Name: fluorescence recovery after photobleaching of yellow fluorescent protein tagged p62 in aggresome-like induced structures
Uploaded: 2019-03-26T14:00:00
Duration: 12 min 58 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Fluorescence Recovery after Photobleaching of Yellow Fluorescent Protein Tagged p62 in Aggresome-like Induced Structures at JoVE.com

Biz Dr Seth Robia Chicago Loyola Üniversitesi bu el yazması onun değerli yorumlar için teşekkür ederim. Bu eser NIH grant 1R01NS073967-01A1 için Joanna C. Bakowska tarafından desteklenmiştir.

<ol>
	<li>Axelrod, D., Koppel, D. E., Schlessinger, J., Elson, E., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mobility+measurement+by+analysis+of+fluorescence+photobleaching+recovery+kinetics.">Mobility measurement by analysis of fluorescence photobleaching recovery kinetics.</a> Biophysical Journal. 16 (9), 1055-1069 (1976).</li><li>Peters, R., Peters, J., Tews, K. H., Bahr, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microfluorimetric+study+of+translational+diffusion+in+erythrocyte+membranes.">A microfluorimetric study of translational diffusion in erythrocyte membranes.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 367 (3), 282-294 (1974).</li><li>Patterson, G., Day, R. N., Piston, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+protein+spectra.">Fluorescent protein spectra.</a> Journal of Cell Science. 114, 837-838 (2001).</li><li>Rabut, G., Ellenberg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photobleaching+techniques+to+study+mobility+and+molecular+dynamics+of+proteins+in+live+cells:+FRAP,+iFRAP,+and+FLIP.">Photobleaching techniques to study mobility and molecular dynamics of proteins in live cells: FRAP, iFRAP, and FLIP.</a> Live Cell Imaging: A Laboratory Manual (1st ed). , 101-126 (2004).</li><li>Fritzsche, M., Charras, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+protein+reaction+dynamics+in+living+cells+by+fluorescence+recovery+after+photobleaching.">Dissecting protein reaction dynamics in living cells by fluorescence recovery after photobleaching.</a> Nature Protocols. 10 (5), 660-680 (2015).</li><li>Goodwin, J. S., Kentworthy, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photobleaching+approaches+to+investigate+diffusional+mobility+and+trafficking+of+Ras+in+living+cells.">Photobleaching approaches to investigate diffusional mobility and trafficking of Ras in living cells.</a> Methods. 37 (2), 154-164 (2005).</li><li>Hildick, K. L., Gonz&#224;lez-Gonz&#224;lez, I. M., Jaskolski, F., Henley, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lateral+diffusion+and+exocytosis+of+membrane+proteins+in+cultured+neurons+assessed+using+fluorescence+recovery+and+fluorescence-loss+photobleaching.">Lateral diffusion and exocytosis of membrane proteins in cultured neurons assessed using fluorescence recovery and fluorescence-loss photobleaching.</a> Journal of Visualized Experiments. (60), e3747 (2012).</li><li>Nissim-Rafinia, M., Meshorer, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photobleaching+assays+(FRAP+&amp;+FLIP)+to+measure+chromatin+protein+dynamics+in+living+embryonic+stem+cells.">Photobleaching assays (FRAP &amp; FLIP) to measure chromatin protein dynamics in living embryonic stem cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (52), e2696 (2011).</li><li>Zheng, C., Petralia, R. S., Wang, Y., Kachar, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+recovery+after+photobleaching+(FRAP)+of+fluorescence+tagged+proteins+in+dendritic+spines+of+cultured+hippocampal+neurons.">Fluorescence recovery after photobleaching (FRAP) of fluorescence tagged proteins in dendritic spines of cultured hippocampal neurons.</a> Journal of Visualized Experiments. (50), e2568 (2011).</li><li>Thevenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+pyramid+approach+to+subpixel+registration+based+on+intensity.">A pyramid approach to subpixel registration based on intensity.</a> IEEE Transactions on Image Processing. 7 (1), 27-41 (1998).</li><li>Ishikawa-Ankerhold, H. C., Ankerhold, R., Drummen, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+fluorescence+microscopy+techniques--FRAP,+FLIP,+FLAP,+FRET+and+FLIM.">Advanced fluorescence microscopy techniques--FRAP, FLIP, FLAP, FRET and FLIM.</a> Molecules. 17 (4), 4047-4132 (2012).</li><li>Cabe, M., Rademacher, D. J., Karlsson, A. B., Cherukuri, S., Bakowska, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PB1+and+UBA+domains+of+p62+are+essential+for+aggresome-like+induced+structure+formation.">PB1 and UBA domains of p62 are essential for aggresome-like induced structure formation.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 503 (4), 2306-2311 (2018).</li><li>Brown, E. B., Wu, E. S., Zipfel, W., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+molecular+diffusion+in+solution+by+multiphoton+fluorescence+photobleaching+recovery.">Measurement of molecular diffusion in solution by multiphoton fluorescence photobleaching recovery.</a> Biophysical Journal. 77 (5), 2837-2849 (1999).</li><li>Centonze, V., Pawley, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tutorial+on+practical+confocal+microscopy+and+the+use+of+the+confocal+test+specimen.">Tutorial on practical confocal microscopy and the use of the confocal test specimen.</a> Handbook of biological confocal microscopy. , 549-570 (1995).</li><li>Chudakov, D. M., Matz, M. V., Lukyanov, S., Lukyanov, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+proteins+and+their+applications+in+imaging+living+cells+and+tissues.">Fluorescent proteins and their applications in imaging living cells and tissues.</a> Physiological Reviews. 90 (3), 1103-1163 (2010).</li></ol>

