Name: fluorescence recovery after photobleaching of yellow fluorescent protein tagged p62 in aggresome-like induced structures
Uploaded: 2019-03-26T14:00:00
Duration: 12 min 58 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Fluorescence Recovery after Photobleaching of Yellow Fluorescent Protein Tagged p62 in Aggresome-like Induced Structures at JoVE.com

Vi tackar Dr. Seth Robia på Loyola University Chicago för hans värdefulla kommentarer på detta manuskript. Detta arbete stöds av NIH grant 1R01NS073967-01A1 till Joanna C. Bakowska.

<ol>
	<li>Axelrod, D., Koppel, D. E., Schlessinger, J., Elson, E., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mobility+measurement+by+analysis+of+fluorescence+photobleaching+recovery+kinetics.">Mobility measurement by analysis of fluorescence photobleaching recovery kinetics.</a> Biophysical Journal. 16 (9), 1055-1069 (1976).</li><li>Peters, R., Peters, J., Tews, K. H., Bahr, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microfluorimetric+study+of+translational+diffusion+in+erythrocyte+membranes.">A microfluorimetric study of translational diffusion in erythrocyte membranes.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 367 (3), 282-294 (1974).</li><li>Patterson, G., Day, R. N., Piston, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+protein+spectra.">Fluorescent protein spectra.</a> Journal of Cell Science. 114, 837-838 (2001).</li><li>Rabut, G., Ellenberg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photobleaching+techniques+to+study+mobility+and+molecular+dynamics+of+proteins+in+live+cells:+FRAP,+iFRAP,+and+FLIP.">Photobleaching techniques to study mobility and molecular dynamics of proteins in live cells: FRAP, iFRAP, and FLIP.</a> Live Cell Imaging: A Laboratory Manual (1st ed). , 101-126 (2004).</li><li>Fritzsche, M., Charras, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+protein+reaction+dynamics+in+living+cells+by+fluorescence+recovery+after+photobleaching.">Dissecting protein reaction dynamics in living cells by fluorescence recovery after photobleaching.</a> Nature Protocols. 10 (5), 660-680 (2015).</li><li>Goodwin, J. S., Kentworthy, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photobleaching+approaches+to+investigate+diffusional+mobility+and+trafficking+of+Ras+in+living+cells.">Photobleaching approaches to investigate diffusional mobility and trafficking of Ras in living cells.</a> Methods. 37 (2), 154-164 (2005).</li><li>Hildick, K. L., Gonz&#224;lez-Gonz&#224;lez, I. M., Jaskolski, F., Henley, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lateral+diffusion+and+exocytosis+of+membrane+proteins+in+cultured+neurons+assessed+using+fluorescence+recovery+and+fluorescence-loss+photobleaching.">Lateral diffusion and exocytosis of membrane proteins in cultured neurons assessed using fluorescence recovery and fluorescence-loss photobleaching.</a> Journal of Visualized Experiments. (60), e3747 (2012).</li><li>Nissim-Rafinia, M., Meshorer, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photobleaching+assays+(FRAP+&amp;+FLIP)+to+measure+chromatin+protein+dynamics+in+living+embryonic+stem+cells.">Photobleaching assays (FRAP &amp; FLIP) to measure chromatin protein dynamics in living embryonic stem cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (52), e2696 (2011).</li><li>Zheng, C., Petralia, R. S., Wang, Y., Kachar, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+recovery+after+photobleaching+(FRAP)+of+fluorescence+tagged+proteins+in+dendritic+spines+of+cultured+hippocampal+neurons.">Fluorescence recovery after photobleaching (FRAP) of fluorescence tagged proteins in dendritic spines of cultured hippocampal neurons.</a> Journal of Visualized Experiments. (50), e2568 (2011).</li><li>Thevenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+pyramid+approach+to+subpixel+registration+based+on+intensity.">A pyramid approach to subpixel registration based on intensity.</a> IEEE Transactions on Image Processing. 7 (1), 27-41 (1998).</li><li>Ishikawa-Ankerhold, H. C., Ankerhold, R., Drummen, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+fluorescence+microscopy+techniques--FRAP,+FLIP,+FLAP,+FRET+and+FLIM.">Advanced fluorescence microscopy techniques--FRAP, FLIP, FLAP, FRET and FLIM.</a> Molecules. 17 (4), 4047-4132 (2012).</li><li>Cabe, M., Rademacher, D. J., Karlsson, A. B., Cherukuri, S., Bakowska, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PB1+and+UBA+domains+of+p62+are+essential+for+aggresome-like+induced+structure+formation.">PB1 and UBA domains of p62 are essential for aggresome-like induced structure formation.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 503 (4), 2306-2311 (2018).</li><li>Brown, E. B., Wu, E. S., Zipfel, W., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+molecular+diffusion+in+solution+by+multiphoton+fluorescence+photobleaching+recovery.">Measurement of molecular diffusion in solution by multiphoton fluorescence photobleaching recovery.</a> Biophysical Journal. 77 (5), 2837-2849 (1999).</li><li>Centonze, V., Pawley, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tutorial+on+practical+confocal+microscopy+and+the+use+of+the+confocal+test+specimen.">Tutorial on practical confocal microscopy and the use of the confocal test specimen.</a> Handbook of biological confocal microscopy. , 549-570 (1995).</li><li>Chudakov, D. M., Matz, M. V., Lukyanov, S., Lukyanov, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+proteins+and+their+applications+in+imaging+living+cells+and+tissues.">Fluorescent proteins and their applications in imaging living cells and tissues.</a> Physiological Reviews. 90 (3), 1103-1163 (2010).</li></ol>

