Name: rapid lipid droplet isolation protocol using a well-established organelle isolation kit
Uploaded: 2019-04-19T14:00:00
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我们感谢阿布兰森家族癌症研究所。这项工作得到以下赠款的支持: NIH/NIAAA R01 AA026302-01、NIH/NIAA K08-AA021424、Robert Wood johnson 基金会、harold Amos 医学院发展奖、7158, IDOM IRC 试点奖 P30 DK019525 (r. m. c.);NIHPAAA F32-AA024347 (J. C.)。这项工作得到了 NIH P30-DK050306 及其核心设施 (分子病理学和成像核心、分子生物学表达核和细胞培养核心) 及其试点赠款方案的部分支持。内容完全由作者负责, 不一定代表国家卫生研究院的官方观点。

所有实验都是在实验室的长凳上进行的, 配备了适合生物安全1级的个人防护设备, 包括实验室外套、手套和安全护目镜。实验是根据宾夕法尼亚大学动物护理和使用机构委员会 (IACUC) 批准的协议进行的。所有的努力都是为了尽量减少动物的不适, 动物们受到了人道的照顾。
1. 使用 ER 隔离套件进行 LD 隔离
<ol><li>
制备 注: 列出的金额适用于单个1克小鼠肝脏。<ol>
...

<ol>
	<li>Brasaemle, D. L., Wolins, N. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+Lipid+Droplets+from+Cells+by+Density+Gradient+Centrifugation.">Isolation of Lipid Droplets from Cells by Density Gradient Centrifugation.</a> Current Protocols in Cell Biology. 72, (2016).</li><li>Ding, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolating+lipid+droplets+from+multiple+species.">Isolating lipid droplets from multiple species.</a> Nature Protocols. 8 (1), 43-51 (2013).</li><li>Gao, Q., Goodman, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+lipid+droplet-a+well-connected+organelle.">The lipid droplet-a well-connected organelle.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 3, 49 (2015).</li><li>Correnti, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ethanol+and+C2+ceramide+activate+fatty+acid+oxidation+in+human+hepatoma+cells.">Ethanol and C2 ceramide activate fatty acid oxidation in human hepatoma cells.</a> Scientific Reports. 8 (1), 12923 (2018).</li><li>Williams, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+role+for+ceramide+synthase+6+in+mouse+and+human+alcoholic+steatosis.">A novel role for ceramide synthase 6 in mouse and human alcoholic steatosis.</a> FASEB Journal. 32 (1), 130-142 (2018).</li><li>Carr, R. M., Ahima, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathophysiology+of+lipid+droplet+proteins+in+liver+diseases.">Pathophysiology of lipid droplet proteins in liver diseases.</a> Experimental Cell Research. 340 (2), 187-192 (2016).</li><li>Carr, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perilipin+Staining+Distinguishes+Between+Steatosis+and+Nonalcoholic.">Perilipin Staining Distinguishes Between Steatosis and Nonalcoholic.</a> Steatohepatitis in Adults and Children. Clinical Gastroenterology and Hepatology. 15 (1), 145-147 (2017).</li><li>Carr, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduction+of+TIP47+improves+hepatic+steatosis+and+glucose+homeostasis+in+mice.">Reduction of TIP47 improves hepatic steatosis and glucose homeostasis in mice.</a> American Journal of Physiology: Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 302 (8), R996-R1003 (2012).</li><li>Carr, R. M., Peralta, G., Yin, X., Ahima, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Absence+of+perilipin+2+prevents+hepatic+steatosis,+glucose+intolerance+and+ceramide+accumulation+in+alcohol-fed+mice.">Absence of perilipin 2 prevents hepatic steatosis, glucose intolerance and ceramide accumulation in alcohol-fed mice.</a> PLoS One. 9 (5), e97118 (2014).</li><li>Tsai, T. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+constitutive+lipid+droplet+protein+PLIN2+regulates+autophagy+in+liver.">The constitutive lipid droplet protein PLIN2 regulates autophagy in liver.</a> Autophagy. 13 (7), 1130-1144 (2017).</li><li>Guo, Y., Cordes, K. R., Farese, R. V., Walther, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+droplets+at+a+glance.">Lipid droplets at a glance.</a> Journal of Cell Science. 122 (Pt 6), 749-752 (2009).</li><li>Liu, K., Czaja, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+lipid+stores+and+metabolism+by+lipophagy.">Regulation of lipid stores and metabolism by lipophagy.</a> Cell Death and Differentiation. 20 (1), 3-11 (2013).</li><li>Mannik, J., Meyers, A., Dalhaimer, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+cellular+lipid+droplets:+two+purification+techniques+starting+from+yeast+cells+and+human+placentas.">Isolation of cellular lipid droplets: two purification techniques starting from yeast cells and human placentas.</a> Journal of Visualized Experiments. (86), e509814 (2014).</li><li>Sato, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+profiling+of+lipid+droplet+proteins+in+hepatoma+cell+lines+expressing+hepatitis+C+virus+core+protein.">Proteomic profiling of lipid droplet proteins in hepatoma cell lines expressing hepatitis C virus core protein.</a> Journal of Biochemistry. 139 (5), 921-930 (2006).</li><li>Wu, C. C., Howell, K. E., Neville, M. C., Yates, J. R., McManaman, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomics+reveal+a+link+between+the+endoplasmic+reticulum+and+lipid+secretory+mechanisms+in+mammary+epithelial+cells.">Proteomics reveal a link between the endoplasmic reticulum and lipid secretory mechanisms in mammary epithelial cells.</a> Electrophoresis. 21 (16), 3470-3482 (2000).</li><li>Zhang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphologically+and+Functionally+Distinct+Lipid+Droplet+Subpopulations.">Morphologically and Functionally Distinct Lipid Droplet Subpopulations.</a> Scientific Reports. 6, 29539 (2016).</li></ol>

