Name: growth and characterization of irradiated organoids from mammary glands
Uploaded: 2019-05-03T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Growth and Characterization of Irradiated Organoids from Mammary Glands at JoVE.com

نشكر الدكتورة لورا ل. Bronsart لتوفير GFP و dTomato-المسمي RAW 264.7 الضامة. تم دعم هذا البحث ماليا من قبل منحه المعاهد القومية للصحة #R00CA201304.

وأجريت الدراسات الحيوانية وفقا للمبادئ التوجيهية والبروتوكولات المؤسسية التي وافقت عليها لجنه الرعاية والاستخدام المؤسسي للحيوانات في جامعه فانديربيلت.
1-اعداد الفئران وحيازة الخلايا (المقتبسة من نغوين-نغوك وآخرون11)
<ol><li>التضحية الفئران Nu/Nu (8-10 أسابيع من ال?...

<ol>
	<li>Lautner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disparities+in+the+Use+of+Breast-Conserving+Therapy+Among+Patients+With+Early-Stage+Breast+Cancer.">Disparities in the Use of Breast-Conserving Therapy Among Patients With Early-Stage Breast Cancer.</a> Journal of the American Medical Association Surgery. 150 (8), 778-786 (2015).</li><li>Lowery, A., Kell, M., Glynn, R., Kerin, M., Sweeney, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Locoregional+recurrence+after+breast+cancer+surgery+a+systematic+review+by+receptor+phenotype.">Locoregional recurrence after breast cancer surgery a systematic review by receptor phenotype.</a> Breast Cancer Research and Treatment. 133, 831-841 (2012).</li><li>Kim, M. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+Self-Seeding+by+Circulating+Cancer+Cells.">Tumor Self-Seeding by Circulating Cancer Cells.</a> Cell. 139 (7), 1315-1326 (2009).</li><li>Vilalta, M., Rafat, M., Giaccia, A. J., Graves, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recruitment+of+Circulating+Breast+Cancer+Cells+Is+Stimulated+by+Radiotherapy.">Recruitment of Circulating Breast Cancer Cells Is Stimulated by Radiotherapy.</a> Cell Reports. 8 (2), 402-409 (2014).</li><li>Rafat, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophages+Promote+Circulating+Tumor+Cell-Mediated+Local+Recurrence+following+Radiotherapy+in+Immunosuppressed+Patients.">Macrophages Promote Circulating Tumor Cell-Mediated Local Recurrence following Radiotherapy in Immunosuppressed Patients.</a> Cancer Research. 78 (15), 4241-4252 (2018).</li><li>Shamir, E. R., Ewald, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+organotypic+culture:+Experimental+models+of+mammalian+biology+and+disease.">Three-dimensional organotypic culture: Experimental models of mammalian biology and disease.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (10), 647-664 (2014).</li><li>Simian, M., Hirai, Y., Navre, M., Werb, Z., Lochter, A., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+interplay+of+matrix+metalloproteinases,+morphogens+and+growth+factors+is+necessary+for+branching+of+mammary+epithelial+cells.">The interplay of matrix metalloproteinases, morphogens and growth factors is necessary for branching of mammary epithelial cells.</a> Development. 128, 3117-3131 (2001).</li><li>Shamir, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Twist1-induced+dissemination+preserves+epithelial+identity+and+requires+E-cadherin.">Twist1-induced dissemination preserves epithelial identity and requires E-cadherin.</a> Journal of Cell Biology. 204 (5), 839-856 (2014).</li><li>Ewald, A. J., Brenot, A., Duong, M., Chan, B. S., Werb, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collective+Epithelial+Migration+and+Cell+Rearrangements+Drive+Mammary+Branching+Morphogenesis.">Collective Epithelial Migration and Cell Rearrangements Drive Mammary Branching Morphogenesis.</a> Developmental Cell. 14, 570-581 (2008).</li><li>Nguyen-Ngoc, K. -. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ECM+microenvironment+regulates+collective+migration+and+local+dissemination+in+normal+and+malignant+mammary+epithelium.">ECM microenvironment regulates collective migration and local dissemination in normal and malignant mammary epithelium.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 89 (19), E2595-E2604 (2012).</li><li>Nguyen-Ngoc, K. -. V., Shamir, E. R., Huebner, R. J., Beck, J. N., Cheung, K. J., Ewald, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+Culture+Assays+of+Murine+Mammary+Branching+Morphogenesis+and+Epithelial+Invasion.">3D Culture Assays of Murine Mammary Branching Morphogenesis and Epithelial Invasion.</a> Tissue Morphogenesis: Methods and Protocols. 1189, 135-162 (2015).</li><li>Ewald, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+mouse+mammary+organoids+for+long-term+time-lapse+imaging.">Isolation of mouse mammary organoids for long-term time-lapse imaging.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 8 (2), 130-133 (2013).</li><li>Drost, J., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoids+in+cancer+research.">Organoids in cancer research.</a> Nature Reviews. , (2018).</li><li>DeNardo, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD4+T+Cells+Regulate+Pulmonary+Metastasis+of+Mammary+Carcinomas+by+Enhancing+Protumor+Properties+of+Macrophages.">CD4+T Cells Regulate Pulmonary Metastasis of Mammary Carcinomas by Enhancing Protumor Properties of Macrophages.</a> Cancer Cell. 16 (2), 91-102 (2009).</li><li>Plaks, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adaptive+Immune+Regulation+of+Mammary+Postnatal+Organogenesis.">Adaptive Immune Regulation of Mammary Postnatal Organogenesis.</a> Developmental Cell. 34 (5), 493-504 (2015).