Name: rapid lipid droplet isolation protocol using a well-established organelle isolation kit
Uploaded: 2019-04-19T14:00:00
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हम अब्रामसन फैमिली कैंसर रिसर्च इंस्टीट्यूट का शुक्रिया अदा करते हैं । यह काम निम्नलिखित अनुदान द्वारा समर्थित है: NIH/निएएए R01 AA026302-01, NIH/निएएए K08-AA021424, रॉबर्ट वुड जॉनसन फाउंडेशन, हेरोल्ड अमोस चिकित्सा संकाय विकास पुरस्कार, ७१५८, IDOM DRC पायलट पुरस्कार P30 DK019525 (R.M.C.); NIH/निएएए F32-AA024347 (जेसी) । इस काम के हिस्से में NIH P30-DK050306 और उसके प्रमुख सुविधाओं (आणविक पैथोलॉजी और इमेजिंग कोर, आणविक जीवविज्ञान/जीन अभिव्यक्ति कोर, और सेल संस्कृति कोर) और इसके पायलट अनुदान कार्यक्रम द्वारा समर्थित था । सामग्री केवल लेखकों की जिंमेदारी है और जरूरी स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थानों के सरकारी विचारों का प्रतिनिधित्व नहीं करता है ।

सभी प्रयोगों प्रयोगशाला कोट, दस्ताने, और सुरक्षा चश्में सहित जैव सुरक्षा स्तर 1 के लिए उपयुक्त व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण के साथ एक लेबोरेटरी बेंच पर आयोजित किया गया । प्रयोग किया गया प्रोटोकॉल के अनुसार...

<ol>
	<li>Brasaemle, D. L., Wolins, N. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+Lipid+Droplets+from+Cells+by+Density+Gradient+Centrifugation.">Isolation of Lipid Droplets from Cells by Density Gradient Centrifugation.</a> Current Protocols in Cell Biology. 72, (2016).</li><li>Ding, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolating+lipid+droplets+from+multiple+species.">Isolating lipid droplets from multiple species.</a> Nature Protocols. 8 (1), 43-51 (2013).</li><li>Gao, Q., Goodman, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+lipid+droplet-a+well-connected+organelle.">The lipid droplet-a well-connected organelle.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 3, 49 (2015).</li><li>Correnti, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ethanol+and+C2+ceramide+activate+fatty+acid+oxidation+in+human+hepatoma+cells.">Ethanol and C2 ceramide activate fatty acid oxidation in human hepatoma cells.</a> Scientific Reports. 8 (1), 12923 (2018).</li><li>Williams, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+role+for+ceramide+synthase+6+in+mouse+and+human+alcoholic+steatosis.">A novel role for ceramide synthase 6 in mouse and human alcoholic steatosis.</a> FASEB Journal. 32 (1), 130-142 (2018).</li><li>Carr, R. M., Ahima, R. 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M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduction+of+TIP47+improves+hepatic+steatosis+and+glucose+homeostasis+in+mice.">Reduction of TIP47 improves hepatic steatosis and glucose homeostasis in mice.</a> American Journal of Physiology: Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 302 (8), R996-R1003 (2012).</li><li>Carr, R. M., Peralta, G., Yin, X., Ahima, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Absence+of+perilipin+2+prevents+hepatic+steatosis,+glucose+intolerance+and+ceramide+accumulation+in+alcohol-fed+mice.">Absence of perilipin 2 prevents hepatic steatosis, glucose intolerance and ceramide accumulation in alcohol-fed mice.</a> PLoS One. 9 (5), e97118 (2014).</li><li>Tsai, T. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+constitutive+lipid+droplet+protein+PLIN2+regulates+autophagy+in+liver.">The constitutive lipid droplet protein PLIN2 regulates autophagy in liver.</a> Autophagy. 13 (7), 1130-1144 (2017).</li><li>Guo, Y., Cordes, K. R., Farese, R. V., Walther, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+droplets+at+a+glance.">Lipid droplets at a glance.</a> Journal of Cell Science. 122 (Pt 6), 749-752 (2009).</li><li>Liu, K., Czaja, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+lipid+stores+and+metabolism+by+lipophagy.">Regulation of lipid stores and metabolism by lipophagy.</a> Cell Death and Differentiation. 20 (1), 3-11 (2013).</li><li>Mannik, J., Meyers, A., Dalhaimer, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+cellular+lipid+droplets:+two+purification+techniques+starting+from+yeast+cells+and+human+placentas.">Isolation of cellular lipid droplets: two purification techniques starting from yeast cells and human placentas.</a> Journal of Visualized Experiments. (86), e509814 (2014).</li><li>Sato, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+profiling+of+lipid+droplet+proteins+in+hepatoma+cell+lines+expressing+hepatitis+C+virus+core+protein.">Proteomic profiling of lipid droplet proteins in hepatoma cell lines expressing hepatitis C virus core protein.</a> Journal of Biochemistry. 139 (5), 921-930 (2006).</li><li>Wu, C. C., Howell, K. E., Neville, M. C., Yates, J. R., McManaman, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomics+reveal+a+link+between+the+endoplasmic+reticulum+and+lipid+secretory+mechanisms+in+mammary+epithelial+cells.">Proteomics reveal a link between the endoplasmic reticulum and lipid secretory mechanisms in mammary epithelial cells.</a> Electrophoresis. 21 (16), 3470-3482 (2000).</li><li>Zhang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphologically+and+Functionally+Distinct+Lipid+Droplet+Subpopulations.">Morphologically and Functionally Distinct Lipid Droplet Subpopulations.</a> Scientific Reports. 6, 29539 (2016).</li></ol>