肝 LD 生物学正日益被认为是健康和疾病中肝细胞生理学的关键调节剂。作为真正的细胞器, Ld 是动态的, 与其他细胞结构相互作用, 并包含在它们里面的生物活性成分参与脂质和葡萄糖的稳态。蔗糖梯度通常用于 LD 隔离, 使研究人员能够研究 LD 结构, 但它要求他们制造大量的缓冲。我们已经证明, 使用商用 ER 隔离套件是另一种工具, 不仅可用于 LD 隔离, 还可用于 ER 和溶酶体的串联隔离, 从而能够更?...

Ld 是大多数真核细胞和一些原核细胞 1, 2,3的细胞溶胶中发现的生物活性细胞器.LD 核心由中性脂质 (如甘油三酯 (TG) 和胆固醇酯组成。它们还含有神经酰胺, 参与细胞信号转导途径4,5的生物活性脂质。Ld 被磷脂单层包围, 并涂有蛋白质, 包括环素蛋白环素 2 (plin2) 和 3 (plin3)1,5, 6.此外, 还存在与几种肝性脂肪病有关的脂原酶、脂肪酶和膜贩运蛋白, 包括非酒精性脂肪肝疾病、酒精性肝病和丙型肝炎3-5 ,6,7,8,9, 10.
Ld 被认为是由 ER 的外膜形成的, 含有新合成的 TG, 来自 er 衍生的游离脂肪酸11。然而, 目前尚不清楚汇集的脂质是否芽, 保持连接, 或从 ER6,11被切除, 使 ld 从 er 摆脱技术上具有挑战性。通过表面脂肪酶的作用, 游离脂肪酸可以从 Ld 中释放, 从而提供能源生产或膜合成。此外, Ld 可以通过脂质体作为调节机制降解, 并产生游离脂肪酸12。
除了 ER 和溶酶体, 还有其他细胞器--如线粒体、内生体、过氧化物酶体和质膜--在 LDs11的紧密关联中发现。这种严格的一夫多妻制使得它很难执行一个纯粹的 LD 提取。然而, 中性脂的先天低密度可以通过离心5加以利用.
传统上, ld 是使用蔗糖密度梯度1,5,13隔离的。然而, 这些方法并没有被设计用来分离其他细胞器。此外, 它们还需要耗时的试剂制备。该协议调整了商业上可用的 ER 隔离套件 (请参阅材料表), 以允许 ld 隔离。我们使用套件提供的提取缓冲区, 添加 ld 隔离步骤。此外, 该协议还可用于使用相同样本的 ER 和溶酶体隔离, 从而更全面地了解 Ld 的生命周期。为了验证这一新方法, 我们对 LD 的收率、形态、大小和纯度进行了分析。我们将这里给出的结果与使用蔗糖梯度进行 LD 隔离的广泛使用的协议的结果进行了比较。
我们使用了一个10至12周的, 20 克女性 c57bl6 老鼠禁食16小时 (食物清除在下午5:00 上午 9:00 ld 隔离时间), 可以免费获得水。TG 的典型产率为 0.6 mgg 肝脏, ld 蛋白的典型产率为 0.25 mg g。这为 sds page 为 ~ 10个免疫细胞提供了足够的材料。下面的协议详细介绍了所使用的试剂和适用于单个1克肝脏的协议。蔗糖梯度隔离协议适用于佐藤14号和吴15.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:928px;" width="927">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">BioExpress Vortex Mixer</td>
			<td style="width:123px;">GeneMate</td>
			<td style="width:344px;">S-3200-1</td>
			<td style="width:245px;">Vortex Mixer</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Centrifuge 54242 R</td>
			<td style="width:123px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:344px;">54242 R</td>
			<td style="width:245px;">Refrigerated Counter Microcentrifuge 
			Rotor: FA-45-24-11</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Centrifuge Sorvall RC6 +</td>
			<td style="width:123px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:344px;">RC6+</td>
			<td style="width:245px;">Refrigerated High Speed Centrifuge 
			Rotor: F21S-8x50y</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Centrifuge Sorvall Legend RT+</td>
			<td style="width:123px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:344px;">Legend RT+</td>
			<td style="width:245px;">Refrigerated High Capacity Centrifuge 
			Rotor: 75006445 Bucket: 75006441</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">cOmplete Protease Inhibitor Cocktail</td>
			<td style="width:123px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:344px;">04 693 116 001</td>
			<td style="width:245px;">Protease Inhibitor Tablets</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Diagenode Bioruptur UCD-200</td>
			<td style="width:123px;">Diagenode</td>
			<td style="width:344px;">UCD-200</td>
			<td style="width:245px;">Sonication System</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Dounce Tissue Grinder (45 mL)</td>
			<td style="width:123px;">Wheaton</td>
			<td style="width:344px;">357546</td>
			<td style="width:245px;">Use Loose pestle</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Dulbecco&#39;s Phosphate-Buffered Saline (1x)</td>
			<td style="width:123px;">Corning</td>
			<td style="width:344px;">21-031-CM</td>
			<td style="width:245px;"></td>
		</tr>
		<tr height="160">
			<td height="160" style="height:160px;width:216px;">Endoplasmic Reticulum Isolation Kit</td>
			<td style="width:123px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:344px;">ER0100</td>
			<td style="width:245px;">For ER kit Extraction: 
			Contains: 
			Isotonic Extraction Buffer 5X 100 mL 
			Hypotonic Extraction Buffer 10 mL 
			Calcium chloride, 2.5 M solution 5 mL 
			OptiPrep Density Gradient Medium 100 mL 
			Blunt Nosed Needle 1 ea.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">External light source for flourescent excitation</td>