Yazarlar hiçbir ifşa etmek çıkar çatışması var.

Biz canlı hücreleri ile sıkı BAĞLAMAK deneyler için kapsamlı, pratik ve basit adım adım Protokolü sağlar. Burada, protokol YFP-p62 içinde alış hareketlilik RAW264.7 makrofajlar ölçmek için kullanılan, ancak birçok confocal mikroskop sistemler taranıyor lazer için uygulanabilir ve are şimdi elde edilebilir floresan proteinler genetik olarak kodlanmış. Herhangi bir mikroskobu sistemi için pilot deneyler edinme, çamaşır suyu ve denetim yatırım Getirisi boyutları, lazer yoğunluk photobleaching ve prebleach ve postbleach resim alma dahil olmak üzere en uygun sıkı BAĞLAMAK parametreleri belirlemek için kritik öneme sahiptir. Her genetik olarak kodlanmış floresan protein ve hücre satırı için farklı için en uygun sıkı BAĞLAMAK parametreleri beklemek uygun olur.
Ne zaman bir sıkı BAĞLAMAK deney dahil elde (a) uygun dikkat edilmesi gereken önemli faktör derinlik, (b) kısa bir beyazlatma adım tam kurtarma işlevi, (d) photobleaching verimlilik gözlemlemek için (c) izin yeterli zaman postbleach kullanımı bleach (e). sitotoksisite tekrarlanan sıkı BAĞLAMAK ve (f) floresan kaybı nedeniyle tekrarlanan görüntüleme için bir denetimi eklenmesi ile. 3.3.1 sağlanan denklem göre hesaplanabilir, çamaşır suyu derinlik ≥9013olmasını öneririz. Ne zaman çamaşır suyu derinlik < 90, postbleach floresan kurtarma ölçüde hafife almışım ve değerleri,f, Mfve t1/2 hatalı olur. Her ne kadar süre ve çamaşır suyu-inducing lazer bakliyat yoğunluğunu sıkı BAĞLAMAK deneyler arasında değişebilir, photobleaching adım kısa ve önemli ölçüde daha hızlı Floresans kurtarma işlevi daha önemlidir. Yoksa, Floresans kurtarma önemli miktarda beyazlatma adımı sırasında meydana gelebilir. Uzun çamaşır suyu vakit geçirmek, Floresans kurtarma beyazlatma adım sırasında değil ölçülen ve ben hatalı ölçümlerden yol açacakf, Mf, vet1/2. Doğru değerler ben içinf, Mf, elde etmek için ek olarak, vet1/2, yatırım Getirisi edinme gözlenen postbleach çamaşır suyu ROI Floresans kademede bir plato ulaşmıştır kadar. Örneğin, bizim sıkı BAĞLAMAK deneylerde vardı ben arasında bir fark yokturf, Mfve t1/2 değerlerini biz ne zaman biz YFP-p62 çamaşır suyu ROI gözlenen karşı postbleach YFP-p62 floresan 32.2 min için yatırım Getirisi çamaşır suyu içinde gözlenen için 15.1 min postbleach; Böylece, biz kurtarma işlevi 15.1 min postbleach12bir plato ulaşmış sonucuna vardı. Photobleaching verimliliği ile ilgili olarak, photobleaching optik zoom faktörü14Meydanı ile artar. Böylece, yüksek optik zoom lens kullanımı için hızlı photobleaching olumlu ama istenmeyen photobleaching Alım sırasında neden olabilir; ikinci için bir denetim yatırım Getirisi Imaging tarafından muhasebesi. Tekrarlanan photobleaching sitotoksik Reaktif oksijen türleri (ROS) üretimi için yol açabilir gibi var olmak kaçmak etmektir. Ancak, ROS üretimi yüksek yoğunluktaki lazer maruz derecesi için genetik olarak kodlanmış floresan proteinlerin kimyasal fluorophores (örneğin, floresan antikor)15düşüktür ve oluşturulan ROS tepki olasılığı daha yüksektir genetik olarak kodlanmış floresan protein içinde diğer moleküller hücre4ile. Sitotoksik ROS üretme artan ek olarak, tekrarlanan photobleaching kontrol etmek zor olduğu gibi kaçınılması gereken olasılıktır. Ne kadar düşük lazer iletim tüm çamaşır suyu olmayan görüntüleri elde etmek için kullanılır, son olarak, bazı photobleaching her zaman, hangi kontrol altına alınmalı ortaya çıkar. Bunun için mümkün denetimler içerir Floresans edinme yatırım Getirisi bir denetiminde ROI izleme, komşu Ryslampa hücrede kontrol görüntüleri elde etme ve bu kullanılan kontrol deneyleri aynı ayarları ile gerçekleştirme photobleaching deneyler ama photobleaching olay olmadan.