</li><li>Mandl, I., McLennan, J. D., Howes, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+Characterization+of+Proteinase+and+Collagenase+Fromcl.+Histolyticum.">Isolation and Characterization of Proteinase and Collagenase Fromcl. Histolyticum.</a> The Journal of Clinical Investigation. 32, 1323-1329 (1953).</li><li>Mandl, I., Zaffuto, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serological+Evidence+for+a+Specific+Clostridium+histolyticum+Geltinase.">Serological Evidence for a Specific Clostridium histolyticum Geltinase.</a> The Journal of General Microbiology. 18, 13-15 (1958).</li><li>Bond, M. D., Van Wart, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+Individual+Collagenases+from+Clostridium+histolyticum.">Characterization of the Individual Collagenases from Clostridium histolyticum.</a> Biochemistry. 23 (13), 3085-3091 (1984).</li><li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishing+estrogen-responsive+mouse+mammary+organoids+from+single+Lgr5+cells.">Establishing estrogen-responsive mouse mammary organoids from single Lgr5+cells.</a> Cellular Signalling. 29, 41-51 (2016).</li><li>Sokol, E. S., Miller, D. H., Breggia, A., Spencer, K. C., Arendt, L. M., Gupta, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+of+human+breast+tissues+from+patient+cells+in+3D+hydrogel+scaffolds.">Growth of human breast tissues from patient cells in 3D hydrogel scaffolds.</a> Breast Cancer Research. 18 (1), 1-13 (2016).</li><li>Richert, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+atlas+of+mouse+mammary+gland+development.">An atlas of mouse mammary gland development.</a> Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasia. 5 (2), 227-241 (2000).</li><li>Maier, P., Hartmann, L., Wenz, F., Herskind, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+pathways+in+response+to+ionizing+radiation+and+their+targetability+for+tumor+radiosensitization.">Cellular pathways in response to ionizing radiation and their targetability for tumor radiosensitization.</a> International Journal of Molecular Sciences. 17 (1), (2016).</li><li>LaBarge, M. A., Garbe, J. C., Stampfer, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Processing+of+Human+Reduction+Mammoplasty+and+Mastectomy+Tissues+for+Cell+Culture.">Processing of Human Reduction Mammoplasty and Mastectomy Tissues for Cell Culture.</a> Journal of Visualized Experiments. (71), (2013).</li><li>Campbell, J. J., Botos, L. A., Sargeant, T. J., Davidenko, N., Cameron, R. E., Watson, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+3-D+in+vitro+co-culture+model+of+mammary+gland+involution.">A 3-D in vitro co-culture model of mammary gland involution.</a> Integrative Biology (United Kingdom). 6, 618-626 (2014).</li><li>Chanson, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-organization+is+a+dynamic+and+lineage-intrinsic+property+of+mammary+epithelial+cells.">Self-organization is a dynamic and lineage-intrinsic property of mammary epithelial cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 14 (7), 2293-2306 (2011).</li><li>Chua, A. C. L., Hodson, L. J., Moldenhauer, L. M., Robertson, S. A., Ingman, W. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+roles+for+macrophages+in+ovarian+cycle-associated+development+and+remodelling+of+the+mammary+gland+epithelium.">Dual roles for macrophages in ovarian cycle-associated development and remodelling of the mammary gland epithelium.</a> Development. 137, 4229-4238 (2010).</li><li>Gregoire, F. M., Smas, C. M., Sul, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+Adipocyte+Differentiation.">Understanding Adipocyte Differentiation.</a> Physiological Reviews. 78 (3), 783-809 (1998).</li><li>Scott, M. A., Nguyen, V. T., Levi, B., James, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+Methods+of+Adipogenic+Differentiation+of+Mesenchymal+Stem+Cells.">Current Methods of Adipogenic Differentiation of Mesenchymal Stem Cells.</a> Stem Cells and Development. 20 (10), 1793-1804 (2011).</li><li>Gabry&#347;, D., Greco, O., Patel, G., Prise, K. M., Tozer, G. M., Kanthou, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Radiation+Effects+on+the+Cytoskeleton+of+Endothelial+Cells+and+Endothelial+Monolayer+Permeability.">Radiation Effects on the Cytoskeleton of Endothelial Cells and Endothelial Monolayer Permeability.</a> International Journal of Radiation Oncology, Biology, Physics. 69 (5), 1553-1562 (2007).</li><li>Ewald, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Practical+considerations+for+long-term+time-lapse+imaging+of+epithelial+morphogenesis+in+three-dimensional+organotypic+cultures.">Practical considerations for long-term time-lapse imaging of epithelial morphogenesis in three-dimensional organotypic cultures.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 8, 100-117 (2013).</li><li>Zhang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high+M1/M2+ratio+of+tumor-associated+macrophages+is+associated+with+extended+survival+in+ovarian+cancer+patients.">A high M1/M2 ratio of tumor-associated macrophages is associated with extended survival in ovarian cancer patients.</a> Journal of Ovarian Research. 7 (1), 1-16 (2014).</li><li>Ma, J., Liu, L., Che, G., Yu, N., Dai, F., You, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+M1+form+of+tumor-associated+macrophages+in+non-small+cell+lung+cancer+is+positively+associated+with+survival+time.">The M1 form of tumor-associated macrophages in non-small cell lung cancer is positively associated with survival time.</a> BioMed Central Cancer. 10, 112 (2010).</li></ol>