			<td style="width:123px;">Leica</td>
			<td style="width:344px;">Leica EL6000</td>
			<td style="width:245px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Hydrochloric acid</td>
			<td style="width:123px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:344px;">H1758</td>
			<td style="width:245px;">Hydrochloric Acid</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">ImageJ</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td style="width:245px;">Image Analysis Software</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Inverted Modulating Contrast Microscope</td>
			<td style="width:123px;">Leica</td>
			<td style="width:344px;">Leica DM IRB</td>
			<td style="width:245px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Lysosome Enrichment Kit for Tissues and Cultured Cells</td>
			<td style="width:123px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:344px;">89839</td>
			<td style="width:245px;">For Lysosome Isolation</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Microscope Camera</td>
			<td style="width:123px;">Qimaging</td>
			<td style="width:344px;">QICAM fast 1394</td>
			<td style="width:245px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Optima XL-100K Ultracentrifuge</td>
			<td style="width:123px;">Beckman-Coulter</td>
			<td style="width:344px;">XL-100K</td>
			<td style="width:245px;">Ultracentrifuge 
			Rotor: SW41Ti</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Pasteur Pipettes</td>
			<td style="width:123px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:344px;">22-042817</td>
			<td style="width:245px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Petri Dish 5 cm</td>
			<td style="width:123px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:344px;">FB0875713A&#160;</td>
			<td style="width:245px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Pierce BCA Protein Assay Kit</td>
			<td style="width:123px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:344px;">23225</td>
			<td style="width:245px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">PhosSTOP</td>
			<td style="width:123px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:344px;">04 906 845 001</td>
			<td style="width:245px;">Phosphatase Inhibior Tablets</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Sterile Surgical Blade #10</td>
			<td style="width:123px;">Pioneer</td>
			<td style="width:344px;">S2646</td>
			<td style="width:245px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Sucrose</td>
			<td style="width:123px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:344px;">S5-500</td>
			<td style="width:245px;">Crystalline/Certified ACS</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Triglyceride Liquicolor Kit</td>
			<td style="width:123px;">Stanbio&#160;</td>
			<td style="width:344px;">2200-225</td>
			<td style="width:245px;">Colorimetric Triglyceride kit</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Tris Base</td>
			<td style="width:123px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:344px;">BP152-1</td>
			<td style="width:245px;">For TE buffer</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:216px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:123px;">Fisher BioReagents</td>
			<td style="width:344px;">BP151-100</td>
			<td style="width:245px;">5%, Polyethylene glycol p-(1,1,3,3-tetramethylbutyl)-phenyl ether, Protein Lysis Reagent</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">UltraPure EDTA (0.5M, pH 8.0)</td>
			<td style="width:123px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:344px;">15575-038</td>
			<td style="width:245px;">For TE buffer</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rapid lipid droplet isolation protocol using a well-established organelle isolation kit