Författarna har ingen intressekonflikt att avslöja.

Vi tillhandahåller ett omfattande, praktisk och enkel steg för steg protokoll för FRAP experiment med levande celler. Häri, protokollet användes för att mäta YFP-p62 i ALIS rörlighet i RAW264.7 makrofager, men det kan tillämpas på många av de laserscanning confocal Mikroskop system och genetiskt kodade fluorescerande proteiner som finns nu. För mikroskopi system är pilotförsök avgörande för att fastställa de optimala FRAP-parametrar, inklusive förvärv, blekmedel och kontroll ROI storlekar, laser intensitet för fotoblekning och prebleach och postbleach bild förvärv. Det är rimligt att förvänta sig de optimala FRAP parametrarna skiljer sig för varje genetiskt kodade fluorescerande protein och cell linje.
Viktiga faktorer att beakta när genomför en FRAP experiment inkluderar (a) att uppnå lämplig blekmedel djup, (b) användning av ett kort blekning steg, (c) tillåta tillräcklig tid postbleach att observera den fullständig återhämtning funktion, d fotoblekning effektivitet, (e). cytotoxicitet med upprepade FRAP, och (f) införandet av en kontroll för fluorescens förlust på grund av upprepade imaging. Vi rekommenderar att blekmedel djup, som kan beräknas enligt ekvation som anges i avsnitt 3.3.1, ≥9013. När blekmedel djup är < 90, graden av postbleach fluorescens återhämtning kommer att underskattas, och värdena av If, Mfoch t1/2 blir felaktiga. Även om varaktighet och intensitet av blekmedel-inducerande laser pulserna kan variera mellan FRAP experiment, är det viktigt att fotoblekning steg bli kort och väsentligen snabbare än fluorescens recovery funktion. Om det inte är, kunde då en betydande mängd fluorescens återhämtning uppstå under blekning steg. Med en lång blekmedel tid, fluorescens återhämtning under blekning steg inte skulle mätas, och det skulle leda till felaktiga mätningar av If, Mf, ocht1/2. Förutom att få korrekta värden för If, Mf, ocht1/2, förvärvet ROI bör observeras postbleach tills fluorescens i blekmedel ROI har nått en platå. Till exempel i vår FRAP experiment, fanns ingen skillnad mellan I-f, Mfoch t1/2 värden när vi observerade YFP-p62 fluorescens i blekmedel ROI för 32,2 min postbleach kontra när vi observerat YFP-p62 i blekmedel ROI för 15,1 min postbleach; Således fann vi att funktionen återställning nått en platå på 15,1 min postbleach12. När det gäller fotoblekning effektivitet ökar fotoblekning med kvadraten av optisk zoom faktor14. Således, användning av hög optisk zoom objektiv är gynnsam för snabb fotoblekning men kan resultera i oönskade fotoblekning under förvärvet; den senare kan förklaras av imaging en kontroll ROI. Upprepade fotoblekning ska undvikas eftersom det kan leda till generation av cytotoxiska reaktiva syreradikaler (ROS). Men graden av ROS generation på grund av exponering för en hög intensitet laser är lägre för genetiskt kodade fluorescerande proteiner än för kemiska fluorophores (t.ex. fluorescerande antikroppar)15och ROS genereras är mer benägna att reagera inom det genetiskt kodade fluorescerande proteinet än med andra molekyler i cell4. Förutom den ökade sannolikheten för att generera cytotoxiska ROS, är upprepade fotoblekning som skall undvikas eftersom det är svårt att styra. Slutligen, även om låga laser överföring används för att förvärva alla icke-bleka bilder, vissa fotoblekning alltid inträffar, som måste kontrolleras. Eventuella kontroller för detta inkluderar övervakning fluorescens i en kontroll ROI inom förvärvet ROI, få kontroll bilder i en närliggande oblekt cell och utför kontroll experiment med identiska inställningar för dem som används i den fotoblekning experiment men utan händelsen fotoblekning.