Photobleaching (sıkı BAĞLAMAK) protein dinamiklerini canlı ölçmek için kullanılan bir mikroskobu tekniktir sonra Floresans kurtarma1,2hücreleri. Sıkı BAĞLAMAK popülaritesi yüksek kararlılık, hız ve hassasiyet ile confocal mikroskoplar tarama lazer yaygın ticari durumu nedeniyle artmış ve bir "Gökkuşağı" genetik olarak flüoresan proteinler, yeşil flüoresan gibi kodlanmış protein (GFP) ve sarı floresan protein (YFP)3. Genetik olarak kodlanmış floresan proteinler bir protein ilgi proteinin hücre altı yerelleştirme için izin ilgi erimiş. Tipik bir sıkı BAĞLAMAK deneyde, kararlı durum Floresans ilgi (ROI) bir hücre içinde bir alım bölgesinde ki ROI düşük yoğunluktaki lazer ışık ile tekrarlanan görüntüleme ile görülmektedir. Daha sonra floresan molekülleri hızla geri dönüşümsüz bundan sonra yatırım Getirisi, çamaşır suyu kısa yoğun lazer ışık maruz anılacaktır edinme yatırım Getirisi, önceden tanımlanmış alt kümesinde engelliler ve. Yeni Ryslampa protein ağartılmış proteinler zamanla doldurmak gibi çamaşır suyu ROI toparlanmanın floresan yoğunluğu ve hız protein hareketlilik (şekil 1)4hakkında bilgi sağlar.
Stimülasyon lipopolysaccharide (LPS) ile sıkı BAĞLAMAK gözden geçirmek için bize yol sonra yapılarda aggresome benzeri indüklenen (alış) fare RAW264.7 makrofajlar içinde Ubikuitin bağlayıcı protein p62 (olarak da bilinen sequestosome-1) hareketliliğini belirlemede bizim ilgi Edebiyat. Ne yazık ki, mevcut sıkı BAĞLAMAK iletişim kuralları eksik veya haddinden fazla karmaşık5,6,7,8,9çoğu. Bazı görüntü edinme parametreleri5,6,7,8,9, ışın yolu yapılandırma ve lazer ayarlar hakkında ayrıntılı bilgi sağlar. Diğerleri çamaşır suyu ROI drift6,9 sorunu gidermek veya mobil kesir (Mf), hareketsiz kesir dahil olmak üzere önemli kurtarma parametreleri hesaplamak gibi veri analizi ile ilgili önemli ayrıntılar atlandı (Benf) ve yarı-zamanlı kurtarma (t½)5,7. Bunun tersi olarak, diğerleri Mf, hesaplamak için kullanılan karmaşık matematiksel formüller üzerinde çok fazla vurgu benfve t1/25,6,8,9. Böylece, bizim amacımız bir kapsamlı, pratik ve basit adım adım protokol canlı hücreleri ile sıkı BAĞLAMAK deneyler için sağlamaktır.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:835px;" width="835">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium</td>
			<td style="width:211px;">Hyclone</td>
			<td style="width:137px;">SH30022.01</td>
			<td style="width:167px;">High Glucose (4.5 g/L)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Fetal bovine serum</td>
			<td style="width:211px;">Gemini Bio-Products</td>
			<td style="width:137px;">100-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Glass bottom dishes</td>
			<td style="width:211px;">MatTek</td>
			<td style="width:137px;">P35G-1.5-14-C</td>
			<td>35-mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Image J software</td>
			<td style="width:211px;">National Institutes of Health</td>
			<td style="width:137px;">N.A.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Lipopolysaccharide (LPS)</td>
			<td style="width:211px;">Sigma</td>
			<td style="width:137px;">L4391</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Nocodazole</td>
			<td style="width:211px;">Sigma</td>
			<td style="width:137px;">M1404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Penicillin-streptomycin solution</td>
			<td style="width:211px;">Corning</td>
			<td style="width:137px;">30-002-Cl</td>
			<td>100&#215;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Plan-Apochromat 63&#215;/1.40 oil objective</td>
			<td style="width:211px;">Carl Zeiss MicroImaging, Inc</td>
			<td style="width:137px;">4407629904000000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Polyethylenimine (PEI)</td>
			<td style="width:211px;">Polysciences</td>
			<td style="width:137px;">23966-1</td>
			<td>linear (MW 25,000)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">RAW 264.7 murine macrophages</td>
			<td style="width:211px;">ATCC</td>
			<td style="width:137px;">TIB-71</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Zeiss confocal microscope</td>
			<td style="width:211px;">Carl Zeiss MicroImaging, Inc</td>
			<td style="width:137px;">LSM 510</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fluorescence recovery after photobleaching of yellow fluorescent protein tagged p62 in aggresome-like induced structures