脂质液滴 (Ld) 是在最真核细胞和一些原核细胞的细胞溶胶中发现的生物活性细胞器。Ld 由中性脂质组成, 由磷脂和蛋白质的单层包裹。肝 ld 脂 (如神经酰胺) 和蛋白质与导致肝脂肪变性的几种疾病有关。尽管以前已经建立了 LD 隔离的方法, 但它们需要耗时的试剂制备, 而不是为隔离多个亚细胞隔间而设计的。我们试图建立一个新的协议, 以便能够从一个小鼠肝脏分离 ld, 内质网 (ER) 和溶酶体。
此外, 此处介绍的协议中使用的所有试剂都可在商业上获得, 并且在不牺牲 LD 纯度的情况下需要最少的试剂制备。在这里, 我们提出的数据, 比较这个新的协议作为一个标准的蔗糖梯度协议, 证明了相当的纯度, 形态和产量。此外, 我们可以使用相同的样本分离 ER 和溶酶体, 提供详细的洞察脂质及其相关蛋白质的形成和细胞内通量。

我们在大约30只小鼠身上用 ER 试剂盒进行了 LD 隔离, 并将结果与遵循蔗糖隔离协议的结果进行了比较。所报告的结果是典型的两个协议。小鼠连夜禁食, 可以自由获得水, 以增加 LD 产量。使用蔗糖梯度的 LD 隔离与 ER 套件 ld 隔离协议并行运行。在整个 ER 套件 LD 隔离协议中收集了 PNS、PMS、PER、Cld 和 Ld 的样本。由于蔗糖隔离协议的工作流限制, 只收集了 PNS 和 LD 隔离。
<p...