Fluorescens återhämtning efter fotoblekning (FRAP) är en mikroskopi teknik som kan användas för att kvantifiera protein dynamik i levande celler1,2. FRAP popularitet har ökat på grund av den utbredda kommersiella tillgången till laserscanning confocal Mikroskop med hög upplösning, hastighet och känslighet, och en ”rainbow” av genetiskt kodade fluorescerande proteiner, såsom grön fluorescerande protein (GFP) och gula fluorescerande protein (YFP)3. Genetiskt kodade fluorescerande proteiner är smält till ett protein av intresse att möjliggöra subcellulär lokalisering av proteinet av intresse. I en typisk FRAP experiment observeras steady state fluorescensen i ett förvärv region av intresse (ROI) i en cell via upprepade avbildning av att ROI med låg intensitet laserljus. Därefter är fluorescerande molekylerna snabbt och oåterkalleligt försämras i en fördefinierad undergrupp av förvärvet ROI, hädanefter blekmedel ROI, av kort exponering för hög intensitet laserljus. Som nya oblekt proteiner fylla på blekt proteiner över tid, ger hastighet och intensitet av fluorescens återhämtning i blekmedel ROI information om protein rörlighet (figur 1)4.
Vårt intresse för bestämning av ubiquitin bindande protein p62 (även känd som sequestosome-1) i aggresome-liknande inducerad strukturer (ALIS) i murina RAW264.7 makrofager rörlighet efter stimulering med lipopolysackarid (LPS) ledde oss att granska FRAP litteratur. Tyvärr, många av de befintliga FRAP-protokoll är ofullständiga eller orimligt komplexa5,6,7,8,9. Några ger inte detaljerad information om laser inställningar, beam sökvägen konfiguration och bild förvärv parametrar5,6,7,8,9. Andra utelämnas viktiga detaljer rörande analys av data, till exempel hur frågan om blekmedel ROI drift6,9 eller att beräkna viktiga återhämtning parametrar, inklusive mobila bråkdel (Mf), orörliga bråkdel (Jagf), och halvtid återhämtning (t½)5,7. Däremot andra placeras alltför stor vikt vid komplexa matematiska formler för att beräkna Mf, jagfoch t1/25,6,8,9. Vårt syfte är således att ge en omfattande, praktisk och enkel steg för steg-protokollet för FRAP experiment med levande celler.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:835px;" width="835">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium</td>
			<td style="width:211px;">Hyclone</td>
			<td style="width:137px;">SH30022.01</td>
			<td style="width:167px;">High Glucose (4.5 g/L)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Fetal bovine serum</td>
			<td style="width:211px;">Gemini Bio-Products</td>
			<td style="width:137px;">100-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Glass bottom dishes</td>
			<td style="width:211px;">MatTek</td>
			<td style="width:137px;">P35G-1.5-14-C</td>
			<td>35-mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Image J software</td>
			<td style="width:211px;">National Institutes of Health</td>
			<td style="width:137px;">N.A.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Lipopolysaccharide (LPS)</td>
			<td style="width:211px;">Sigma</td>
			<td style="width:137px;">L4391</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Nocodazole</td>
			<td style="width:211px;">Sigma</td>
			<td style="width:137px;">M1404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Penicillin-streptomycin solution</td>
			<td style="width:211px;">Corning</td>
			<td style="width:137px;">30-002-Cl</td>
			<td>100&#215;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Plan-Apochromat 63&#215;/1.40 oil objective</td>
			<td style="width:211px;">Carl Zeiss MicroImaging, Inc</td>
			<td style="width:137px;">4407629904000000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Polyethylenimine (PEI)</td>
			<td style="width:211px;">Polysciences</td>
			<td style="width:137px;">23966-1</td>
			<td>linear (MW 25,000)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">RAW 264.7 murine macrophages</td>
			<td style="width:211px;">ATCC</td>
			<td style="width:137px;">TIB-71</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Zeiss confocal microscope</td>
			<td style="width:211px;">Carl Zeiss MicroImaging, Inc</td>
			<td style="width:137px;">LSM 510</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fluorescence recovery after photobleaching of yellow fluorescent protein tagged p62 in aggresome-like induced structures

