Name: rapid lipid droplet isolation protocol using a well-established organelle isolation kit
Uploaded: 2019-04-19T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Rapid Lipid Droplet Isolation Protocol Using a Well-established Organelle Isolation Kit at JoVE.com

Vi takker Abramson familie Cancer Research Institute. Dette arbejde støttes af følgende tilskud: NIH/NIAAA R01 AA026302-01, NIH/NIAAA K08-AA021424, Robert Wood Johnson Foundation, Harold Amos medicinske fakultet udvikling Award, 7158, IDOM DRC Pilot Award P30 DK019525 (R.M.C.); NIH/NIAAA F32-AA024347 (JC). Dette arbejde blev delvist understøttet af NIH P30-DK050306 og dens kerne faciliteter (Molekylær Patologi og Imaging Core, molekylær biologi/gen Expression kerne og celle kultur Core) og dens pilot tilskud program. Indholdet er udelukkende ansvarlig for forfattere og repræsenterer ikke nødvendigvis de officielle synspunkter af National Institutes of Health.

Alle eksperimenter blev udført på et laboratoriebænk med personlige værnemidler, der er relevante for Biosikkerhed niveau 1, herunder en laboratoriekittel, handsker og beskyttelsesbriller. Eksperimenter blev udført efter protokoller, godkendt af institutionelle Animal Care og brug udvalg (IACUC) fra University of Pennsylvania. Alle bestræbelser var at minimere animalske ubehag, og dyrene blev behandlet med human pleje.
1. LD isolation ved hjælp af en ER isolering kit
<ol><li>
...

<ol>
	<li>Brasaemle, D. L., Wolins, N. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+Lipid+Droplets+from+Cells+by+Density+Gradient+Centrifugation.">Isolation of Lipid Droplets from Cells by Density Gradient Centrifugation.</a> Current Protocols in Cell Biology. 72, (2016).</li><li>Ding, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolating+lipid+droplets+from+multiple+species.">Isolating lipid droplets from multiple species.</a> Nature Protocols. 8 (1), 43-51 (2013).</li><li>Gao, Q., Goodman, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+lipid+droplet-a+well-connected+organelle.">The lipid droplet-a well-connected organelle.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 3, 49 (2015).</li><li>Correnti, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ethanol+and+C2+ceramide+activate+fatty+acid+oxidation+in+human+hepatoma+cells.">Ethanol and C2 ceramide activate fatty acid oxidation in human hepatoma cells.</a> Scientific Reports. 8 (1), 12923 (2018).</li><li>Williams, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+role+for+ceramide+synthase+6+in+mouse+and+human+alcoholic+steatosis.">A novel role for ceramide synthase 6 in mouse and human alcoholic steatosis.</a> FASEB Journal. 32 (1), 130-142 (2018).</li><li>Carr, R. M., Ahima, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathophysiology+of+lipid+droplet+proteins+in+liver+diseases.">Pathophysiology of lipid droplet proteins in liver diseases.</a> Experimental Cell Research. 340 (2), 187-192 (2016).</li><li>Carr, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perilipin+Staining+Distinguishes+Between+Steatosis+and+Nonalcoholic.">Perilipin Staining Distinguishes Between Steatosis and Nonalcoholic.</a> Steatohepatitis in Adults and Children. Clinical Gastroenterology and Hepatology. 15 (1), 145-147 (2017).</li><li>Carr, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduction+of+TIP47+improves+hepatic+steatosis+and+glucose+homeostasis+in+mice.">Reduction of TIP47 improves hepatic steatosis and glucose homeostasis in mice.</a> American Journal of Physiology: Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 302 (8), R996-R1003 (2012).</li><li>Carr, R. M., Peralta, G., Yin, X., Ahima, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Absence+of+perilipin+2+prevents+hepatic+steatosis,+glucose+intolerance+and+ceramide+accumulation+in+alcohol-fed+mice.">Absence of perilipin 2 prevents hepatic steatosis, glucose intolerance and ceramide accumulation in alcohol-fed mice.</a> PLoS One. 9 (5), e97118 (2014).</li><li>Tsai, T. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+constitutive+lipid+droplet+protein+PLIN2+regulates+autophagy+in+liver.">The constitutive lipid droplet protein PLIN2 regulates autophagy in liver.</a> Autophagy. 13 (7), 1130-1144 (2017).</li><li>Guo, Y., Cordes, K. R., Farese, R. V., Walther, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+droplets+at+a+glance.">Lipid droplets at a glance.</a> Journal of Cell Science. 122 (Pt 6), 749-752 (2009).</li><li>Liu, K., Czaja, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+lipid+stores+and+metabolism+by+lipophagy.">Regulation of lipid stores and metabolism by lipophagy.</a> Cell Death and Differentiation. 20 (1), 3-11 (2013).</li><li>Mannik, J., Meyers, A., Dalhaimer, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+cellular+lipid+droplets:+two+purification+techniques+starting+from+yeast+cells+and+human+placentas.">Isolation of cellular lipid droplets: two purification techniques starting from yeast cells and human placentas.</a> Journal of Visualized Experiments. (86), e509814 (2014).</li><li>Sato, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+profiling+of+lipid+droplet+proteins+in+hepatoma+cell+lines+expressing+hepatitis+C+virus+core+protein.">Proteomic profiling of lipid droplet proteins in hepatoma cell lines expressing hepatitis C virus core protein.</a> Journal of Biochemistry. 139 (5), 921-930 (2006).</li><li>Wu, C. C., Howell, K. E., Neville, M. C., Yates, J. R., McManaman, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomics+reveal+a+link+between+the+endoplasmic+reticulum+and+lipid+secretory+mechanisms+in+mammary+epithelial+cells.">Proteomics reveal a link between the endoplasmic reticulum and lipid secretory mechanisms in mammary epithelial cells.</a> Electrophoresis. 21 (16), 3470-3482 (2000).</li><li>Zhang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphologically+and+Functionally+Distinct+Lipid+Droplet+Subpopulations.">Morphologically and Functionally Distinct Lipid Droplet Subpopulations.</a> Scientific Reports. 6, 29539 (2016).</li></ol>