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Rapid Lipid Droplet Isolation Protocol Using a Well-established Organelle Isolation Kit

该方案建立了一种新的方法, 从小鼠肝脏脂滴分离和纯化, 使用一个完善的内质网隔离试剂盒。

利用成熟的细胞隔离试剂盒快速分离脂滴器

Lipid droplets (LDs) are bioactive organelles found within the cytosol of the most eukaryotic and some prokaryotic cells. LDs are composed of neutral ...

脂滴生物学研究因纯化困难而受阻。此外，研究细胞脂质通量需要同时纯化多个细胞器，目前没有简单的协议。该技术的主要优点是使脂滴纯化更容易获得。我们改进了一个市售套件，以同时从单个样品中分离脂质液滴、内质液和利索索姆。肝脂液滴积累容易使肥胖和酗酒患者患渐进性肝病。这已经把脂质液滴的视野从惰性储物室转移到了动态的生物重要细胞器上。首先，使用无菌钳子和解剖器将安乐死小鼠腹部的皮肤和肌肉层切在后前轴上，露出肝脏。切开连接肝脏和肠道的韧带。使用钳子，将肠子从肝脏中拉离，朝后体拉去。切断连接肝脏和隔膜的韧带。然后，在肝脏和背肋之间切开，从前到后，直到肝脏被解放。将肝脏转移到一个冷的五厘米培养皿中，用10毫升的冷1x PBS，在10毫升的1x PBS的摇杆上洗两次肝脏，在4摄氏度下洗涤5分钟。最后洗涤后，倒掉1x PBS，并使用大小为10的无菌手术刀片将肝脏切成三到五毫米的菜内碎片。然后，用10毫升的冷1x PBS洗两次切碎的肝脏，在4摄氏度下洗涤5分钟。去功能化 1x PBS，将切碎的肝脏片转移到冷的 45 毫升 Dounce 均质器中，确保所有碎片都在底部。加入7毫升的冷1x IE缓冲液。通过上下移动害虫 20 次，在冰上均质，确保害虫在每笔行程中均质器的底部。将均质转移到冷的15毫升离心管。用一毫升的冷1x IE缓冲液冲洗均质器，并将其添加到其他均质液中。为了去除核，在1000倍g的高容量离心机中，在4摄氏度下将同质质离心10分钟。确保重新暂停在 15 毫升管顶部收集的任何脂质，以防止 LD 损失。确保管底的核颗粒不受干扰，将含脂后核上清液转移到新鲜冷的 50 毫升离心管中。将核后上清液的100微升等分转移到冰上1.7毫升的冷微离心管中，供以后进行纯度分析。为了去除线粒体，在4摄氏度下将核后上上提样品以12，000倍g的冷冻高速离心机中离心15分钟。确保重新在管顶部收集的任何脂质，以防止LD损失，然后将线粒体后全权上看经剂转移到13毫升超离心管。将线粒体后上清液的100微升等分转移到冰上的冷1.7毫升微离心管中，用于以后的纯度分析。用后线粒体上清液填充超离心管，用冷 1x IE 缓冲液填充边缘，以防止它在超离心过程中崩溃。平衡样品，然后在10万次g的超离心机中离心，在4摄氏度下60分钟。要去除 LD 层，请以 45 度角倾斜管，然后用玻璃移液器吸气。将颗粒转移到冷1.7毫升微离心管后，在脂质层下收集100微升后ER上清液进行纯度分析。要对任何细胞碎片进行颗粒，以最高速度在微离心机中离心，在摄氏四度时进行五分钟。然后，用手轻轻加热管，帮助重新暂停LD层，并转移上流液，包括脂质层，到一个新的1.7毫升微离心管。重复这些洗涤步骤，加热管两到三次，直到颗粒不再可见。然后，清洗无颗粒LD上流液，在1.5毫升的最终体积中加入1x PBS，并在最高速度的微离心机中以最高速度离心5分钟，温度为4摄氏度。使用玻璃移液器去除脂层下方的 1x PBS 毫升，而不会干扰脂层。重复 LD 洗涤四到五次，直到 1x PBS 在视觉上透明，无浊度。然后，使用玻璃移液器去除脂层下方的所有 1x PBS，并使用生成的纯 LD 分数进行下游分析。当从ER套件LD隔离和蔗糖LD分离方法中拍摄出具有代表性的20倍荧光和亮场LD图像时，他们揭示了相似的颗粒物水平，表明使用两种不同协议具有相似的纯化程度。纯化后，使用色度测定法测量LD甘油三酯和蛋白质水平，数据与肝脏重量进行规范化，表明当起始材料正常化时，使用ER试剂盒和蔗糖法，LD甘油三酯和蛋白质产量相似。使用图像分析软件对LD直径进行量化，表明ER套件LD隔离和蔗糖LD隔离产生了类似尺寸的LD。为了评估LD纯度，通过免疫印迹对样品进行检测，表明从ER试剂盒LD分离和蔗糖梯度协议中提取的LD均具有同等纯度。除 ER 套件 LD 隔离 PER 和蔗糖的 PNS 外，所有样品均检测到 PLIN2，这是 LD 标记。使用免疫球蛋白对ER分数的纯度分析表明，它们不含LD标记PLIN2，但具有显著的ER SEC61A蛋白水平。还评估了使用利索索姆富集基对利索索姆进行进一步纯化后，糖体部分的纯度。发现是目前我们协议最有用的应用程序。我们在纯化的细胞器中进行脂质多，并表明脂质毒素在酒精性肝病中的脂质液滴中特别增加。