Fluorescens återhämtning efter fotoblekning (FRAP) är en mikroskopi teknik som kan användas för att kvantifiera protein rörlighet i levande celler. I en typisk FRAP experiment observeras steady state fluorescens av upprepade imaging med låg intensitet laserljus. Därefter är de fluorescerande molekylerna snabbt och oåterkalleligt nedsatt via kort exponering för högintensiva laserljuset. Information om protein rörlighet erhålls genom övervakning återvinning av fluorescens. Vi använde FRAP för att bestämma rörligheten för p62 i aggresome-liknande inducerad strukturer (ALIS) i murina makrofager efter stimulering med lipopolysackarid (LPS). Eftersom många befintliga FRAP protokoll är antingen ofullständiga eller komplexa, var vårt mål att tillhandahålla ett omfattande, praktisk och enkel steg för steg protokoll för FRAP experiment med levande celler. Här beskriver vi RAW264.7 makrofag transfection med gula fluorescerande protein-p62 (YFP-p62), induktion av ALIS genom att utsätta celler till LP-skivor, och en stegvis metod för att samla in prebleach och postbleach FRAP bilder och dataanalys. Slutligen diskuterar vi viktiga faktorer att beakta när man genomför en FRAP experiment.

Här visas resultatet av en typisk experiment där vi använde FRAP för att undersöka graden av rörlighet p62 i ALIS i RAW264.7 celler behandlas med LPS för 3-5 h12. Figur 3 A visar rådata från ett blekmedel, styra och bakgrund ROI efter stacken bilder hade anpassats för att korrigera för små mängder (< ~ 3 µm) av bilden drivan av ALIS. YFP-p62 fluorescens i denna ALIS på prebleach och postbleach visas i figur 3E och kompletterande Video 1. Figur 3 B visar dessa data efter bakgrund-korrigering. Figur 3 C visar dessa data efter korrigering för fluorescens i kontrollen ROI. Figur 3 D visar dessa data normaliserad till genomsnittlig fluorescensen av 5 prebleach värdena i blekmedel ROI. Graden av blekning var tillräcklig i detta experiment (blekmedel djup = 91.94). YFP-p62 fluorescens inom denna ALIS återhämtade sig långsamt, som t1/2 = 128.27 s (2.14 min). YFP-p62 var inte en mycket mobil protein i detta experiment, som Mf = 21,97 och jagf = 78.03.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59288/59288fig1.jpg"> Figur 1 : Ett diagram över en RAW264.7 cell och steg för bildanalys efter FRAP bilder har anpassats för att korrigera för bild drivan av ALIS. (A) Diagram över en RAW264.7 cell som skildrar flera ALIS och blekmedel, kontroll och bakgrunden ROIs inom förvärvet ROI. (B) en idealiserade skildring av rå FRAP data erhållits i blekmedel, kontroll och bakgrund ROIs i panelen A. (C) en idealiserad grafen av FRAP-rådata som varit bakgrundskorrigerade. (D) en idealiserad grafen av bakgrundskorrigerade FRAP data som har varit normaliserad till fluorescens i kontrollen ROI. (E) en idealiserad diagram normaliserat och bakgrundskorrigerade FRAP-data som har varit normaliserad till prebleach fluorescensen i blekmedel ROI. Förkortningar: Con = kontroll; BG = bakgrund. Denna siffra ändrades från Rabut och Ellenberg4. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59288/59288fig1large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59288/59288fig2.jpg"> Figur 2: Bilder av användargränssnittet i AIM-programvaran (tabell av material) för laser urval, helljus sökvägen konfiguration och bild förvärv parametrar för FRAP experiment. (A) Laser styra skärmen visar Argon/2 laserlinjer, utdata och tube ström används. (B) konfiguration styra skärmen visar balken splitter och utsläpp filterinställningar som används. (C) Scan styra skärmen visar den inställning som används för bild förvärv. (D) Scan styra skärmen visar den pinhole, detektorn vinst, förstärkare offset, förstärkare vinst och överföringsinställningar för raden Argon/2 514 nm laser. (E) tidsserier styra skärmen visar de inställningar för serie av tid som används. (F) blekmedel styra skärmen visar prebleach och postbleach parametrar som används. Förkortningar: HFT = Haupt Farb Teiler (primära dikroisk stråldelare); NT1 = Anslutninglinuxneben Farb Teiler 1 (första sekundära dichroic balk splitter); NT2 = Anslutninglinuxneben Farb Teiler 2 (andra sekundära dikroisk stråldelare); EF = utsläpp filter. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59288/59288fig2large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59288/59288fig3.jpg"> Figur 3 : Ett representativt FRAP-experiment för att studera YFP-p62 dynamik i ALIS i RAW264.7 celler. (A) Raw fluorescens intensitet data för ett blekmedel, kontroll och bakgrund ROI. (B) de uppgifter som lämnas i panel A efter att blekmedel och kontrollera ROI hade korrigerats för fluorescens i bakgrunden ROI. (C) de uppgifter som lämnas i paneler A och B efter normalisering fluorescensintensiteten i blekmedel ROI till konto för fluorescens i kontrollen bakgrundskorrigerade ROI. (D) de uppgifter som lämnas i paneler A-C efter normalisering fluorescensintensiteten i normaliserat och bakgrundskorrigerade blekmedel ROI med genomsnittet av de första 5 prebleach värdena i blekmedel ROI. Mf = 21,97, jagf = 78.03, t1/2 = 128.27 s (2.14 min) och blekmedel djup = 91.94. (E), en bild av en ALIS på prebleach (1,5 min) och postbleach (0, 6 och 16 min). Skalstapeln = 5 µm och är giltig för alla paneler. Förkortningar: Con = kontroll; BG = bakgrund; Corr. = korrigeras; Norm. = normaliserat; AVG. = genomsnittet. Denna siffra ändrades från Cabe et al.12<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59288/59288fig3large.jpg" target="_blank">vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Supplementary Video 1" src="/files/ftp_upload/59288/59288supvideo1.jpg"> Kompletterande Video 1: en typisk ALIS i en RAW264.7 makrofag före och efter fotoblekning. YFP-p62 fluorescens är långsam att återhämta sig efter photobleach; p62 är därför inte ett mycket mobila protein. För detta experiment, Mf = 25,62, jagf = 74.38, t1/2 = 442.79 s (7.38 min) och blekmedel djup = 90,19. Skalstapeln = 5 µm. Denna video ändrades från Cabe et al.12<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59288/Fig_4-Vid_FINAL.avi" target="_blank">vänligen klicka här för att se denna video. (Högerklicka för att ladda ner.)</a>

Watch this Scientific Journal Video about Fluorescence Recovery after Photobleaching of Yellow Fluorescent Protein Tagged p62 in Aggresome-like Induced Structures at JoVE.com

Fluorescence Recovery after Photobleaching of Yellow Fluorescent Protein Tagged p62 in Aggresome-like Induced Structures

Fluorescens återhämtning efter Fotoblekning av gula fluorescerande Protein taggade p62 i Aggresome-liknande inducerad strukturer

Vi beskriver ett omfattande och praktiska protokoll för fluorescens återhämtning efter fotoblekning experiment med levande celler. Även om protokollet användes för att mäta rörligheten för gula fluorescerande protein-taggade p62 i aggresome-inducerad strukturer, kan det tillämpas på en mängd mikroskopi system och fluorescerande proteiner.

Fluorescence recovery after photobleaching (FRAP)&#160;is a microscopy technique that can be used to quantify protein mobility in live cells. In a typical ...

