Name: rapid lipid droplet isolation protocol using a well-established organelle isolation kit
Uploaded: 2019-04-19T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Rapid Lipid Droplet Isolation Protocol Using a Well-established Organelle Isolation Kit at JoVE.com

Мы благодарим Абрамсон семьи рака научно-исследовательский институт. Эта работа поддерживается следующие гранты: NIH/NIAAA R01 AA026302-01, NIH/NIAAA K08-AA021424, Роберта Вуда Джонсона Фонда, Гарольд Амос медицинский факультет премии в области развития, 7158, IDOM ДРК пилот премии Р30 DK019525 (R.M.C.); NIH/NIAAA F32-AA024347 (J.C.). Эта работа была поддержана в части NIH P30-DK050306 и его основной зал (молекулярной патологии и изображений ядра, молекулярной биологии/ген выражение ядра и ядро культуры клеток) и его пилот грантовой программы. Содержание является исключительно ответственности авторов и не обязательно отражают официальную точку зрения национальных институтов здоровья.

Все эксперименты проводились на лабораторном столе с личного защитного оборудования для биобезопасности уровня 1, включая лаборатории пальто, перчатки и защитные очки. Эксперименты были проведены согласно протоколов, одобренных институциональный уход животных и использование Комит?...

<ol>
	<li>Brasaemle, D. L., Wolins, N. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+Lipid+Droplets+from+Cells+by+Density+Gradient+Centrifugation.">Isolation of Lipid Droplets from Cells by Density Gradient Centrifugation.</a> Current Protocols in Cell Biology. 72, (2016).</li><li>Ding, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolating+lipid+droplets+from+multiple+species.">Isolating lipid droplets from multiple species.</a> Nature Protocols. 8 (1), 43-51 (2013).</li><li>Gao, Q., Goodman, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+lipid+droplet-a+well-connected+organelle.">The lipid droplet-a well-connected organelle.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 3, 49 (2015).</li><li>Correnti, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ethanol+and+C2+ceramide+activate+fatty+acid+oxidation+in+human+hepatoma+cells.">Ethanol and C2 ceramide activate fatty acid oxidation in human hepatoma cells.</a> Scientific Reports. 8 (1), 12923 (2018).</li><li>Williams, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+role+for+ceramide+synthase+6+in+mouse+and+human+alcoholic+steatosis.">A novel role for ceramide synthase 6 in mouse and human alcoholic steatosis.</a> FASEB Journal. 32 (1), 130-142 (2018).</li><li>Carr, R. M., Ahima, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathophysiology+of+lipid+droplet+proteins+in+liver+diseases.">Pathophysiology of lipid droplet proteins in liver diseases.</a> Experimental Cell Research. 340 (2), 187-192 (2016).</li><li>Carr, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perilipin+Staining+Distinguishes+Between+Steatosis+and+Nonalcoholic.">Perilipin Staining Distinguishes Between Steatosis and Nonalcoholic.</a> Steatohepatitis in Adults and Children. Clinical Gastroenterology and Hepatology. 15 (1), 145-147 (2017).</li><li>Carr, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduction+of+TIP47+improves+hepatic+steatosis+and+glucose+homeostasis+in+mice.">Reduction of TIP47 improves hepatic steatosis and glucose homeostasis in mice.</a> American Journal of Physiology: Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 302 (8), R996-R1003 (2012).</li><li>Carr, R. M., Peralta, G., Yin, X., Ahima, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Absence+of+perilipin+2+prevents+hepatic+steatosis,+glucose+intolerance+and+ceramide+accumulation+in+alcohol-fed+mice.">Absence of perilipin 2 prevents hepatic steatosis, glucose intolerance and ceramide accumulation in alcohol-fed mice.</a> PLoS One. 9 (5), e97118 (2014).</li><li>Tsai, T. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+constitutive+lipid+droplet+protein+PLIN2+regulates+autophagy+in+liver.">The constitutive lipid droplet protein PLIN2 regulates autophagy in liver.</a> Autophagy. 13 (7), 1130-1144 (2017).</li><li>Guo, Y., Cordes, K. R., Farese, R. V., Walther, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+droplets+at+a+glance.">Lipid droplets at a glance.</a> Journal of Cell Science. 122 (Pt 6), 749-752 (2009).</li><li>Liu, K., Czaja, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+lipid+stores+and+metabolism+by+lipophagy.">Regulation of lipid stores and metabolism by lipophagy.</a> Cell Death and Differentiation. 20 (1), 3-11 (2013).</li><li>Mannik, J., Meyers, A., Dalhaimer, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+cellular+lipid+droplets:+two+purification+techniques+starting+from+yeast+cells+and+human+placentas.">Isolation of cellular lipid droplets: two purification techniques starting from yeast cells and human placentas.</a> Journal of Visualized Experiments. (86), e509814 (2014).</li><li>Sato, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+profiling+of+lipid+droplet+proteins+in+hepatoma+cell+lines+expressing+hepatitis+C+virus+core+protein.">Proteomic profiling of lipid droplet proteins in hepatoma cell lines expressing hepatitis C virus core protein.</a> Journal of Biochemistry. 139 (5), 921-930 (2006).</li><li>Wu, C. C., Howell, K. E., Neville, M. C., Yates, J. R., McManaman, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomics+reveal+a+link+between+the+endoplasmic+reticulum+and+lipid+secretory+mechanisms+in+mammary+epithelial+cells.">Proteomics reveal a link between the endoplasmic reticulum and lipid secretory mechanisms in mammary epithelial cells.</a> Electrophoresis. 21 (16), 3470-3482 (2000).</li><li>Zhang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphologically+and+Functionally+Distinct+Lipid+Droplet+Subpopulations.">Morphologically and Functionally Distinct Lipid Droplet Subpopulations.</a> Scientific Reports. 6, 29539 (2016).</li></ol>