Floresans kurtarma photobleaching (sıkı BAĞLAMAK) sonra canlı hücrelerdeki protein hareketlilik ölçmek için kullanılan bir mikroskobu tekniktir. Tipik bir sıkı BAĞLAMAK deneyde, kararlı durum Floresans yanında düşük yoğunluktaki lazer ışık ile tekrarlanan düşsel görülmektedir. Daha sonra floresan molekülleri kısa ışığa maruz kalma yüksek yoğunluktaki lazer ile hızla ve geri dönüşümsüz zarar görür. Protein hareketlilik hakkında bilgi Floresans kurtarılması izleyerek elde edilir. Sıkı BAĞLAMAK stimülasyon ile lipopolysaccharide (LPS) sonra p62 aggresome benzeri indüklenen yapıları (alış) fare makrofajlar içinde hareketliliğini belirlemek için kullanılır. Birçok varolan sıkı BAĞLAMAK iletişim kuralları eksik veya karmaşık olduğundan, hedefimiz bir kapsamlı, pratik ve basit adım adım protokol canlı hücreleri ile sıkı BAĞLAMAK deneyler için sağlamaktı. Burada, RAW264.7 makrofaj transfection sarı floresan protein-p62 (YFP-p62), LPS ve prebleach ve postbleach sıkı BAĞLAMAK görüntüleri ve veri analizi toplamak için bir adım-adım yöntemi hücrelere açığa tarafından alış indüksiyon ile açıklayın. Son olarak, biz bir sıkı BAĞLAMAK deney zaman dikkat edilmesi gereken önemli faktör tartışıyorlar.