Befintliga fluorescens återhämtning efter fotobleaching, FRAP protokoll, är antingen ofullständiga eller alltför komplexa. Protokollet som presenteras i den här videon är betydande i att det är omfattande, praktiskt och okomplicerat. Den största fördelen med denna FRAP-teknik är att den möjliggör kvantifiering av proteinrörlighet inom och mellan subcellulära delutrymmen i levande celler.FRAP studeras för både terapeutiska och diagnostiska ändamål. En sådan användning är att kvantifiera diffusion inom drug delivery system i olika vävnader in vivo. Denna information kan genom att användas för att optimera en läkemedelsstruktur och sammansättning.FRAP-mikroskopitekniken har gett insikter inom ett brett spektrum av områden där förståelse diffusion fenomen är av intresse. Dessa inkluderar cell- och molekylärbiologi, utvecklingsbiologi, neurovetenskap, materialvetenskap, avancerade biomaterial och läkemedelsupptäckt. Även om det protokoll som beskrivs är för användning med däggdjursceller, kan begreppen tillämpas på andra system, såsom växtceller, jästceller och bakterier.En individ som aldrig har utfört denna teknik kan kämpa för att fastställa de optimala bildförvärvsparametrarna, skapa en förvärvsregion av intresse som är lämplig för deras experiment och beräkna den mobila fraktionen och halvtidsav återhämtning. När du försöker denna procedur för första gången, se till att utföra flera pilotexperiment för att optimera protokollet i samband med målen för ditt experiment. Demonstrerar proceduren blir Maleen Cabe, en tekniker från mitt labb, och David Rademacher, kärnan imaging facility manager.Till att börja med förbereda en platta av YFP-p62 transfected RAW264.7 makrofager, och behandla dem med Lipopolysackarid som beskrivs i den medföljande text protokollet. Därefter sköljer du de behandlade cellerna med iskall Tyrode buffert en gång. Tillsätt sedan två milliliter Nocodazole-kompletterad Tyrode buffert till plattan, och låt plattorna att inkubera vid fyra grader Celsius i 15 till 20 minuter före FRAP imaging och analys.Låt plattorna inkubera i fyra grader Celsius i 15 till 20 minuter före FRAP-bildtagning och analys. Över vid bildframställning, välj 514 nanometer linje av Argon / 2 laser, som fluorescens markör har en topp excitation på 512 nanometer, och en topp utsläpp på 527 nanometer. Klicka sedan på Argon/2, 458, 477, 488, 514 i fönstret Laserkontroll och klicka sedan på standby-knappen.Efter att ha väntat ungefär tre minuter för lasern att värma upp, klicka på på knappen. Ställ sedan in lasereffekten på lasern på 100 %och tryck på Retur. Därefter ställer överföring av laserlinjen till 5%På mikroskopet, vända sig till Plan-Apochromat 63x förstoring 1,40 numerisk bländare olja mål.Visa exemplaret genom mikroskopet okular och placera en aggresome-liknande inducerad struktur i mitten av synfältet. Sedan, i förvärvsprogramvaran, ange ramstorleken till 512 med 512 pixlar, skanningshastigheten till åtta och datadjupet till 12 Bit. Ställ också in scan medelvärdet till en, den optiska zoom till tre, och tryck enter.Därefter se pinhole till 1,95 felenheter och detektor vinst till 582, vilket är strax under mättnad. Skapa en kvadratformad region av intresse för bildförvärvet, som har dimensionerna 150 med 150 pixlar. Ställ in tidsserien så att regionen av intresse skannas 35 gånger, en gång var 30 sekunder.Ställ sedan in blekmedelskontrollen så att fotoblekningen kommer att ske efter skanning nummer fem, för att samla in fem prebleachbilder av intresseområdet. Bekräfta genom att trycka på Enter-tangenten. Därefter går du till fönstret Bleka regioner och skapar en cirkulär-formad blekmedelsregion av intresse inom det aggresome-liknande inducerade strukturområdet, som har en diameter på 10 pixlar.Nu, ställa in antalet iterationer till 300, och återigen trycka på Enter-tangenten. Ställ sedan in laserlinjen på 100 %-ström, och ange 100 i fältet överföringsprocent för lasern, och tryck på Retur. Slutligen kör bildförvärvsprogrammet för att samla in FRAP-data från 10 aggresome-liknande inducerade strukturer i 10 celler med mindre än cirka tre mikrometer drift.Börja dataanalysen, först överföra AIM lsm-filerna till en persondator för dataanalys. Korrigera för bildavdrift genom att justera eller matcha stapeln med tidsseriebilder av förvärvsregionen av intresse genom att öppna varje AIM lsm-fil