Печеночная LD биологии все чаще признается как критический регулятор гепатоцеллюлярной физиологии в здоровье и болезни. Как bona fide органеллы LDs являются динамическими, взаимодействуют с другими клеточных структур и содержат в них биологически активных компонентов, вовлеченных в гомеос...

LDs являются биологически органеллы в цитозоле наиболее эукариотических клеток и2,некоторые прокариотических клеток в1,3. LD ядро состоит из нейтральные липиды как эфиры холестерина и триглицеридов (ТГ). Они также содержат Церамиды, биоактивных липиды, участвующих в клеточном сигнальных путей4,5. LDs окружены фосфолипидного монослоя и покрытием с белками, включая perilipin белки perilipin 2 (PLIN2) и 3 (PLIN3)1,5,6. Также присутствуют lipogenic ферменты, липазы и мембранных белков людьми, которые были связаны с несколькими steatotic заболеваниях печени, включая безалкогольного наварного заболевания печени, алкогольная болезнь печени и гепатит C3,5 ,6,,78,9,10.
Подуманы, что LDs от внешней мембраны ER и содержат заново синтезированные TG, получены из11ER-производные свободных жирных кислот. Однако, остается неизвестным, ли Объединенные липиды бутон, остаются подключенными, или вырезана из ER6,11, делает изоляцию LDs от технически сложных ER. Свободные жирные кислоты могут быть освобождены от LDs действием поверхности липазы для производства энергии или синтеза мембранных. Кроме того может снизиться LDs через lipophagy механизм регулирования, а также производить свободные жирные кислоты12.
Помимо ER и лизосомы, есть другие органеллы — например, митохондрии, endosomes, пероксисомы и плазматической мембраны — которые находятся в тесной взаимосвязи LDs11. Этот плотный полигамии делает его трудным для выполнения чисто LD добычи. Тем не менее нейтральные липиды врожденной низкой плотности могут быть приняты преимущество через центрифугирования5.
Традиционно LDs были изолированы с помощью сахарозы плотность градиента1,5,13. Однако эти методы не предназначены для изоляции другие органеллы. Кроме того они требуют длительной подготовки реагентов. Этот протокол адаптируется коммерчески доступных ER изоляции комплект (см. Таблицу материалов) для изоляции LD. Мы используем извлечения буфер, предоставленный набор, добавив LD изоляции шаг. Кроме того протокол может также использоваться для ER и лизосомальных изоляции с помощью же образцы, позволяющие более подробное изображение жизненного цикла LDs. Чтобы проверить этот новый метод, мы пробирного выход LD, морфология, размер и чистоты. Мы сравниваем результаты, представленные здесь для тех, кто получил с широко используемый протокол, используя градиент сахарозы для изоляции LD.
Мы использовали 10 к 12-week-old, 20 g, женский C57BL/6 мышь постился 16 h (удаление продовольствия в 5:00 вечера время изоляции LD 9.00) с свободный доступ к воде. Типичный выход для TG 0.6 мг/г печени, и LD белка, это 0,25 мг/г печени. Это обеспечивает достаточно материала для ~ 10 иммуноблотов, SDS-страницы. Протокол ниже подробности реагентов, используемых и протокол для одного 1 g печени. Протокол градиента изоляции сахарозы заимствован из Сато14 и15Ву.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:928px;" width="927">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">BioExpress Vortex Mixer</td>
			<td style="width:123px;">GeneMate</td>
			<td style="width:344px;">S-3200-1</td>
			<td style="width:245px;">Vortex Mixer</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Centrifuge 54242 R</td>
			<td style="width:123px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:344px;">54242 R</td>
			<td style="width:245px;">Refrigerated Counter Microcentrifuge 
			Rotor: FA-45-24-11</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Centrifuge Sorvall RC6 +</td>
			<td style="width:123px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:344px;">RC6+</td>
			<td style="width:245px;">Refrigerated High Speed Centrifuge 
			Rotor: F21S-8x50y</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Centrifuge Sorvall Legend RT+</td>
			<td style="width:123px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:344px;">Legend RT+</td>
			<td style="width:245px;">Refrigerated High Capacity Centrifuge 
			Rotor: 75006445 Bucket: 75006441</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">cOmplete Protease Inhibitor Cocktail</td>
			<td style="width:123px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:344px;">04 693 116 001</td>
			<td style="width:245px;">Protease Inhibitor Tablets</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Diagenode Bioruptur UCD-200</td>
			<td style="width:123px;">Diagenode</td>
			<td style="width:344px;">UCD-200</td>
			<td style="width:245px;">Sonication System</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Dounce Tissue Grinder (45 mL)</td>