Burada hangi biz sıkı BAĞLAMAK LPS ile tedavi RAW264.7 hücrelerdeki alış içinde p62 3-5 h12hareketliliğini derecesini incelemek için kullanılan tipik bir denemenin sonuçları gösterilmiştir. Şekil 3 A gösterir bir çamaşır suyu elde edilen ham veri kontrol ve görüntü yığını için küçük miktarlarda düzeltmek için hizalı sonra yatırım Getirisi arka plan (< ~ 3 µm) görüntü sürüklenme alış bir. Bu alış prebleach ve postbleach YFP-p62 Floresan şekil 3E ve ek Video 1' de gösterilmiştir. Şekil 3 B arka plan-düzeltme sonra bu verileri gösterir. Şekil 3 C yatırım Getirisi denetimindeki floresan için düzelttikten sonra bu verileri gösterir. Şekil 3 D çamaşır suyu yatırım Getirisi 5 prebleach değerleri ortalama Floresans için normalleştirilmiş bu verileri gösterir. Ağartma derecesi bu deneyde yeterli (çamaşır suyu derinlik 91.94 =). YFP-p62 floresan bu alış içinde yeniden elde etmek yavaş yavaş, t1/2 128.27 = s (2.14 dk). YFP-p62 bu denemede çok mobil bir protein değildi = Mf 21,97 vef 78.03 =.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59288/59288fig1.jpg"> Resim 1 : RAW264.7 hücre ve sıkı BAĞLAMAK görüntüleri alış görüntü drift için düzeltmek için hizalı sonra görüntü analizi için adımları bir diyagram. (A)diyagram birkaç alış ve çamaşır suyu, kontrol ve arka plan ROIs edinme ROI içinde tasvir eden bir RAW264.7 hücre. (B) ham sıkı BAĞLAMAK idealize edilmiş bir tasviri çamaşır suyu, kontrol ve arka plan ROIs A. (C) panelinde bir idealize grafik arka plan-düzeltilmiş olmuştur ham sıkı BAĞLAMAK veri elde edilen veriler. (D) floresan ROI denetimindeki normalleştirilmiş arka plan-düzeltilmiş sıkı BAĞLAMAK veri idealize edilmiş bir grafik. (E) bir idealize ROI çamaşır suyu prebleach floresan için normalleştirilmiş normalleştirilmiş ve arka plan-düzeltilmiş sıkı BAĞLAMAK veri grafiği. Kısaltmalar: Con kontrol; = BG = arka plan. Bu rakam Rabut ve Ellenberg4güncellenmiştir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59288/59288fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59288/59288fig2.jpg"> Resim 2: Lazer seçimi, amaç yazılımı (malzemeler tablo) kullanıcı arabiriminde görüntülerini ışınla yolu yapılandırma ve görüntü edinme parametreleri sıkı BAĞLAMAK deneyler için. (A)lazer kontrol ekran Argon/2 lazer çizgileri, çıkış ve tüp akım kullanılan gösterilen. (B) yapılandırma kontrol ışın gösterilen ekran kırık ve emisyon filtre kullanılan ayarlar. (C) tarama resim alma için kullanılan ayarı gösterilen ekran kontrol. (D) tarama iğne deliği, Dedektör kazanç, amplifikatör uzaklık, amplifikatör kazancı ve iletim ayarlarını Argon/2 514 nm lazer çizgi için gösterilen ekran kontrol. (E) saat serisi kontrol kullanılan zaman dizi ayarları gösterilen ekran. (F) çamaşır suyu prebleach gösterilen ekran kontrol ve kullanılan parametreleri postbleach. Kısaltmalar: HFT Haupt Farb Teiler (birincil dikroik ışın ayırıcı); = NT1 = Neben Farb Teiler 1 (ilk orta dikroik ışınla splitter); NT2 = Neben Farb Teiler 2 (ikinci ikincil dikroik ışın ayırıcı); EF = emisyon filtresi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59288/59288fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59288/59288fig3.jpg"> Şekil 3 : YFP-p62 dynamics alış RAW264.7 hücrelerdeki içinde çalışmaya temsilcisi bir sıkı BAĞLAMAK deney. Çamaşır suyu, kontrol ve arka plan yatırım Getirisi için(a)ham floresan yoğunluğu verileri. (B) çamaşır suyu ve denetim yatırım Getirisi için yatırım Getirisi arka planda Floresans düzeltilip sonra Masası'A verilen veriler. (C) paneller A ve B floresan arka plan düzeltildi kontrol yatırım Getirisi için hesabına çamaşır suyu ROI floresan yoğunluğu normalize sonra verilen veriler. (D) paneller A-C normalleştirilmiş ve arka plan-düzeltilmiş çamaşır suyu yatırım Getirisi yatırım Getirisi çamaşır suyu ilk 5 prebleach değerleri ortalama Floresans şiddeti normalize sonra verilen veriler. Mf = 21,97, benf 78.03, t1/2 = 128.27 = s (2.14 dk) ve çamaşır suyu derinlik 91.94 =. (E) prebleach (1,5 dk) ve postbleach bir alış görüntüsünü (0, 6 ve 16 dk.). Ölçek çubuğu 5 mikron = ve tüm panelleri için geçerlidir. Kısaltmalar: Con kontrol; = BG = arka plan; Corr = düzeltildi; Norm. = Normalleştirilmiş; Ortalama = ortalama. Bu rakam Cabe vd.12' den güncellenmiştir<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59288/59288fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Supplementary Video 1" src="/files/ftp_upload/59288/59288supvideo1.jpg"> Ek Video 1: önce ve sonra photobleaching RAW264.7 makrofaj olarak tipik bir alış. YFP-p62 floresan photobleach sonra kurtarmak yavaş; Bu nedenle, p62 bir çok mobil protein değil. Bu deneme için Mf = 25.62, benf 74.38, t1/2 = 442.79 = s (7.38 dk) ve çamaşır suyu derinlik 90.19 =. Ölçek çubuğu 5 mikron =. Bu video Cabe ve ark.12den<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59288/Fig_4-Vid_FINAL.avi" target="_blank">Bu videoyu izlemek için buraya tıklayın lütfen güncellenmiştir. (İndirmek için sağ tıklatın.)</a>

Watch this Scientific Journal Video about Fluorescence Recovery after Photobleaching of Yellow Fluorescent Protein Tagged p62 in Aggresome-like Induced Structures at JoVE.com

Fluorescence Recovery after Photobleaching of Yellow Fluorescent Protein Tagged p62 in Aggresome-like Induced Structures

Photobleaching, sarı floresan Protein etiketli p62 indüklenen Aggresome benzeri yapılarda sonra Floresans kurtarma

Sonra hücreleri ile photobleaching deneyler canlı Floresans kurtarma için kapsamlı ve pratik iletişim kuralı açıklar. Her ne kadar sarı floresan protein etiketli p62 aggresome benzeri indüklenen yapılarda hareketliliğini ölçmek için kullanılan protokol, çeşitli mikroskobu sistemleri ve floresan proteinler için uygulanabilir.

Fluorescence recovery after photobleaching (FRAP)&#160;is a microscopy technique that can be used to quantify protein mobility in live cells. In a typical ...