Hepatisk LD biologi anerkendes i stigende grad som en kritisk regulator af hepatocellulært fysiologi i både sundhed og sygdom. Som bona fide organeller, LDs er dynamiske, interagere med andre cellulære strukturer og indeholde inden for dem bioaktive komponenter involveret i både lipid og glukose homøostase. Saccharose gradient bruges rutinemæssigt til LD isolation og gør det muligt for efterforskerne at studere LD struktur, men det kræver dem til at gøre mange buffere. Vi har vist, at brug af et kommercielt tilg...

LDs er bioaktive organelles fundet i cytosol af mest eukaryote celler og nogle Prokaryote celler1,2,3. LD kernen er sammensat af neutrale lipider som triglycerid (TG) og kolesterol estere. De indeholder også ceramider, bioaktive lipider involveret i cellulære signaling veje4,5. LDs er omgivet af en phospholipid éncellelag og belagt med proteiner, herunder perilipin proteiner perilipin 2 (PLIN2) og 3 (PLIN3)1,5,6. Også til stede er lipogenic enzymer, lipaser og membran menneskehandel proteiner, der har været knyttet til flere hepatisk steatotic sygdomme, herunder ikke-alkoholiske fedtlever sygdom, alkoholisk leversygdom og hepatitis C3,5 ,6,7,8,9,10.
LDs menes at danne fra den ydre membran af Skadestuen og indeholde nyligt syntetiserede TG stammer fra ER-afledte frie fedtsyrer11. Men det er stadig ukendt om de poolede lipider bud, forblive tilsluttet, eller er skåret ud fra de ER6,11, at isolationen af LDs gratis fra ER teknisk udfordrende. Frie fedtsyrer kan blive befriet fra LDs ved hjælp af overflade lipaser at fastsaette energiproduktion eller membran syntese. Derudover kan LDs nedbrydes via lipophagy, som en reguleringsmekanisme og producere frie fedtsyrer12.
Udover ER og lysosomer, findes der andre organeller — som mitokondrier, endosomes, peroxisomer og plasmamembran — der findes inden for nære LDs11. Denne stramme polygami gør det vanskeligt at udføre en ren LD udvinding. Imidlertid kan neutral lipider medfødte lav tæthed udnyttes via centrifugering5.
LDs har traditionelt været isoleret ved hjælp af en saccharose tæthed gradient1,5,13. Men disse metoder ikke er designet til at isolere andre organeller. Desuden kræver de tidskrævende forberedelse af reagenser. Denne protokol tilpasser en kommercielt tilgængelig ER isolering kit (Se Tabel af materialer) for at muliggøre LD isolation. Vi bruger ekstraktionsbuffer leveres af kit, tilføje en LD isolation trin. Protokollen kan desuden også bruges til ER og lysosomale isolation ved hjælp af de samme prøver, giver mulighed for en mere omfattende billede af LDs livscyklus. Hvis du vil validere denne nye metode, assay vi LD udbytte, morfologi, størrelse og renhed. Vi sammenligner resultaterne præsenteres her til dem, der opnås med en udbredte protokol udnytter en saccharose gradient til LD isolation.
Vi brugte en 10 til 12-uger gamle, 20 g kvindelige C57BL/6 mus fastede for 16 h (mad fjernelse i 9:00 A.M. LD isolation tid kl) med fri adgang til vand. Det typiske afkast for TG er 0,6 mg/g lever, og for LD protein, det er 0,25 mg/g lever. Dette giver nok materiale til ~ 10 immunoblots af SDS side. Protokollen under detaljer de reagenser og en protokol, der er egnet til en enkelt 1 g lever. Saccharose gradient isolation protokol er tilpasset fra Sato14 og Wu15.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:928px;" width="927">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">BioExpress Vortex Mixer</td>
			<td style="width:123px;">GeneMate</td>
			<td style="width:344px;">S-3200-1</td>
			<td style="width:245px;">Vortex Mixer</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Centrifuge 54242 R</td>
			<td style="width:123px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:344px;">54242 R</td>
			<td style="width:245px;">Refrigerated Counter Microcentrifuge 
			Rotor: FA-45-24-11</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Centrifuge Sorvall RC6 +</td>
			<td style="width:123px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:344px;">RC6+</td>
			<td style="width:245px;">Refrigerated High Speed Centrifuge 
			Rotor: F21S-8x50y</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Centrifuge Sorvall Legend RT+</td>
			<td style="width:123px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:344px;">Legend RT+</td>
			<td style="width:245px;">Refrigerated High Capacity Centrifuge 
			Rotor: 75006445 Bucket: 75006441</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">cOmplete Protease Inhibitor Cocktail</td>
			<td style="width:123px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:344px;">04 693 116 001</td>
			<td style="width:245px;">Protease Inhibitor Tablets</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Diagenode Bioruptur UCD-200</td>
			<td style="width:123px;">Diagenode</td>
			<td style="width:344px;">UCD-200</td>