यकृत LD जीवविज्ञान तेजी से दोनों स्वास्थ्य और रोग में hepatocellular शरीर क्रिया विज्ञान के एक महत्वपूर्ण नियामक के रूप में मांयता प्राप्त किया जा रहा है । सदाशयी organelles के रूप में, LDs गतिशील हैं, अंय सेलुलर संरचनाओं ...

LDs बायोएक्टिव organelles सबसे यूकैरियोटिक कोशिकाओं के cytosol में पाया जाता है और कुछ प्रोकेरियोटिक कोशिकाओं1,2,3। एलडी कोर तटस्थ लिपिड जैसे ट्राइग्लिसराइड (टीजी) और कोलेस्ट्रॉल esters से बना है । वे भी सिरेमिक, बायोएक्टिव लिपिड सेलुलर संकेत रास्ते4,5में शामिल होते हैं । LDs एक फॉस्फोलिपिड monolayer से घिरा हुआ है और प्रोटीन के साथ लेपित, perilipin प्रोटीन perilipin 2 (PLIN2) और 3 (PLIN3)1,5,6सहित । इसके अलावा मौजूद lipogenic एंजाइमों, lipases, और झिल्ली तस्करी प्रोटीन है कि कई यकृत steatotic रोगों से जोड़ा गया है, nonalcoholic फैटी लीवर रोग सहित, शराबी जिगर की बीमारी, और हेपेटाइटिस सी3,5 ,6,7,8,9,10।
LDs एर की बाहरी झिल्ली से फार्म करने के लिए लगा रहे हैं और नए संश्लेषित टीजी शामिल एर से sourced मुक्त फैटी एसिड11. हालांकि, यह अज्ञात है कि क्या पूल्ड लिपिड बड, जुड़े रहते हैं, या एर6,11से excised कर रहे हैं, एर से मुक्त LDs के अलगाव को तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण बना । नि: शुल्क फैटी एसिड के लिए ऊर्जा उत्पादन या झिल्ली संश्लेषण के लिए प्रदान करने के लिए सतह lipases की कार्रवाई से LDs से मुक्त किया जा सकता है । इसके अतिरिक्त, LDs एक नियामक तंत्र के रूप में lipophagy के माध्यम से अपमानित किया जा सकता है और मुक्त फैटी एसिड का उत्पादन12।
इसके अलावा, अन्य अंगकों-जैसे माइटोकॉन्ड्रिया, एंडोसोम्स, पेरोऑक्सिज्म और प्लाज्मा झिल्ली-जो LDs11के निकट सहयोग के भीतर पाए जाते हैं । यह तंग बहुविवाह एक शुद्ध LD निष्कर्षण करने के लिए मुश्किल बना देता है । हालांकि, तटस्थ ' lipids जंमजात कम घनत्व के माध्यम से अपकेंद्रण5का लाभ लिया जा सकता है ।
परंपरागत रूप से, LDs एक सुक्रोज घनत्व ढाल1,5,13का उपयोग कर अलग कर दिया गया है । हालांकि, इन पद्धतियों अंय organelles को अलग करने के लिए डिज़ाइन नहीं किया गया है । इसके अतिरिक्त, वे reagents के समय लेने वाली तैयारी की आवश्यकता है । इस प्रोटोकॉल एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध ईआर आइसोलेशन किट adapts ( सामग्री की तालिकादेखें) LD अलगाव के लिए अनुमति देने के लिए. हम निष्कर्षण किट द्वारा प्रदान बफर, एक LD अलगाव कदम जोड़ने का उपयोग करें । इसके अलावा, प्रोटोकॉल भी एर और लाइसोसोमल एक ही नमूने का उपयोग अलगाव के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, LDs के जीवन चक्र के एक अधिक व्यापक छवि के लिए अनुमति दी । इस नई विधि को मांय करने के लिए, हम LD उपज, morphology, आकार, और शुद्धता परख । हम यहां प्रस्तुत परिणामों की तुलना एक व्यापक रूप से इस्तेमाल किया प्रोटोकॉल LD अलगाव के लिए एक सुक्रोज ढाल का उपयोग के साथ प्राप्त किया ।
हम एक 10-12-सप्ताह पुराने, 20 ग्राम महिला C57BL/6 माउस के लिए ५.०० बजे (भोजन को हटाने के लिए एक ९.०० A.M. के लिए पानी का उपयोग करने के साथ LD अलगाव समय) । टीजी के लिए ठेठ उपज ०.६ मिलीग्राम/जी जिगर है, और LD प्रोटीन के लिए, यह ०.२५ मिलीग्राम/ इस SDS पृष्ठ द्वारा ~ 10 immunoblots के लिए पर्याप्त सामग्री प्रदान करता है । नीचे प्रोटोकॉल का उपयोग किया अभिकर्मक और एक प्रोटोकॉल एक एकल 1 जी जिगर के लिए उपयुक्त है । सुक्रोज ढाल अलगाव प्रोटोकॉल सातो14 और वू15से अनुकूलित है ।