Fotobeyaztma sonrası mevcut floresan kurtarma, FRAP protokolleri, ya eksik ya da aşırı karmaşıktır. Bu videoda sunulan protokol kapsamlı, pratik ve basit olması açısından önemlidir. Bu FRAP tekniğinin en büyük avantajı, canlı hücrelerde hücre altı bölmeleri içinde ve arasında protein hareketliliğinin ölçülmesine olanak sağlamasıdır.FRAP hem tedavi amaçlı hem de tanısal olarak çalışılmaktadır. Bu kullanımlardan biri, vivo'da farklı dokularda ilaç dağıtım sistemleri içinde difüzyonu ölçmektir. Bu bilgiler bir ilaç yapısını ve bileşimini optimize etmek için kullanılabilir.FRAP mikroskopi tekniği, difüzyon olgusunu anlamanın ilgi çekici olduğu geniş bir alanda öngörüler sağlamıştır. Bunlar arasında hücre ve moleküler biyoloji, gelişim biyolojisi, nörobilim, malzeme bilimi, ileri biyomalzemeler ve ilaç keşfi sayılabilir. Açıklanan protokol memeli hücreleri ile kullanılmak üzere olmasına rağmen, kavramlar bitki hücreleri, maya hücreleri ve bakteriler gibi diğer sistemlere uygulanabilir.Bu tekniği hiç gerçekleştirmemiş bir birey, en uygun görüntü edinme parametrelerini belirlemede, deneylerine uygun bir kazanım bölgesi oluşturmada ve mobil fraksiyonu ve kurtarma devre sini hesaplamada mücadele edebilir. Bu yordamı ilk kez denerken, denemenizin amaçları bağlamında protokolü optimize etmek için birkaç pilot deneme gerçekleştirdiğinizden emin olun. Prosedürü gösteren maleen Cabe, benim laboratuvar bir teknisyen ve David Rademacher, çekirdek görüntüleme tesisi yöneticisi olacaktır.Başlamak için, YFP-p62 transfected RAW264.7 makrofajlar bir tabak hazırlamak ve eşlik eden metin protokolü açıklandığı gibi Lipopolysaccharide ile tedavi. Sonra, buz gibi Tyrode tampon bir kez tedavi hücreleri durulamak. Daha sonra, plakaya Nocodazol takviyeli Tyrode's tampon iki mililitre ekleyin ve plakalar FRAP görüntüleme ve analiz önce 15 ila 20 dakika için dört derece santigrat kuluçka sağlar.Plakaların FRAP görüntüleme ve analizinden önce 15 ila 20 dakika boyunca dört santigrat derecede kuluçkaya yatmasını bekleyin. Görüntüleme kurulumunda, Floresan belirteci 512 nanometrede en yüksek uyarıma ve 527 nanometrede en yüksek emisyona sahip olduğu için Argon/2 lazerin 514 nanometre çizgisini seçin. Ardından, Lazer Kontrolü penceresinde Argon/2, 458, 477, 488, 514'ü tıklatın ve ardından Standby düğmesini tıklatın.Lazerin ısınması için yaklaşık üç dakika bekledikten sonra Aç düğmesine tıklayın. Daha sonra lazerin lazer gücünü %100'e ayarlayın ve Enter tuşuna basın. Daha sonra lazer hattının iletimini mikroskopta %5'e ayarlayın, Plan-Apochromat 63x büyütme 1.40 sayısal diyafram yağı hedefine dönün.Numuneyi mikroskop merceği aracılığıyla görüntüleyin ve görüş alanının ortasına agrega benzeri bir indüklenen yapı yerleştirin. Daha sonra, satın alma yazılımında, kare boyutunu 512 piksele, tazyik hızını sekize ve veri derinliğini 12 Bit'e ayarlayın. Ayrıca tbmm ortalamasını bire, optik zum'u üçe ayarlayın ve Enter tuşuna basın.Ardından, iğne deliğini 1,95 hata birimine ve dedektör kazancını 582'ye, doygunluk hemen altında niçin elde edin. 150'ye 150 piksel boyutlarına sahip görüntü edinimi için kare şeklinde bir ilgi alanı oluşturun. İlgi alanının 30 saniyede bir 35 kez tarandığı zaman serisini ayarlayın.Daha sonra, ilgi bölgesinin beş prebleach görüntüleri toplamak için, fotobeyazrlama beş numaralı taranan sonra oluşacak şekilde ağartıcı kontrol ayarlayın. Onaylamak için Enter tuşuna basın. Ardından, Bleach Regions penceresine gidin ve 10 piksel çapında olan saldırgan benzeri indüklenen yapı alanı içinde dairesel şekilli bir çamaşır suyu alanı oluşturun.