			<td style="width:123px;">Wheaton</td>
			<td style="width:344px;">357546</td>
			<td style="width:245px;">Use Loose pestle</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Dulbecco&#39;s Phosphate-Buffered Saline (1x)</td>
			<td style="width:123px;">Corning</td>
			<td style="width:344px;">21-031-CM</td>
			<td style="width:245px;"></td>
		</tr>
		<tr height="160">
			<td height="160" style="height:160px;width:216px;">Endoplasmic Reticulum Isolation Kit</td>
			<td style="width:123px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:344px;">ER0100</td>
			<td style="width:245px;">For ER kit Extraction: 
			Contains: 
			Isotonic Extraction Buffer 5X 100 mL 
			Hypotonic Extraction Buffer 10 mL 
			Calcium chloride, 2.5 M solution 5 mL 
			OptiPrep Density Gradient Medium 100 mL 
			Blunt Nosed Needle 1 ea.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">External light source for flourescent excitation</td>
			<td style="width:123px;">Leica</td>
			<td style="width:344px;">Leica EL6000</td>
			<td style="width:245px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Hydrochloric acid</td>
			<td style="width:123px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:344px;">H1758</td>
			<td style="width:245px;">Hydrochloric Acid</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">ImageJ</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td style="width:245px;">Image Analysis Software</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Inverted Modulating Contrast Microscope</td>
			<td style="width:123px;">Leica</td>
			<td style="width:344px;">Leica DM IRB</td>
			<td style="width:245px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Lysosome Enrichment Kit for Tissues and Cultured Cells</td>
			<td style="width:123px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:344px;">89839</td>
			<td style="width:245px;">For Lysosome Isolation</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Microscope Camera</td>
			<td style="width:123px;">Qimaging</td>
			<td style="width:344px;">QICAM fast 1394</td>
			<td style="width:245px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Optima XL-100K Ultracentrifuge</td>
			<td style="width:123px;">Beckman-Coulter</td>
			<td style="width:344px;">XL-100K</td>
			<td style="width:245px;">Ultracentrifuge 
			Rotor: SW41Ti</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Pasteur Pipettes</td>
			<td style="width:123px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:344px;">22-042817</td>
			<td style="width:245px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Petri Dish 5 cm</td>
			<td style="width:123px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:344px;">FB0875713A&#160;</td>
			<td style="width:245px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Pierce BCA Protein Assay Kit</td>
			<td style="width:123px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:344px;">23225</td>
			<td style="width:245px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">PhosSTOP</td>
			<td style="width:123px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:344px;">04 906 845 001</td>
			<td style="width:245px;">Phosphatase Inhibior Tablets</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Sterile Surgical Blade #10</td>
			<td style="width:123px;">Pioneer</td>
			<td style="width:344px;">S2646</td>
			<td style="width:245px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Sucrose</td>
			<td style="width:123px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:344px;">S5-500</td>
			<td style="width:245px;">Crystalline/Certified ACS</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Triglyceride Liquicolor Kit</td>
			<td style="width:123px;">Stanbio&#160;</td>
			<td style="width:344px;">2200-225</td>
			<td style="width:245px;">Colorimetric Triglyceride kit</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Tris Base</td>
			<td style="width:123px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:344px;">BP152-1</td>
			<td style="width:245px;">For TE buffer</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:216px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:123px;">Fisher BioReagents</td>
			<td style="width:344px;">BP151-100</td>
			<td style="width:245px;">5%, Polyethylene glycol p-(1,1,3,3-tetramethylbutyl)-phenyl ether, Protein Lysis Reagent</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">UltraPure EDTA (0.5M, pH 8.0)</td>
			<td style="width:123px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:344px;">15575-038</td>
			<td style="width:245px;">For TE buffer</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rapid lipid droplet isolation protocol using a well-established organelle isolation kit