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:928px;" width="927">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">BioExpress Vortex Mixer</td>
			<td style="width:123px;">GeneMate</td>
			<td style="width:344px;">S-3200-1</td>
			<td style="width:245px;">Vortex Mixer</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Centrifuge 54242 R</td>
			<td style="width:123px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:344px;">54242 R</td>
			<td style="width:245px;">Refrigerated Counter Microcentrifuge 
			Rotor: FA-45-24-11</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Centrifuge Sorvall RC6 +</td>
			<td style="width:123px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:344px;">RC6+</td>
			<td style="width:245px;">Refrigerated High Speed Centrifuge 
			Rotor: F21S-8x50y</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Centrifuge Sorvall Legend RT+</td>
			<td style="width:123px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:344px;">Legend RT+</td>
			<td style="width:245px;">Refrigerated High Capacity Centrifuge 
			Rotor: 75006445 Bucket: 75006441</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">cOmplete Protease Inhibitor Cocktail</td>
			<td style="width:123px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:344px;">04 693 116 001</td>
			<td style="width:245px;">Protease Inhibitor Tablets</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Diagenode Bioruptur UCD-200</td>
			<td style="width:123px;">Diagenode</td>
			<td style="width:344px;">UCD-200</td>
			<td style="width:245px;">Sonication System</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Dounce Tissue Grinder (45 mL)</td>
			<td style="width:123px;">Wheaton</td>
			<td style="width:344px;">357546</td>
			<td style="width:245px;">Use Loose pestle</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Dulbecco&#39;s Phosphate-Buffered Saline (1x)</td>
			<td style="width:123px;">Corning</td>
			<td style="width:344px;">21-031-CM</td>
			<td style="width:245px;"></td>
		</tr>
		<tr height="160">
			<td height="160" style="height:160px;width:216px;">Endoplasmic Reticulum Isolation Kit</td>
			<td style="width:123px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:344px;">ER0100</td>
			<td style="width:245px;">For ER kit Extraction: 
			Contains: 
			Isotonic Extraction Buffer 5X 100 mL 
			Hypotonic Extraction Buffer 10 mL 
			Calcium chloride, 2.5 M solution 5 mL 
			OptiPrep Density Gradient Medium 100 mL 
			Blunt Nosed Needle 1 ea.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">External light source for flourescent excitation</td>
			<td style="width:123px;">Leica</td>
			<td style="width:344px;">Leica EL6000</td>
			<td style="width:245px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Hydrochloric acid</td>
			<td style="width:123px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:344px;">H1758</td>
			<td style="width:245px;">Hydrochloric Acid</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">ImageJ</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td style="width:245px;">Image Analysis Software</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Inverted Modulating Contrast Microscope</td>
			<td style="width:123px;">Leica</td>
			<td style="width:344px;">Leica DM IRB</td>
			<td style="width:245px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Lysosome Enrichment Kit for Tissues and Cultured Cells</td>
			<td style="width:123px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:344px;">89839</td>
			<td style="width:245px;">For Lysosome Isolation</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Microscope Camera</td>
			<td style="width:123px;">Qimaging</td>
			<td style="width:344px;">QICAM fast 1394</td>
			<td style="width:245px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Optima XL-100K Ultracentrifuge</td>
			<td style="width:123px;">Beckman-Coulter</td>
			<td style="width:344px;">XL-100K</td>
			<td style="width:245px;">Ultracentrifuge 
			Rotor: SW41Ti</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Pasteur Pipettes</td>
			<td style="width:123px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:344px;">22-042817</td>
			<td style="width:245px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Petri Dish 5 cm</td>
			<td style="width:123px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:344px;">FB0875713A&#160;</td>
			<td style="width:245px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Pierce BCA Protein Assay Kit</td>
			<td style="width:123px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:344px;">23225</td>
			<td style="width:245px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">PhosSTOP</td>
			<td style="width:123px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:344px;">04 906 845 001</td>
			<td style="width:245px;">Phosphatase Inhibior Tablets</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Sterile Surgical Blade #10</td>
			<td style="width:123px;">Pioneer</td>
			<td style="width:344px;">S2646</td>
			<td style="width:245px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Sucrose</td>
			<td style="width:123px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:344px;">S5-500</td>
			<td style="width:245px;">Crystalline/Certified ACS</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Triglyceride Liquicolor Kit</td>
			<td style="width:123px;">Stanbio&#160;</td>
			<td style="width:344px;">2200-225</td>
			<td style="width:245px;">Colorimetric Triglyceride kit</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Tris Base</td>
			<td style="width:123px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:344px;">BP152-1</td>
			<td style="width:245px;">For TE buffer</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:216px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:123px;">Fisher BioReagents</td>
			<td style="width:344px;">BP151-100</td>
			<td style="width:245px;">5%, Polyethylene glycol p-(1,1,3,3-tetramethylbutyl)-phenyl ether, Protein Lysis Reagent</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">UltraPure EDTA (0.5M, pH 8.0)</td>
			<td style="width:123px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:344px;">15575-038</td>
			<td style="width:245px;">For TE buffer</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rapid lipid droplet isolation protocol using a well-established organelle isolation kit