Şimdi, yineleme sayısını 300'e ayarlayın ve tekrar Enter tuşuna basın. Daha sonra lazer hattını %100 güç olarak ayarlayın ve lazer için iletim yüzdesi alanına 100 girin ve Enter tuşuna basın. Son olarak, yaklaşık üç mikrondan daha az sürüklenme ile 10 hücrede 10 agresome benzeri indüklenen yapılarDAN FRAP verileri toplamak için görüntü toplama programını çalıştırın.Veri analizine başlamak için, önce AIM lsm dosyalarını veri analizi için kişisel bir bilgisayara aktarın. Her AIM lsm dosyasını bir görüntü işleme programıyla açarak, satın alma bölgesinin zaman serisi görüntülerini hizalayarak veya eşleştirerek görüntü kayması için düzeltme. Ardından Eklentiler, Kayıt, StackReg ve Çeviri'yi seçin ve ardından Eklentiler, Kayıt, StackReg ve ardından Rijit Gövde'yi seçin.Daha sonra, ilgi alanı nın ağartıcı bölgesindeki sinyal yoğunluğunu ölçmek için ilgi alanı yöneticisini ayarlayın. Bunun için oval aracı seçin, ardından 10 piksel çapında ilgi alanı nın ağartıcı bölgesinde bir daire çizin ve sonra Ekle düğmesini tıklatın. Bir kez eklendikten sonra, ilgi kontrol bölgesinde sinyal yoğunluğunu ölçmek için programı ayarlayın.Dikdörtgen aracını seçin, ardından denetim bölgesinde 20'ye 20 piksel kare çizin ve Ekle düğmesini tıklatın. Son olarak, ilgi arka planda sinyal yoğunluğuölçmek için ilgi yöneticisi bölge ayarlayın. Dikdörtgen aracını seçin, arka plan bölgesinde 20'ye 20 piksel kare çizin ve sonra Ekle düğmesini tıklatın.YG Yöneticisi'nde analiz edilecek bölgeleri ekledikten sonra, bunları Bleach RoI, Control ROI ve Background ROI olarak yeniden adlandırın. Her bölgedeki sinyal yoğunluğunu ölçün. Bunu başarmak için Bleach RoI, Control ROI ve Arka Plan Yatırım Getirisi'ni seçin ve ardından Daha Fazla'ya gidin ve Çoklu Ölçü'yi seçin.Sonuçları, sırasıyla Bleach YG, Denetim YG ve Arka Plan YG etiketli sütunlara bir elektronik tabloya yapıştırın. Bleach RoI ve Control ROI'daki sinyal yoğunluğunu, Bleach ROI etiketli sütundaki değerlerden ve Control ROI etiketli sütundaki arka plandaki arka plandaki değerleri çıkararak başlatın. Etiket bu yeni sütunlar Düzeltilmiş Bleach RoI ve Düzeltilmiş Denetim RoI.Ardından, Bleach RoI'daki sinyali Kontrol Yatırım Getirisi'ndeki arka plan düzeltilmiş sinyale normalleştirin. Düzeltilmiş Ağartıcı Yatırım Getirisi etiketli sütundaki değerleri Düzeltilmiş Denetim YG etiketli sütundaki değerlere bölün. Etiket bu yeni sütun, Normalleştirilmiş Düzeltilmiş Bleach RoI.Ardından, Normalleştirilmiş Düzeltilmiş Ağartıcı Yatırım Getirisi sütunundaki sinyali Bleach RoI'daki beş bleach öncesi değerin ortalamasına göre normalleştirin. Normalleştirilmiş Düzeltilmiş Ağartıcı Yatırım Getirisi etiketli sütundaki değerleri Bleach RoI'daki beş bleach öncesi değerin ortalamasına bölün. Etiket bu yeni sütun, Normalleştirilmiş Düzeltilmiş Prebleach Ortalama Bleach RoI.Son olarak, görüntü işleme için bir program açın. Eğri, normalleştirilmiş çamaşır suyu düzeltilmiş ağartıcı yatırım getirisi değerlerini ve buna karşılık gelen zaman değerlerini kopyalayarak normalleştirilmiş ve düzeltilmiş çamaşır suyu Yatırım Getirisi verilerine uyar. Eğri Aşındıran penceresine yapıştırın, Eğri Aşındıran açılır menüden üstel kurtarma yı seçin ve Sığdır'ı seçin.Burada gösterilen RAW264.7 hücreleri LPS ile tedavi için fotobeyazrlama sonra floresan kurtarma tipik bir video. Aggresome benzeri indüklenen yapı bölgesinde floresan toparlanma, yavaştır. Bu deney, p62'nin hareket kabiliyetini incelemek için fotobeyaztlandırma kullanır.agresome benzeri indüklenen yapılarda p62 floresan, prebleach ve postbleach, burada gösterilmiştir. Bu videoda açıklandığı gibi, floresan yoğunluğu zaman içinde izlenebilir. Arka plan düzeltme ve normalleştirme sonrasında, p62 floresan%78 olarak mobil fraksiyonu tanımlamak için hesaplanabilir ve agresome benzeri indüklenen yapılar içinde kurtarma devre zaman açıklar, olarak 2.14 dakika.Unutmayın, özellikle ilgi alanı edinme bölgesini doğru bir şekilde tanımlamak önemlidir, böylece bir ALIS ilgi alanı, bir kontrol bölgesi ve bir arka plan alanı içerir. Bu prosedürü takiben fotobeyazrlamada floresan kaybı, FLIP ve seçici fotobeyaztçılama gibi diğer kantitatif floresan mikroskopi teknikleri de uygulanabilir. FLIP hücre altı bölmeleri arasındaki süreklilik ve iletişim derecesini ölçerken, seçici fotobeyaztma proteinlerin organellere veya protein açısından zengin alanlar alabildiği aktif ve pasif taşıma hakkında kinetik bilgi sağlar.FRAP başlangıçta hücre zarlarında proteinlerin lateral hareketini ölçmek için geliştirilmiştir. Daha sonra, hücre içi ve moleküler biyoloji, gelişim biyolojisi, nöroloji, malzeme bilimi, ileri biyomalzemeler ve ilaç keşfi gibi çeşitli alanlarda ki soruları yanıtlamalarının önünü açan çeşitli hücre altı bölmeleri içinde ve arasında protein hareketliliğini ölçmek için kullanılmıştır.

