima a 527 nanómetros. A continuación, en la ventana Control láser, haga clic en Argon/2, 458, 477, 488, 514 y, a continuación, haga clic en el botón En espera.Después de esperar unos tres minutos para que el láser se caliente, haga clic en el botón Activado. A continuación, ajuste la potencia láser del láser al 100% y pulse Intro. A continuación, establezca la transmisión de la línea láser en 5% En el microscopio, gire al objetivo de aceite de aumento de 63x de aumento de Plan-Apochromat 63x 1.40.Vea el espécimen a través del ocular del microscopio y coloque una estructura inducida similar a la agregosa en el centro del campo de visión. A continuación, en el software de adquisición, establezca el tamaño del fotograma en 512 por 512 píxeles, la velocidad de escaneo en ocho y la profundidad de datos en 12 bits. Establezca también el promedio de escaneo en uno, el zoom óptico a tres y pulse Intro.A continuación, se el agujero a 1.95 unidades de error y la ganancia del detector a 582, que está justo por debajo de la saturación. Cree una región de interés en forma cuadrada para la adquisición de imágenes, que tenga las dimensiones de 150 por 150 píxeles. Configure la serie temporal de forma que la región de interés se escanee 35 veces, una vez cada 30 segundos.A continuación, establezca el control de lejía de modo que el fotoblancada se produzca después del escaneo número cinco, para recoger cinco imágenes de prebleach de la región de interés. Pulse la tecla Intro para confirmar. A continuación, vaya a la ventana Regiones de lejía y cree una región de lejía en forma circular de interés dentro del área de estructura inducida similar a la agregosa, que tiene un diámetro de 10 píxeles.Ahora, establezca el número de iteraciones en 300 y vuelva a pulsar la tecla Intro. A continuación, establezca la línea láser en 100% de potencia e introduzca 100 en el campo de porcentaje de transmisión para el láser y pulse Intro. Por último, ejecute el programa de adquisición de imágenes para recopilar datos FRAP de 10 estructuras inducidas similares a los agregadores en 10 celdas con menos de tres micras de deriva.Para comenzar el análisis de datos, primero transfiera los archivos AIM lsm a un ordenador personal para el análisis de datos. Corrija la deriva de la imagen alineando o haciendo coincidir la pila de imágenes de series temporales de la región de adquisición de interés abriendo cada archivo AIM lsm con un programa de procesamiento de imágenes. A continuación, seleccione Plugins, Registration, StackReg y Translation, seguido de plugins, registration, StackReg y, a continuación, Rigid Body.A continuación, configure el gestor de la región de interés para medir la intensidad de la señal en la región de lejía de interés. Para ello, seleccione la herramienta ovalada, luego dibuje un círculo en la región de lejía de interés con un diámetro de 10 píxeles y, a continuación, haga clic en el botón Agregar. Una vez añadido, configure el programa para medir la intensidad de la señal en la región de control de interés.Seleccione la herramienta rectángulo, luego dibuje un cuadrado de 20 por 20 píxeles en la región de control y haga clic en el botón Agregar. Por último, configure el gestor de la región de interés para medir la intensidad de la señal en la región de fondo de interés. Seleccione la herramienta rectángulo, dibuje un cuadrado de 20 por 20 píxeles en la región de fondo y, a continuación, haga clic en el botón Agregar.Después de agregar las regiones que se analizarán en ROI Manager, cámbieles el nombre de Bleach ROI, Control ROI y Background ROI, en consecuencia. Mida la intensidad de la señal en cada región. Para lograr esto, seleccione Bleach ROI, Control ROI y Background ROI y, a continuación, vaya a Más y seleccione Multi Measure.Pegue los resultados en una hoja de cálculo en columnas etiquetadas como Bleach ROI, Control ROI y Background ROI, respectivamente. Comience por corregir en segundo plano la intensidad de la señal en el ROI de Bleach y el ROI de control restando los valores de la columna roi de fondo de los valores de la columna con la etiqueta Bleach ROI y la columna denominada Control ROI. Etiquete estas nuevas columnas Corrected Bleach ROI y Corrected Control ROI.A continuación, normalice la señal en el ROI de Bleach a la señal corregida en segundo plano en el ROI de control. Divida los valores de la columna denominada CORREGIDOr ROI de blanqueo por los valores de la columna denominada ROI de control corregido. Etiquete esta nueva columna, Normalized Corrected Bleach ROI.A continuación, normalice la señal de la columna ROI de lejía corregida normalizada al promedio de los cinco valores de prebleach en el ROI de Bleach. Divida los valores de la columna denominada Normalized Corrected Bleach ROI por el promedio de los cinco valores de prebleach en el ROI de Bleach. Etiquete esta nueva columna, Normalized Corrected Prebleach Average Bleach ROI.Por último, abra un programa para el procesamiento de imágenes. La curva ajusta los datos de ROI de lejía normalizados y corregidos copiando los valores de ROI corregidos de postbleach y los valores de tiempo correspondientes. Péguelos en la ventana De ajuste de curva, seleccione recuperación exponencial en el menú desplegable Ajustar curva y seleccione Ajustar.Aquí se muestra un video típico de recuperación de fluorescencia después de la fotoblancada para células RAW264.7 tratadas con LPS. La recuperación de la fluorescencia dentro de la región de estructura inducida por el agreso de interés, es lenta. Este experimento utiliza el fotoblanquido para examinar el grado de movilidad de p62.la fluorescencia p62 en las estructuras inducidas similares a los agresos, prebleach y postbleach, se muestra aquí. Como se describe en este video, la intensidad de la fluorescencia se puede rastrear con el tiempo. Después de la corrección y normalización de fondo, la fluorescencia p62 se puede calcular para describir la fracción móvil como 22% la fracción inmóvil como 78% y describe el tiempo medio de recuperación dentro de las estructuras inducidas similares a los agregadores, como 2.14 minutos.Recuerde que es especialmente importante definir adecuadamente la región de adquisición de interés para que incluya un ALIS de interés, una región de control de interés y una región de fondo de interés. Después de este procedimiento, se pueden aplicar otras técnicas cuantitativas de microscopía fluorescente, como la pérdida de fluorescencia en el fotoblancar, FLIP y fotoblancar selectivamente. Mientras que FLIP mide el grado de continuidad y comunicación entre los compartimentos subcelulares, el fotoblanchado selectivo proporciona información cinética sobre el transporte activo y pasivo de proteínas a orgánulos, o entre áreas ricas en proteínas.FRAP fue desarrollado inicialmente para cuantificar el movimiento lateral de proteínas en las membranas celulares. Posteriormente, se ha utilizado para cuantificar la movilidad de proteínas dentro y entre una variedad de compartimentos subcelulares, lo que allanó el camino para que los investigadores respondieran a preguntas en una variedad de campos, incluyendo biología celular y molecular, biología del desarrollo, neurociencia, ciencia material, biomateriales avanzados y descubrimiento de fármacos.

Research

JoVE Journal

Biology

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

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Investigación

Biología

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