लिपिड बूंदों (LDs) बायोएक्टिव organelles सबसे यूकैरियोटिक और कुछ प्रोकैरियोटिक कोशिकाओं के cytosol के भीतर पाए जाते हैं । LDs फॉस्फोलिपिड और प्रोटीन के एक monolayer द्वारा encased तटस्थ लिपिड से बना रहे हैं । यकृत LD lipids, जैसे चीनी मिट्टी की चीज़ें, और प्रोटीन कई रोगों है कि यकृत steatosis कारण में फंसाया जाता है । हालांकि पिछले तरीकों LD अलगाव के लिए स्थापित किया गया है, वे एक समय लेने की आवश्यकता होती है अभिकर्मकों की तैयारी और एकाधिक subcellular डिब्बों के अलगाव के लिए तैयार नहीं हैं । हम एक नया प्रोटोकॉल स्थापित करने के लिए एक एकल माउस जिगर से LDs, अंतर्द्रव्यी जालिका (ईआर), और lysosomes के अलगाव को सक्षम करने की मांग की ।
इसके अलावा, यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल में इस्तेमाल सभी अभिकर्मकों व्यावसायिक रूप से उपलब्ध है और LD शुद्धता त्याग के बिना ंयूनतम अभिकर्मक तैयारी की आवश्यकता है । यहां हम एक मानक सुक्रोज ढाल प्रोटोकॉल के लिए इस नए प्रोटोकॉल की तुलना डेटा प्रस्तुत करते हैं, तुलनीय शुद्धता, आकारिकी का प्रदर्शन, और उपज । इसके अतिरिक्त, हम एक ही नमूने का उपयोग कर और lysosomes ईआर को अलग कर सकते हैं, और लिपिड और उनके जुड़े प्रोटीन के गठन और intracellular प्रवाह में विस्तृत जानकारी प्रदान ।

हम लगभग 30 चूहों पर एर किट के साथ LD अलगाव प्रदर्शन किया है और लगभग ४० चूहों पर सुक्रोज अलगाव प्रोटोकॉल का पालन उन लोगों के साथ परिणामों की तुलना में । रिपोर्ट किए गए निष्कर्ष दोनों प्रोटोकॉल क...

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Rapid Lipid Droplet Isolation Protocol Using a Well-established Organelle Isolation Kit

इस प्रोटोकॉल एक अच्छी तरह से स्थापित एंडोप्लाज्मिक जालिका आइसोलेशन किट का उपयोग कर, माउस livers से लिपिड छोटी बूंद अलगाव और शुद्धि की एक नवीन विधि स्थापित करता है ।

एक अच्छी तरह से स्थापित Organelle अलगाव किट का उपयोग रैपिड लिपिड छोटी बूंद आइसोलेशन प्रोटोकॉल

Lipid droplets (LDs) are bioactive organelles found within the cytosol of the most eukaryotic and some prokaryotic cells. LDs are composed of neutral ...