Липидного капель (LDs) являются биологически органеллы в цитозоле наиболее эукариот и некоторые прокариотических клеток. LDs состоят из нейтральных липиды, заключенная в монослое белков и фосфолипидов. Печеночная LD липиды, церамиды, и белки причастны несколько заболеваний, которые вызывают печеночная стеатоз. Хотя предыдущие методы были созданы для изоляции LD, они требуют длительной подготовки реагентов и не предназначены для изоляции несколько субцеллюлярные отсеков. Мы стремились создать новый протокол для включения изоляции LDs, эндоплазматический ретикулум (ER) и лизосом из одной мыши печени.
Кроме того, все реактивы, используемые в протоколе, представленные здесь являются коммерчески доступными и требуют минимальной реагент подготовки без ущерба для LD чистоты. Здесь мы представляем данные сравнения этот новый протокол к стандартным сахарозы градиента протокол, демонстрируя сопоставимых чистоты, морфология и урожайность. Кроме того мы может изолировать ER и лизосомы, с использованием того же образца, обеспечивая подробное понимание формирования и внутриклеточных потока липидов и их связанные белков.

Мы выступали LD изоляции с ER комплект на приблизительно 30 мышей и сравнили результаты с теми, кто после Протокол изоляции сахарозы на приблизительно 40 мышей. Сообщил результаты типичны для обоих протоколов. Мышей были постились ночь со свободным доступом к воде, чтобы у...

Watch this Scientific Journal Video about Rapid Lipid Droplet Isolation Protocol Using a Well-established Organelle Isolation Kit at JoVE.com

Rapid Lipid Droplet Isolation Protocol Using a Well-established Organelle Isolation Kit

Этот Протокол устанавливает новый метод изоляции капелька липидов и очистки от мыши печень, используя набор для изоляции устоявшихся эндоплазматического ретикулума.

Протокол изоляции капелька быстрого липидов используя налаженные органеллы изоляции комплект

Lipid droplets (LDs) are bioactive organelles found within the cytosol of the most eukaryotic and some prokaryotic cells. LDs are composed of neutral ...