med ett bildbehandlingsprogram. Välj sedan Plugins, Registration, StackReg och Translation, följt av att välja Plugins, Registration, StackReg och sedan Rigid Body.Därefter inrätta region intresse manager för att mäta signalen intensiteten i blekmedel regionen av intresse. För detta väljer du det ovala verktyget, ritar sedan en cirkel i blekningsregionen av intresse med en diameter på 10 pixlar och klickar sedan på knappen Lägg till. När du har lagt till, ställa in programmet för att mäta signal intensitet i kontrollregionen av intresse.Välj rektangelverktyget, rita sedan en kvadrat med 20 med 20 pixlar i kontrollregionen och klicka på knappen Lägg till. Slutligen, inrätta region av intresse manager för att mäta signal intensitet i bakgrunden region av intresse. Markera rektangelverktyget, rita en kvadrat med 20 med 20 pixlar i bakgrundens region och klicka sedan på knappen Lägg till.När du har lagt till regionerna som ska analyseras i ROI Manager byter du namn på dem Bleach ROI, Control ROI och Background ROI, i enlighet med detta. Mät signalintensiteten i varje region. Du åstadkommer detta genom att välja Bleka ROI, Control ROI och Background ROI och sedan gå till Mer och välj Multi Measure.Klistra in resultaten i ett kalkylblad i kolumner med etiketten Bleach ROI, Control ROI respektive Background ROI. Börja med bakgrund korrigera signalintensiteten i Bleach ROI och control ROI genom att subtrahera värdena i kolumnen märkt Background ROI från värdena i kolumnen med etiketten Bleach ROI, och kolumnen med etiketten Kontroll ROI. Märk dessa nya kolumner korrigerade Bleach ROI och Corrected Control ROI.Därefter normaliserar du signalen i Bleach ROI till den bakgrundsrättade signalen i Control ROI. Dividera värdena i kolumnen med etiketten Korrigerad roi-avkastning på blekning med värdena i kolumnen med etiketten Korrigerad kontroll ROI. Märk den här nya kolumnen, Normaliserad korrigerad bleach roi.Sedan normaliserar du signalen i kolumnen Normaliserat korrigerat bleach roi till medelvärdet av de fem prebleach-värdena i Bleach ROI. Dividera värdena i kolumnen med etiketten Normaliserat korrigerat bleach roi med medelvärdet av de fem prebleachvärdena i Bleach ROI. Märk den här nya kolumnen, Normaliserad korrigerad Prebleach Average Bleach ROI.Slutligen, öppna ett program för bildbehandling. Kurvan passar den normaliserade och korrigerade bleach ROI data genom att kopiera postbleach normaliserade korrigerade bleach ROI värden och motsvarande tidsvärden. Klistra in dem i fönstret Kurvpassare, välj exponentiell återställning på rullgardinsmenyn Curve Fitter och välj Passa.Visas här är en typisk video av fluorescens återhämtning efter fotobleaching för RAW264.7 celler behandlas med LPS. Fluorescens återhämtning inom aggresome-liknande inducerad struktur region av intresse, är långsam. Detta experiment använder fotobleaching för att undersöka graden av rörlighet av p62.p62 fluorescens i de aggresomeliknande inducerade strukturerna, prebleach och postbleach, visas här. Som beskrivs i den här videon kan fluorescensintensiteten spåras över tid. Efter bakgrund korrigering och normalisering, kan p62 fluorescens beräknas för att beskriva den mobila fraktionen som 22%den orörliga fraktionen som 78%och beskriver halvtid återhämtning inom aggresome-liknande inducerad strukturer, som 2,14 minuter.Kom ihåg att det är särskilt viktigt att korrekt definiera förvärvsregionen av intresse så att den innehåller en ALIS av intresse, en kontrollregion av intresse och en bakgrundsregion av intresse. Efter detta förfarande kan andra kvantitativa fluorescerande mikroskopitekniker tillämpas, såsom fluorescensförlust vid fotobleaching, FLIP och selektiv fotobleaching. Medan FLIP mäter graden av kontinuitet och kommunikation mellan subcellulära fack, ger selektiv fotobleaching kinetisk information om aktiv och passiv transport av proteiner till organeller, eller mellan proteinrika områden.FRAP utvecklades ursprungligen för att kvantifiera proteiners laterala rörelse i cellmembran. Därefter har det använts för att kvantifiera protein rörlighet inom och mellan en mängd olika subcellulära fack, som banade väg för forskare att svara på frågor inom en mängd olika områden, inklusive cell-och molekylärbiologi, utvecklingsbiologi, neurovetenskap, materialvetenskap, avancerade biomaterial, och läkemedelsupptäckt.