लिपिड बूंद जीव विज्ञान में अनुसंधान शुद्धि की कठिनाई से बाधित किया गया है । इसके अतिरिक्त, सेलुलर लिपिड प्रवाह का अध्ययन करने के लिए कई ऑर्गेनेल्स के एक साथ शुद्धिकरण की आवश्यकता होती है, और वर्तमान में कोई सरल प्रोटोकॉल उपलब्ध नहीं था। इस तकनीक का मुख्य लाभ लिपिड बूंद शुद्धिकरण को अधिक सुलभ बनाना है।हमने एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध किट को एक साथ लिपिड बूंदों, एंडोप्लाज्मिक रेटिकुलम और लाइसोसोम्स को एक ही नमूने से अलग करने के लिए संशोधित किया। जिगर लिपिड बूंद संचय प्रगतिशील जिगर की बीमारी के लिए मोटापे से ग्रस्त और शराबी रोगियों predisposes । इससे निष्क्रिय भंडारण डिब्बों से लिपिड बूंदों के दृश्य को गतिशील जैविक रूप से महत्वपूर्ण ऑर्गेनेल्स में स्थानांतरित कर दिया गया है ।शुरू करने के लिए, पीछे के पूर्वकाल धुरी पर इच्छामृत्यु माउस के पेट की त्वचा और मांसपेशियों की परतों को काटने के लिए बाँझ संदंश और विच्छेदन कैंची का उपयोग करें, जिगर को उजागर करें। लिवर को आंत से जोड़ने वाले लिगामेंट्स को काट लें। संदंश का उपयोग करना, आंत को जिगर से दूर खींचें, पीछे की ओर।लिवर को डायाफ्राम से जोड़ने वाले स्नायु को काट लें। फिर, जिगर और पृष्ठीय रिबकेज के बीच काटें, पूर्वकाल से पीछे की ओर बढ़ते हैं, जब तक कि यकृत मुक्त न हो जाए। जिगर को ठंडे 1x PBS के 10 मिलीलीटर के साथ एक ठंडे पांच सेंटीमीटर पेट्री डिश में स्थानांतरित करें, और चार डिग्री सेल्सियस पर पांच मिनट के लिए ठंड 1x PBS के 10 मिलीलीटर में एक कमाल के मंच पर दो बार जिगर को धोएं ।अंतिम धोने के बाद, 1x PBS बंद डालो, और एक आकार-10 बाँझ शल्य ब्लेड का उपयोग करने के लिए पकवान के भीतर तीन से पांच मिलीमीटर टुकड़े में जिगर पासा । फिर, चार डिग्री सेल्सियस पर पांच मिनट के लिए ठंड 1x PBS के 10 मिलीलीटर के साथ दो बार कटा हुआ जिगर धोएं । 1x PBS decant, और एक ठंडा ४५-मिलीलीटर Dounce समरूपता के लिए diced जिगर के टुकड़े हस्तांतरण, सभी टुकड़ों को सुनिश्चित करने के नीचे हैं ।कोल्ड 1x आईई बफर के सात मिलीलीटर जोड़ें। मूसल को 20 बार ऊपर और नीचे ले जाकर बर्फ पर समरूपता, यह सुनिश्चित करना कि मूसल प्रत्येक स्ट्रोक के दौरान समरूप के नीचे चला जाता है। समरूप को ठंडे 15 मिलीलीटर सेंट्रलाइज ट्यूब में स्थानांतरित करें।