			<td style="width:245px;">Sonication System</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Dounce Tissue Grinder (45 mL)</td>
			<td style="width:123px;">Wheaton</td>
			<td style="width:344px;">357546</td>
			<td style="width:245px;">Use Loose pestle</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Dulbecco&#39;s Phosphate-Buffered Saline (1x)</td>
			<td style="width:123px;">Corning</td>
			<td style="width:344px;">21-031-CM</td>
			<td style="width:245px;"></td>
		</tr>
		<tr height="160">
			<td height="160" style="height:160px;width:216px;">Endoplasmic Reticulum Isolation Kit</td>
			<td style="width:123px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:344px;">ER0100</td>
			<td style="width:245px;">For ER kit Extraction: 
			Contains: 
			Isotonic Extraction Buffer 5X 100 mL 
			Hypotonic Extraction Buffer 10 mL 
			Calcium chloride, 2.5 M solution 5 mL 
			OptiPrep Density Gradient Medium 100 mL 
			Blunt Nosed Needle 1 ea.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">External light source for flourescent excitation</td>
			<td style="width:123px;">Leica</td>
			<td style="width:344px;">Leica EL6000</td>
			<td style="width:245px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Hydrochloric acid</td>
			<td style="width:123px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:344px;">H1758</td>
			<td style="width:245px;">Hydrochloric Acid</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">ImageJ</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td style="width:245px;">Image Analysis Software</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Inverted Modulating Contrast Microscope</td>
			<td style="width:123px;">Leica</td>
			<td style="width:344px;">Leica DM IRB</td>
			<td style="width:245px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Lysosome Enrichment Kit for Tissues and Cultured Cells</td>
			<td style="width:123px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:344px;">89839</td>
			<td style="width:245px;">For Lysosome Isolation</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Microscope Camera</td>
			<td style="width:123px;">Qimaging</td>
			<td style="width:344px;">QICAM fast 1394</td>
			<td style="width:245px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Optima XL-100K Ultracentrifuge</td>
			<td style="width:123px;">Beckman-Coulter</td>
			<td style="width:344px;">XL-100K</td>
			<td style="width:245px;">Ultracentrifuge 
			Rotor: SW41Ti</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Pasteur Pipettes</td>
			<td style="width:123px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:344px;">22-042817</td>
			<td style="width:245px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Petri Dish 5 cm</td>
			<td style="width:123px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:344px;">FB0875713A&#160;</td>
			<td style="width:245px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Pierce BCA Protein Assay Kit</td>
			<td style="width:123px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:344px;">23225</td>
			<td style="width:245px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">PhosSTOP</td>
			<td style="width:123px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:344px;">04 906 845 001</td>
			<td style="width:245px;">Phosphatase Inhibior Tablets</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Sterile Surgical Blade #10</td>
			<td style="width:123px;">Pioneer</td>
			<td style="width:344px;">S2646</td>
			<td style="width:245px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Sucrose</td>
			<td style="width:123px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:344px;">S5-500</td>
			<td style="width:245px;">Crystalline/Certified ACS</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Triglyceride Liquicolor Kit</td>
			<td style="width:123px;">Stanbio&#160;</td>
			<td style="width:344px;">2200-225</td>
			<td style="width:245px;">Colorimetric Triglyceride kit</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Tris Base</td>
			<td style="width:123px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:344px;">BP152-1</td>
			<td style="width:245px;">For TE buffer</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:216px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:123px;">Fisher BioReagents</td>
			<td style="width:344px;">BP151-100</td>
			<td style="width:245px;">5%, Polyethylene glycol p-(1,1,3,3-tetramethylbutyl)-phenyl ether, Protein Lysis Reagent</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">UltraPure EDTA (0.5M, pH 8.0)</td>
			<td style="width:123px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:344px;">15575-038</td>
			<td style="width:245px;">For TE buffer</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rapid lipid droplet isolation protocol using a well-established organelle isolation kit