Research

JoVE Journal

Biology

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

Färgning av proteinerna i geler med Coomassie G-250 utan organiska lösningsmedel och ättiksyra

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Fluorescent Labeling of Drosophila Heart Structures

Fluorescent Labeling of Drosophila Heart Structures

Fluorescerande märkning av Drosophila Heart strukturer

The Drosophila melanogaster dorsal vessel, or heart, is a tubular structure comprised of a single layer of contractile cardiomyocytes, pericardial cells ...

Measuring Diffusion Coefficients via Two-photon Fluorescence Recovery After Photobleaching

Mätning Diffusion Koefficienter via två-photon fluorescens återhämtning efter fotoblekning

Multi-fluorescence recovery after photobleaching is a microscopy technique used to measure the diffusion coefficient (or analogous transport parameters) ...

Using the GELFREE 8100 Fractionation System for Molecular Weight-Based Fractionation with Liquid Phase Recovery

Använda GELFREE 8100 Fraktionering System för Molekylär viktbaserad fraktionering med vätskefasen Recovery

The GELFREE 8100 Fractionation System is a novel protein fractionation system designed to maximize protein recovery during molecular weight based ...

Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection

Time-lapse avbildning av Mitos Efter siRNA Transfektion

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and ...

Photobleaching Assays (FRAP &amp; FLIP) to Measure Chromatin Protein Dynamics in Living Embryonic Stem Cells

Photobleaching Assays FRAP & FLIP to Measure Chromatin Protein Dynamics in Living Embryonic Stem Cells

Fotoblekning tester (FRAP &amp; Flip) för att mäta Chromatin Protein Dynamics i Living embryonala stamceller

Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) and Fluorescence Loss In Photobleaching (FLIP) enable the study of protein dynamics in living cells with ...

Determination of Lipid Raft Partitioning of Fluorescently-tagged Probes in Living Cells by Fluorescence Correlation Spectroscopy (FCS)

Determination of Lipid Raft Partitioning of Fluorescently-tagged Probes in Living Cells by Fluorescence Correlation Spectroscopy FCS

Bestämning av lipidaggregat avskärmning av fluorescensmärkt taggade proberna i levande celler genom fluorescenskorrelationsspektroskopi (FCS)

In the past fifteen years the notion that cell membranes are not homogenous and rely on microdomains to exert their functions has become widely accepted. ...

Intravital Microscopy for Imaging Subcellular Structures in Live Mice Expressing Fluorescent Proteins

Intravital Mikroskopi för Imaging subcellulära strukturer i levande möss som uttrycker fluorescerande proteiner

Here we describe a procedure to image subcellular structures in live rodents that is based on the use of confocal intravital microscopy. As a model organ, ...

Simultaneous Multicolor Imaging of Biological Structures with Fluorescence Photoactivation Localization Microscopy

Samtidig Multicolor avbildning av biologiska strukturer med fluorescens Fotoaktivering Lokalisering Mikroskopi

Localization-based super resolution microscopy can be applied to obtain a spatial map (image) of the distribution of individual fluorescently labeled ...

Protein-protein Interactions Visualized by Bimolecular Fluorescence Complementation in Tobacco Protoplasts and Leaves

Protein-protein interaktioner visualiseras genom Bimolecular Fluorescens Komplettering i tobaksprotoplaster och Löv

Many proteins interact transiently with other proteins or are integrated into multi-protein complexes to perform their biological function. Bimolecular ...