कोल्ड 1x आईई बफर के एक मिलीलीटर के साथ समरूप कुल्ला, और यह समरूप के बाकी हिस्सों में जोड़ें । नाभिक को हटाने के लिए, चार डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 1, 000 बार जी पर उच्च क्षमता वाले अपकेंद्रित्र में समरूप को अपकेंद्रित्र करें। सुनिश्चित करें कि 15 मिलीलीटर ट्यूब के शीर्ष पर इकट्ठे हुए किसी भी लिपिड को एलडी नुकसान को रोकने के लिए फिर से निलंबित कर दिया गया है।यह सुनिश्चित करना कि ट्यूब के तल पर परमाणु गोली अव्यवस्थित है, लिपिड युक्त पोस्ट-न्यूक्लियर सुपरनेट को एक ताजा ठंडी 50-मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूब में स्थानांतरित करें। बाद में शुद्धता विश्लेषण के लिए बर्फ पर एक ठंडा १.७-मिलीलीटर माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब के लिए परमाणु सुपरनेट के बाद के एक १००-माइक्रोलीटर aliquot स्थानांतरित करें । माइटोकॉन्ड्रिया को हटाने के लिए, चार डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए 12, 000 बार जी पर एक रेफ्रिजरेटेड हाई-स्पीड सेंट्रलाइज में परमाणु सुपरनेट के बाद के नमूने को अपकेंद्रित्र करें ।सुनिश्चित करें कि ट्यूब के शीर्ष पर इकट्ठे हुए किसी भी लिपिड को एलडी नुकसान को रोकने के लिए फिर से निलंबित कर दिया गया है, और फिर पोस्ट-माइटोकॉन्ड्रियल सुपरनेट को 13-मिलीलीटर अल्ट्रासेंट्रफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें। बाद में शुद्धता विश्लेषण के लिए बर्फ पर एक ठंडी 1.7 मिलीलीटर माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब के बाद माइटोकॉन्ड्रियल सुपरनेट के 100-माइक्रोलीटर एलिकोट को स्थानांतरित करें। अल्ट्रासेंट्रफ्यूज के दौरान गिरने से रोकने के लिए, ठंडे 1x आईई बफर के साथ किनारा करने के लिए पोस्ट-माइटोकॉन्ड्रियल सुपरनेट के साथ अल्ट्रासेंट्रफ्यूज ट्यूब भरें।नमूनों को संतुलित करें, और फिर चार डिग्री सेल्सियस पर ६० मिनट के लिए १००, 000 बार जी पर एक अल्ट्रासेंट्रफ्यूज में अपकेंद्रित्र । एलडी लेयर को हटाने के लिए, ट्यूब को 45 डिग्री कोण पर झुकाएं, और ग्लास पिपेट के साथ एस्पिरेट करें। गोली को ठंडे 1.7-मिलीलीटर माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करने के बाद, शुद्धता विश्लेषण के लिए लिपिड परत के तहत पोस्ट-ईआर सुपरनेट के 100 माइक्रोलीटर एकत्र करें।किसी भी सेल मलबे को गोली मारने के लिए, चार डिग्री सेल्सियस पर पांच मिनट के लिए शीर्ष गति से एक माइक्रोसेंट्रफ्यूज में अपकेंद्रित्र । फिर, एलडी परत को फिर से खर्च करने में मदद करने के लिए हाथों से ट्यूब को धीरे-धीरे गर्म करें, और लिपिड परत सहित सुपरनेट को एक नए 1.7-मिलीलीटर माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें। इन धोने के चरणों को दोहराएं, ट्यूब को दो से तीन बार गर्म करें, जब तक कि गोली दिखाई न दे।