Lipid dråber (LDs) er bioaktive organelles fundet i cytosol af den mest eukaryote og nogle Prokaryote celler. LDs er sammensat af neutrale lipider indkapslet af en éncellelag af fosfolipider og proteiner. Hepatisk LD lipider, ceramider og proteiner er involveret i flere sygdomme, der forårsager hepatisk steatose. Selvom tidligere metoder er blevet fastlagt for LD isolation, de kræver en tidskrævende forberedelse af reagenser og er ikke beregnet til isolering af flere subcellulært rum. Vi forsøgte at etablere en ny protokol for at aktivere isolering af LDs, endoplasmatiske reticulum (ER) og lysosomer fra en enkelt mus lever.
Yderligere, alle reagenser, der anvendes i den protokol, der præsenteres her er kommercielt tilgængelige og kræver minimal reagens uden at ofre LD renhed. Her præsenterer vi data sammenligner denne nye protokol til en standard saccharose gradient protokol, demonstrere sammenlignelige renhed, morfologi og udbytte. Derudover kan vi isolere ER og lysosomer ved hjælp af den samme prøve, giver detaljeret indsigt i dannelsen og intracellulære flux af lipider og deres tilknyttede proteiner.

Vi har udført LD isolation ER Kit på ca. 30 mus og sammenlignet resultaterne med dem efter saccharose isolation protokol på ca 40 mus. De rapporterede resultater er typiske for begge protokoller. Mus blev fastede natten med fri adgang til vand, til at øge LD udbyttet. LD isolation ved hjælp af en saccharose gradient blev kørt sideløbende med ER kit LD isolation protokol. Prøver af PNS, PMS, PER, CLDs og LDs blev indsamlet i hele ER kit LD isolation protokol. På grund af arbejdspr...

Watch this Scientific Journal Video about Rapid Lipid Droplet Isolation Protocol Using a Well-established Organelle Isolation Kit at JoVE.com

Rapid Lipid Droplet Isolation Protocol Using a Well-established Organelle Isolation Kit

Denne protokol fastsætter en roman metode af lipid droplet isolering og oprensning fra mus lever, ved hjælp af en veletableret endoplasmatiske reticulum isolering kit.

Hurtig Lipid Droplet Isolation protokollen ved hjælp af en almindelig Organelle isolering Kit

Lipid droplets (LDs) are bioactive organelles found within the cytosol of the most eukaryotic and some prokaryotic cells. LDs are composed of neutral ...