Исследования в биологии липидных капель затрудняется сложностью очистки. Кроме того, изучение клеточного липидного потока требует одновременной очистки нескольких органелл, и в настоящее время не существует простых протоколов. Основным преимуществом этой техники является сделать очистку липидных капель более доступной.Мы модифицировали коммерчески доступный комплект для одновременной изоляции липидных капель, эндоплазмического цитокулума и лизосом из одного образца. Накопление липидных капель печени предрасполагает пациентов с ожирением и алкоголизмом к прогрессирующим заболеваниям печени. Это сместило представление о липидных каплях из инертных отсеков для хранения в динамические биологически важные органеллы.Для начала используйте стерильные миппы и ножницы для вскрытия, чтобы сократить кожу и мышечные слои живота усыпленной мыши на задней передней оси, обнажая печень. Разрежьте связки, соединяющие печень с кишечником. Используя миппы, вытяните кишечник от печени, к задней.Отрежьте связку соединяя печеночную к диафрагме. Затем разрезают между печенью и спинной грудной клеткой, переходя от передней к задней, пока печень не будет освобождена. Перенесите печень в холодную пятисемейметровую чашку Петри с 10 миллилитров холодного 1x PBS, и мыть печень дважды на качалке платформы в 10 миллилитров холодного 1x PBS в течение пяти минут при четырех градусах Цельсия.После окончательного мытья, слить 1x PBS, и использовать размер-10 стерильных хирургических лезвие кости печени на три-пять миллиметров штук в блюдо. Затем, мыть кубиками печени два раза с 10 миллилитров холодного 1x PBS в течение пяти минут при четырех градусах по Цельсию. Декант 1x PBS, и передать нарезанные кубиками кусочки печени в холодный 45-миллилитровый гомогенизатор Dounce, гарантируя, что все части находятся на дне.Добавьте семь миллилитров холодного буфера 1x IE. Гомогенизировать на льду, перемещая пестик вверх и вниз 20 раз, убедившись, что пестик идет на дно гомогенизатора во время каждого инсульта. Перенесите гомогенат в холодную 15-миллилитровую центрифугу.Промыть гомогенизатор с одним миллилитр холодного буфера 1x IE, и добавить его к остальной части гомогената. Чтобы удалить ядра, центрифуга гомогената в центрифуге высокой емкости при 1000 раз г в течение 10 минут при четырех градусах Цельсия. Убедитесь, что любой липид, собранный в верхней части 15-миллилитровой трубки повторно, чтобы предотвратить потерю LD.Убедившись, что ядерные гранулы на дне трубки нетронуты, перенесите липидосодержащую постядерную супернатантную трубку в свежую холодную 50-миллилитровую центрифугу. Перенесите 100-микролитровую алицитат постядерного супернатанта в холодную 1,7-миллилитровую микроцентрифугную трубку на льду для более длительного анализа чистоты. Чтобы удалить митохондрии, центрифуза постядерного супернатанта образца в охлажденной высокоскоростной центрифуге при 12000 раз г в течение 15 минут при четырех градусах Цельсия.Убедитесь, что любой липид, собранный в верхней части трубки повторно, чтобы предотвратить потерю LD, а затем передать пост-митохондриальный супернатант в 13-миллилитровый ультрацентрифуг трубки. Перенесите 100-микролитр-алицит после митохондриального супернатанта в холодную 1,7-миллилитровую микроцентрифугную трубку на льду для более длительного анализа чистоты. Заполните ультрацентрифугную трубку пост-митохондриальным супернатантом до краев с помощью холодного буфера 1x IE, чтобы предотвратить его коллапс во время ультрацентрифугации.Сбалансировать образцы, а затем центрифугу в ультрацентрифуге при 100 000 раз г в течение 60 минут при четырех градусах Цельсия. Чтобы удалить слой LD, наклоните трубку под углом 45 градусов и аспират со стеклянной пипеткой. После переноса гранулы в холодную 1,7-миллилитровую микроцентрифуговую трубку, соберите 100 микролитров супернатанта после ЭР под липидным слоем для анализа чистоты.Чтобы гранулировать любой клеточный мусор, центрифуга в микроцентрифуге на высокой скорости в течение пяти минут при четырех градусах Цельсия. Затем аккуратно разогрейте трубку руками, чтобы помочь повторно использовать слой LD, и перенесите супернатант, включая липидный слой, в новую 1,7-миллилитровую микроцентрифугную трубку. Повторите эти шаги мытья, нагревая трубку два-три раза, пока гранулы больше не видны.Затем, чтобы вымыть гранулы без LD supernatant, добавить 1x PBS к окончательному объему 1,5 миллилитров, и центрифуга в микроцентрифуге на высокой скорости в течение пяти минут при четырех градусах Цельсия. Используйте стеклянную пипету, чтобы удалить один миллилитр 1x PBS, который находится под липидным слоем, не нарушая липидный слой. Повторите LD стирки четыре-пять раз, пока 1x PBS визуально прозрачным без мутности.Затем используйте стеклянную пипету, чтобы удалить все 1x PBS ниже липидного слоя, и использовать полученную чистую фракцию LD для анализа вниз по течению. Когда репрезентативные 20x флуоресцентные и яркие изображения LD были взяты из изоляции ER комплект LD и методы изоляции сахарозы LD, они показали аналогичные уровни твердых частиц, предлагая аналогичные чистоты с использованием двух различных протоколов. После очистки, LD триглицеридов и белковых уровней были измерены с помощью колориметрических анализов, и данные были нормализовываться до веса печени, показывая, что, когда стартовый материал был нормализован, LD триглицеридов и белковых урожаев были похожи с помощью набора ER и метод сахарозы.Диаметры LD были количественно определены с помощью программного обеспечения анализа изображений, показывая, что изоляция комплекта LD ER и изоляция сахарозы LD дали LDs аналогичных размеров. Для оценки чистоты LD, образцы были анализированы иммуноблоттинга, показывая, что ЛСД, полученные из изоляции комплекта ER LD и протокола градиента сахарозы оба имели равную чистоту. PLIN2, маркер LD, был обнаружен во всех образцах, за исключением изоляции ER комплекта LD PER и PNS сахарозы.Анализ чистоты фракции ER с использованием иммуноблотов показывает, что они были свободны от маркера LD PLIN2, но имели значительные уровни белка ER SEC61A. Была также оценена чистота лизосомальной фракции после дальнейшей очистки лизосом, использующих набор для обогащения лизосом. Discovery в настоящее время является наиболее полезным применением нашего протокола.Мы выполняем липидомику в очищенных органеллах, и показали, липотоксины увеличились специально в липидных капель при алкогольных заболеваниях печени.