फिर, पैलेट-फ्री एलडी सुपरनेट को धोने के लिए, 1x पीबीएस को 1.5 मिलीलीटर की अंतिम मात्रा में जोड़ें, और चार डिग्री सेल्सियस पर पांच मिनट के लिए शीर्ष गति पर एक माइक्रोसेंट्रफ्यूज में सेंट्रलाइज करें। लिपिड परत को परेशान किए बिना, लिपिड परत के नीचे है, जो 1x PBS के एक मिलीलीटर को हटाने के लिए एक ग्लास पिपेट का उपयोग करें। एलडी धोने को चार से पांच बार दोहराएं, जब तक कि 1x पीबीएस नेत्रहीन रूप से पारदर्शी न हो।फिर, लिपिड परत के नीचे सभी 1x पीबीएस को हटाने के लिए एक ग्लास पिपेट का उपयोग करें, और डाउनस्ट्रीम विश्लेषण के लिए परिणामी शुद्ध एलडी अंश का उपयोग करें। जब प्रतिनिधि 20x फ्लोरोसेंट और ब्राइटफील्ड एलडी छवियों दोनों ईआर किट एलडी अलगाव और सुक्रोज एलडी अलगाव तरीकों से लिया गया था, वे कण पदार्थ के समान स्तर से पता चला, दो अलग प्रोटोकॉल का उपयोग कर इसी तरह की शुद्धता का सुझाव । शुद्धिकरण के बाद, एलडी ट्राइग्लिसराइड और प्रोटीन के स्तर को कोलोरिमेट्रिक परख का उपयोग करके मापा गया था, और डेटा को यकृत वजन में सामान्यीकृत किया गया था, यह दिखा रहा है कि जब शुरुआती सामग्री को सामान्यीकृत किया गया था, तो एलडी ट्राइग्लिसराइड और प्रोटीन पैदावार ईआर किट और सुक्रोज विधि का उपयोग करके समान थे।एलडी व्यास छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग करके मात्रा निर्धारित किए गए थे, जिसमें यह दर्शाया गया था कि ईआर किट एलडी अलगाव और सुक्रोज एलडी अलगाव ने समान आकारों की एलडी प्राप्त की है। एलडी शुद्धता का आकलन करने के लिए, नमूनों को इम्यूनोब्लोटिंग द्वारा आसक्त किया गया था, जिसमें यह दर्शाया गया था कि ईआर किट एलडी अलगाव और सुक्रोज रेडिएंट प्रोटोकॉल दोनों से प्राप्त एलडी में समान शुद्धता थी। PLIN2, एक एलडी मार्कर, ईआर किट एलडी अलगाव प्रति और सुक्रोज के पीएनएस को छोड़कर सभी नमूनों में पाया गया था ।इम्यूनोब्लॉट का उपयोग करके एक ईआर अंश की शुद्धता विश्लेषण से पता चलता है कि वे एलडी मार्कर PLIN2 से मुक्त थे, लेकिन ईआर SEC61A प्रोटीन का महत्वपूर्ण स्तर था। लाइसोसोम एनरिचमेंट किट का उपयोग करके लाइसोसोम्स की आगे शुद्धि के बाद एक लाइसोसोमल अंश की शुद्धता का भी आकलन किया गया। डिस्कवरी वर्तमान में हमारे प्रोटोकॉल का सबसे उपयोगी आवेदन है।हम शुद्ध ऑर्गेनेल्स में लिपिडोमिक्स करते हैं, और दिखाया गया कि लिपिोटॉक्सिन विशेष रूप से मादक जिगर की बीमारी में लिपिड बूंदों में बढ़ जाते हैं।