Research

JoVE Journal

Biology

Rapid Genotyping of Mouse Tissue Using Sigma's Extract-N-Amp Tissue PCR Kit

使用Sigma的提取物N -安培组织PCR试剂盒小鼠组织的快速基因分型

Genomic detection of DNA via PCR amplification and detection on an electrophoretic gel is a standard way that the genotype of a tissue sample is ...

科研

生物学

Neutrophil Isolation Protocol

嗜中性粒细胞的分离协议

Neutrophil polymorphonuclear granulocytes (PMN) are the most abundant leukocytes in humans and among the first cells to arrive on the site of inflammatory ...

Rapid Isolation And Purification Of Mitochondria For Transplantation By Tissue Dissociation And Differential Filtration

Previously described mitochondrial isolation methods using differential centrifugation and/or Ficoll gradient centrifugation require 60 to 100 min to ...

RNA Isolation from Cell Specific Subpopulations Using Laser-capture Microdissection Combined with Rapid Immunolabeling

从细胞亚群特异性RNA提取使用激光捕获显微切割加上快速的免疫标记

Laser capture microdissection (LCM) allows the isolation of specific cells from thin tissue sections with high spatial resolution. Effective LCM requires ...

Isolation and Compositional Analysis of Plant Cuticle Lipid Polyester Monomers

植物表皮脂质聚酯单体的分离及成分分析

Terrestrial plants produce extracellular aliphatic biopolyesters that modify cell walls of specific tissues. Epidermal cells synthesize cutin, a polyester ...

Filtration Isolation of Nucleic Acids:  A Simple and Rapid DNA Extraction Method

核酸的分离过滤：一种简单快速的DNA提取方法

FINA, filtration isolation of nucleic acids, is a novel extraction method which utilizes vertical filtration via a separation membrane and absorbent pad ...

A Simple High Efficiency Protocol for Pancreatic Islet Isolation from Mice

胰腺胰岛与小鼠分离的简单高效协议

Pancreatic islets, also called the Islets of Langerhans, are a cluster of endocrine cells which produces hormones for glucose regulation and other ...

Dissection and Lipid Droplet Staining of Oenocytes in Drosophila Larvae

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果蝇幼虫的欧诺细胞的解剖和脂滴染色

Lipids are essential for animal development and physiological homeostasis. Dysregulation of lipid metabolism results in various developmental defects and ...

Rapid In Vivo Fixation and Isolation of Translational Complexes from Eukaryotic Cells

Rapid In Vivo Fixation and Isolation of Translational Complexes from Eukaryotic Cells

从真核细胞 中快速体内 固定和分离转化复合物

Rapid responses involving fast redistribution of messenger(m)RNA and alterations of mRNA translation are pertinent to ongoing homeostatic adjustments of ...