Forskning i lipid dråbe biologi er blevet hæmmet af vanskeligheder med rensning. Derudover, studere cellulære lipid flux kræver samtidig rensning af flere organeller, og ingen enkle protokoller var i øjeblikket tilgængelige. Den største fordel ved denne teknik er at gøre lipid dråberensning mere tilgængelig.Vi har ændret et kommercielt tilgængeligt sæt til samtidig at isolere lipiddråber, endoplasmatisk reticulum og lysosomer fra en enkelt prøve. Lever lipid dråbe ophobning prædisponerer overvægtige og alkoholiske patienter til progressiv leversygdom. Dette har flyttet visningen af lipiddråber fra inerte opbevaringsrum til dynamiske biologisk vigtige organeller.Til at begynde, bruge sterile kraftbefængte og dissektion saks til at skære hud og muskler lag af maven af den aflivede mus på den bageste-forreste akse, udsætter leveren. Skær ledbånd forbinder leveren til tarmen. Ved hjælp af spån, trække tarmen væk fra leveren, mod den bageste.Skær ledbånd forbinder leveren til mellemgulvet. Derefter skæres mellem leveren og den dorsale brystkasse, bevæger sig fra forreste til bageste, indtil leveren er befriet. Overfør leveren til en kold fem-centimeter petriskål med 10 milliliter koldt 1x PBS, og vask leveren to gange på en gyngeplatform i 10 milliliter kold 1x PBS i fem minutter ved fire grader Celsius.Efter den endelige vask, hæld 1x PBS, og bruge en størrelse-10 steril kirurgisk klinge til at terninger leveren i tre-til fem-millimeter stykker i skålen. Derefter vaskes hakkede lever to gange med 10 milliliter kold 1x PBS i fem minutter ved fire grader Celsius. Dekanter 1x PBS, og overføre hakkede leverstykker til en kold 45-milliliter Dounce homogenisator, sikre alle stykker er i bunden.Tilføj syv milliliter kold 1x IE buffer. Homogeniser på is ved at flytte støderen op og ned 20 gange, og sørg for, at støderen går til bunden af homogenisen under hvert slag. Homogenatet overføres til et koldt 15-milliliter centrifugerør.Homogenisatoren skylles med en milliliter kold 1x IE-buffer, og tilsæt den til resten af homogenatet. For at fjerne kerner centrifuge homogenatet i en centrifuge med høj kapacitet ved 1,000 gange g i 10 minutter ved fire grader Celsius. Sørg for, at lipider, der er samlet øverst på 15-milliliterrøret, resuspendeses for at forhindre tab af LD.Sørg for, at nuklear pellet i bunden af røret er uforstyrret, overføre lipid-holdige post-nukleare supernatant til en frisk kold 50-milliliter centrifuge rør. Overfør en 100-mikroliter aliquot af post-nukleare supernatant til en kold 1,7-milliliter mikrocentrifuge rør på is til senere renhed analyse. For at fjerne mitokondrier, centrifuge den post-nukleare supernatant prøve i en nedkølet højhastighedscentrifuge på 12, 000 gange g i 15 minutter ved fire grader Celsius.Sørg for, at lipider, der er samlet i toppen af røret, opslænnes for at forhindre tab af LD, og overfør derefter det post-mitokondrielle supernatant til et 13-milliliter ultracentrifugerør. Overfør en 100-mikroliter aliquot af post-mitokondriel