Research

JoVE Journal

Biology

Rapid Genotyping of Mouse Tissue Using Sigma's Extract-N-Amp Tissue PCR Kit

माउस ऊतक के रैपिड जीनोटाइपिंग सिग्मा निकालें - एन Amp ऊतक पीसीआर किट का उपयोग

Genomic detection of DNA via PCR amplification and detection on an electrophoretic gel is a standard way that the genotype of a tissue sample is ...

Neutrophil Isolation Protocol

न्युट्रोफिल अलगाव प्रोटोकॉल

Neutrophil polymorphonuclear granulocytes (PMN) are the most abundant leukocytes in humans and among the first cells to arrive on the site of inflammatory ...

Rapid Isolation And Purification Of Mitochondria For Transplantation By Tissue Dissociation And Differential Filtration

ऊतक हदबंदी और अंतर निस्पंदन द्वारा प्रत्यारोपण के लिए mitochondria की रैपिड अलगाव और शुद्धि

Previously described mitochondrial isolation methods using differential centrifugation and/or Ficoll gradient centrifugation require 60 to 100 min to ...

RNA Isolation from Cell Specific Subpopulations Using Laser-capture Microdissection Combined with Rapid Immunolabeling

सेल विशिष्ट उप-जनसंख्या से शाही सेना अलगाव रैपिड immunolabeling के साथ संयुक्त लेजर कब्जा Microdissection का प्रयोग

Laser capture microdissection (LCM) allows the isolation of specific cells from thin tissue sections with high spatial resolution. Effective LCM requires ...

Isolation and Compositional Analysis of Plant Cuticle Lipid Polyester Monomers

संयंत्र छल्ली लिपिड पॉलिएस्टर monomers के अलगाव और compositional विश्लेषण

Terrestrial plants produce extracellular aliphatic biopolyesters that modify cell walls of specific tissues. Epidermal cells synthesize cutin, a polyester ...

Filtration Isolation of Nucleic Acids:  A Simple and Rapid DNA Extraction Method

न्यूक्लिक एसिड की छानने का अलगाव: एक सरल और तेजी डीएनए निष्कर्षण विधि

FINA, filtration isolation of nucleic acids, is a novel extraction method which utilizes vertical filtration via a separation membrane and absorbent pad ...

A Simple High Efficiency Protocol for Pancreatic Islet Isolation from Mice

चूहे से अग्नाशयी आइलेट अलगाव के लिए एक सरल उच्च दक्षता प्रोटोकॉल

Pancreatic islets, also called the Islets of Langerhans, are a cluster of endocrine cells which produces hormones for glucose regulation and other ...

Dissection and Lipid Droplet Staining of Oenocytes in Drosophila Larvae

Dissection and Lipid Droplet Staining of Oenocytes in Drosophila Larvae

ड्रोसोफिला लार्वा में ओएनोसाइट्स का विच्छेदन और लिपिड ड्रॉपलेट धुंधला

Lipids are essential for animal development and physiological homeostasis. Dysregulation of lipid metabolism results in various developmental defects and ...

Rapid In Vivo Fixation and Isolation of Translational Complexes from Eukaryotic Cells

Rapid In Vivo Fixation and Isolation of Translational Complexes from Eukaryotic Cells

यूकेरियोटिक कोशिकाओं से ट्रांसलेशनल कॉम्प्लेक्स के वीवो फिक्सेशन और अलगाव में तेजी

Rapid responses involving fast redistribution of messenger(m)RNA and alterations of mRNA translation are pertinent to ongoing homeostatic adjustments of ...