Research

JoVE Journal

Biology

Rapid Genotyping of Mouse Tissue Using Sigma's Extract-N-Amp Tissue PCR Kit

Быстрое Генотипирование Мышь ткани с помощью Сигмы Извлечение-N-Amp тканей PCR Kit

Genomic detection of DNA via PCR amplification and detection on an electrophoretic gel is a standard way that the genotype of a tissue sample is ...

Neutrophil Isolation Protocol

Нейтрофилов Изоляция протокола

Neutrophil polymorphonuclear granulocytes (PMN) are the most abundant leukocytes in humans and among the first cells to arrive on the site of inflammatory ...

Rapid Isolation And Purification Of Mitochondria For Transplantation By Tissue Dissociation And Differential Filtration

Быстрое Выделение и очистка митохондрий Для трансплантации тканью диссоциации и дифференциальной фильтрации

Previously described mitochondrial isolation methods using differential centrifugation and/or Ficoll gradient centrifugation require 60 to 100 min to ...

RNA Isolation from Cell Specific Subpopulations Using Laser-capture Microdissection Combined with Rapid Immunolabeling

Выделение РНК из клеточных конкретные подгруппы с помощью лазера захвата микродиссекции в сочетании с быстрым иммунноокрашивания

Laser capture microdissection (LCM) allows the isolation of specific cells from thin tissue sections with high spatial resolution. Effective LCM requires ...

Isolation and Compositional Analysis of Plant Cuticle Lipid Polyester Monomers

Выделение и анализ состава растительных липидов кутикулы полиэфирные мономеры

Terrestrial plants produce extracellular aliphatic biopolyesters that modify cell walls of specific tissues. Epidermal cells synthesize cutin, a polyester ...

Filtration Isolation of Nucleic Acids:  A Simple and Rapid DNA Extraction Method

Фильтрация Выделение нуклеиновых кислот: Простой и быстрый ДНК Метод экстракции

FINA, filtration isolation of nucleic acids, is a novel extraction method which utilizes vertical filtration via a separation membrane and absorbent pad ...

A Simple High Efficiency Protocol for Pancreatic Islet Isolation from Mice

Простой протокол высокой эффективности для изоляции поджелудочной железы от мышей

Pancreatic islets, also called the Islets of Langerhans, are a cluster of endocrine cells which produces hormones for glucose regulation and other ...

Dissection and Lipid Droplet Staining of Oenocytes in Drosophila Larvae

Dissection and Lipid Droplet Staining of Oenocytes in Drosophila Larvae

Рассечение и Липид капли пятно Эноцитов в Drosophila Larvae

Lipids are essential for animal development and physiological homeostasis. Dysregulation of lipid metabolism results in various developmental defects and ...

Rapid In Vivo Fixation and Isolation of Translational Complexes from Eukaryotic Cells

Rapid In Vivo Fixation and Isolation of Translational Complexes from Eukaryotic Cells

Быстрая фиксация in vivo и выделение трансляционных комплексов из эукариотических клеток

Rapid responses involving fast redistribution of messenger(m)RNA and alterations of mRNA translation are pertinent to ongoing homeostatic adjustments of ...

Sample Preparation for Rapid Lipid Analysis in Drosophila Brain Using Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Mass Spectrometry Imaging

Sample Preparation for Rapid Lipid Analysis in Drosophila Brain Using Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Mass Spectrometry Imaging

Подготовка образцов для быстрого анализа липидов в мозге дрозофилы с использованием матричной лазерной десорбции / ионизационной масс-спектрометрии