supernatant til en kold 1,7-milliliter mikrocentrifuge rør på is til senere renhed analyse. Fyld ultracentrifuge røret med post-mitokondriel supernatant til randen med kold 1x IE buffer, for at forhindre det kollapser under ultracentrifugering.Balance prøverne, og derefter centrifuge i en ultracentrifuge ved 100, 000 gange g i 60 minutter ved fire grader Celsius. For at fjerne LD-laget skal du vippe røret i en vinkel på 45 grader og aspirere med en glaspipette. Efter overførsel af pellet til en kold 1,7-milliliter mikrocentrifuge rør, indsamle 100 mikroliter af post-ER supernatant under lipid lag for renhed analyse.At pellet enhver celle vragrester, centrifuge i en mikrocentrifuge ved tophastighed i fem minutter ved fire grader Celsius. Derefter varme røret forsigtigt med hænder til at hjælpe resuspendere LD lag, og overføre supernatant, herunder lipid lag, til en ny 1,7-milliliter mikrocentrifuge rør. Gentag disse vasketrin, opvarmning røret to til tre gange, indtil pellet ikke længere er synlig.Derefter, at vaske pellet-fri LD supernatant, tilføje 1x PBS til et endeligt volumen på 1,5 milliliter, og centrifuge i en mikrocentrifuge ved tophastighed i fem minutter ved fire grader Celsius. Brug en glaspipette til at fjerne en milliliter 1x PBS, som er under lipidlaget, uden at forstyrre lipidlaget. Gentag LD vask fire til fem gange, indtil 1x PBS er visuelt gennemsigtig uden turbiditet.Brug derefter en glaspipette til at fjerne alle 1x PBS under lipidlaget, og brug den resulterende rene LD-fraktion til downstream-analyse. Når repræsentative 20x fluorescerende og brightfield LD billeder blev taget fra både ER kit LD isolation og saccharose LD isolation metoder, de afslørede lignende niveauer af partikler, hvilket tyder på lignende renhed ved hjælp af to forskellige protokoller. Efter rensningen blev LD-triglycerid- og proteinniveauerne målt ved hjælp af kolometriske analyser, og dataene blev normaliseret til levervægt, hvilket viste, at når udgangsmaterialet blev normaliseret, var LD triglycerid og proteinudbytte ens ved hjælp af ER-sættet og saccharosemetoden.LD diametre blev kvantificeret ved hjælp af billedanalyse software, der viser, at ER kit LD isolation og saccharose LD isolation gav LDs af samme størrelse. For at vurdere LD renhed, prøver blev analyseret ved immunoblotting, viser, at DE stammer fra ER kit LD isolation og saccharose gradient protokol begge havde samme renhed. PLIN2, en LD-markør, blev påvist i alle prøver undtagen ER-sættet LD isolation PER og saccharose's PNS.Renhedsanalyse af en ER-fraktion ved hjælp af immunoblots viser, at de var fri for LD-markør PLIN2, men havde betydelige niveauer af ER SEC61A-proteinet. Renheden af en lysosomal fraktion efter yderligere rensning af lysosomer ved hjælp af lysosomberigelsessættet blev også vurderet. Discovery er i øjeblikket den mest nyttige anvendelse af vores protokol.Vi udfører lipidomics i rensede organeller, og viste lipotoxiner er steget specifikt i lipid dråber i alkoholisk leversygdom.