Research

JoVE Journal

Biology

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

Organik Solvent ve Asetik Asit olmadan Jeller Coomassie G-250 ile Proteinlerin Boyama

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Fluorescent Labeling of Drosophila Heart Structures

Fluorescent Labeling of Drosophila Heart Structures

VE Floresan Etiketleme Drosophila Kalp Yapıları

The Drosophila melanogaster dorsal vessel, or heart, is a tubular structure comprised of a single layer of contractile cardiomyocytes, pericardial cells ...

Measuring Diffusion Coefficients via Two-photon Fluorescence Recovery After Photobleaching

İki foton Floresan Kurtarma üzerinden Photobleaching sonra Difüzyon Katsayıları Ölçüm

Multi-fluorescence recovery after photobleaching is a microscopy technique used to measure the diffusion coefficient (or analogous transport parameters) ...

Using the GELFREE 8100 Fractionation System for Molecular Weight-Based Fractionation with Liquid Phase Recovery

Sıvı Faz Kurtarma Moleküler Ağırlık Tabanlı Fraksiyonu GELFREE 8100 Fraksiyonu Sisteminin Kullanılması

The GELFREE 8100 Fractionation System is a novel protein fractionation system designed to maximize protein recovery during molecular weight based ...

Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection

Zaman atlamalı Görüntüleme siRNA Transfeksiyon sonra Mitoz

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and ...

Photobleaching Assays (FRAP &amp; FLIP) to Measure Chromatin Protein Dynamics in Living Embryonic Stem Cells

Photobleaching Assays FRAP & FLIP to Measure Chromatin Protein Dynamics in Living Embryonic Stem Cells

Embriyonik Kök Hücreler Yaşayan Kromatin Protein Dynamics Tedbir Tahliller (sıkı bağlamak ve FLIP) Photobleaching

Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) and Fluorescence Loss In Photobleaching (FLIP) enable the study of protein dynamics in living cells with ...

Determination of Lipid Raft Partitioning of Fluorescently-tagged Probes in Living Cells by Fluorescence Correlation Spectroscopy (FCS)

Determination of Lipid Raft Partitioning of Fluorescently-tagged Probes in Living Cells by Fluorescence Correlation Spectroscopy FCS

Lipid Raft belirlenmesi Flüoresan Korelasyon Spektroskopisi (FCS) tarafından Yaşayan hücreler içinde floresan etiketli Soruşturmasının Bölümleme

In the past fifteen years the notion that cell membranes are not homogenous and rely on microdomains to exert their functions has become widely accepted. ...

Intravital Microscopy for Imaging Subcellular Structures in Live Mice Expressing Fluorescent Proteins

Floresan Proteinler ifade Canlı Farelerde Görüntüleme hücrealtı Yapıların Intravital Mikroskopi

Here we describe a procedure to image subcellular structures in live rodents that is based on the use of confocal intravital microscopy. As a model organ, ...

Simultaneous Multicolor Imaging of Biological Structures with Fluorescence Photoactivation Localization Microscopy

Localization-based super resolution microscopy can be applied to obtain a spatial map (image) of the distribution of individual fluorescently labeled ...

Protein-protein Interactions Visualized by Bimolecular Fluorescence Complementation in Tobacco Protoplasts and Leaves

Tütün protoplastlarında ve Yapraklar Bimoleküler Floresan tamamlama tarafından Visualized protein-protein etkileşimleri

Many proteins interact transiently with other proteins or are integrated into multi-protein complexes to perform their biological function. Bimolecular ...