Research

JoVE Journal

Biology

Rapid Genotyping of Mouse Tissue Using Sigma's Extract-N-Amp Tissue PCR Kit

Genomic detection of DNA via PCR amplification and detection on an electrophoretic gel is a standard way that the genotype of a tissue sample is ...

Neutrophil Isolation Protocol

Neutrophil polymorphonuclear granulocytes (PMN) are the most abundant leukocytes in humans and among the first cells to arrive on the site of inflammatory ...

Rapid Isolation And Purification Of Mitochondria For Transplantation By Tissue Dissociation And Differential Filtration

Hurtig isolering og oprensning af mitokondrier til transplantation Ved Tissue Dissociation og differentieret Filtrering

Previously described mitochondrial isolation methods using differential centrifugation and/or Ficoll gradient centrifugation require 60 to 100 min to ...

RNA Isolation from Cell Specific Subpopulations Using Laser-capture Microdissection Combined with Rapid Immunolabeling

RNA Isolation fra celle specielle befolkningsgrupper ved hjælp af laser-capture mikrodissektion Kombineret med Rapid immunolabeling

Laser capture microdissection (LCM) allows the isolation of specific cells from thin tissue sections with high spatial resolution. Effective LCM requires ...

Isolation and Compositional Analysis of Plant Cuticle Lipid Polyester Monomers

Isolering og analyse af sammensætningen af ​​Plant neglebånd Lipid Polyester Monomerer

Terrestrial plants produce extracellular aliphatic biopolyesters that modify cell walls of specific tissues. Epidermal cells synthesize cutin, a polyester ...

Filtration Isolation of Nucleic Acids:  A Simple and Rapid DNA Extraction Method

Filtrering Isolering af nukleinsyrer: en enkel og hurtig DNA Extraction Method

FINA, filtration isolation of nucleic acids, is a novel extraction method which utilizes vertical filtration via a separation membrane and absorbent pad ...

A Simple High Efficiency Protocol for Pancreatic Islet Isolation from Mice

En simpel højeffektiv protokol til den pankreatiske ø-isolation fra mus

Pancreatic islets, also called the Islets of Langerhans, are a cluster of endocrine cells which produces hormones for glucose regulation and other ...

Dissection and Lipid Droplet Staining of Oenocytes in Drosophila Larvae

Dissection and Lipid Droplet Staining of Oenocytes in Drosophila Larvae

Dissektion og lipid dråbe farvning af Oenocytter i Drosophila larver

Lipids are essential for animal development and physiological homeostasis. Dysregulation of lipid metabolism results in various developmental defects and ...

Rapid In Vivo Fixation and Isolation of Translational Complexes from Eukaryotic Cells

Rapid In Vivo Fixation and Isolation of Translational Complexes from Eukaryotic Cells

Hurtig In Vivo Fiksering og isolering af translationelle komplekser fra eukaryote celler

Rapid responses involving fast redistribution of messenger(m)RNA and alterations of mRNA translation are pertinent to ongoing homeostatic adjustments of ...

Sample Preparation for Rapid Lipid Analysis in Drosophila Brain Using Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Mass Spectrometry Imaging

Sample Preparation for Rapid Lipid Analysis in Drosophila Brain Using Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Mass Spectrometry Imaging

Prøveforberedelse til hurtig lipidanalyse i Drosophila-hjernen ved hjælp af matrixassisteret laserdesorption / ioniseringsmassespektrometribilleddannelse