في هذا البروتوكول ، قمنا بتطوير طريقه لنمو وتوصيف الغدد الثديية المشعة التي يمكن استنساخها (الشكل 1). تم تطبيق جرعه التشعيع من 20 غراي لتعكس السابقة في نماذج الجسم الخارجي من الخلايا السرطانية التوظيف5. تشعيع الغدد الثديية السابقة الجسم العضوي قبل تشكيل organoid يس?...

حوالي 60 ٪ من المرضي سرطان الثدي الثلاثي السلبية (TNBC) اختيار العلاج الحفاظ علي الثدي (BCT) كشكل من اشكال العلاج1. في هذه الطريقة العلاج ، يتم أزاله الورم الذي يحتوي علي جزء من انسجه الثدي ، ويتعرض الانسجه الطبيعية المحيطة للإشعاع المؤين لقتل اي خلايا الورم المتبقية. العلاج يقلل من تكرار في الكثير من السكان سرطان الثدي. ومع ذلك ، ما يقرب من 13.5 ٪ من المرضي المعالجين مع TNBC تجربه التكرارات الاقليميه2. ولذلك ، فان دراسة كيفيه توظيف الإشعاع الخلايا السرطانية المتداولة (ctcs) سوف يؤدي إلى رؤى هامه في تكرار المحلية3،4.
وقد أظهرت الاعمال السابقة ان الإشعاع من الانسجه الطبيعية يزيد من توظيف أنواع مختلفه من الخلايا5. في نماذج ما قبل السريرية من TNBC ، والتشعيع من الانسجه الطبيعية زيادة الضامة وبعد ذلك الورم الخلايا التوظيف إلى الانسجه الطبيعية5. وقد أثرت حاله المناعة علي تجنيد الخلايا السرطانية في المواقع المشعة ، مع ملاحظه هجره الخلايا السرطانية في المواد المناعية. تلخيص هذه التفاعلات باستخدام organoids المستمدة من الغدد الثديية سوف تسمح بمراقبه هجره الخلايا والتفاعلات الخلوية في الوقت الحقيقي مع المجهر والتصوير الخلوي الحي لتحديد دور الضرر الإشعاعي في تغيير سلوك الخلايا السرطانية.
ساعدت الغدد الثديية الماوس توضيح الخطوات الرئيسية في تطوير الغدة الثديية. و organoid الثديية هي متعددة الخلايا ، وبناء ثلاثي الابعاد من ظهاره الثديية المعزولة التي هي أكبر من 50 μm6، 7،8،9،10. باستخدام العضوية الظهاريه الاوليه ، Simian وآخرون تقييم العوامل اللازمة لتفريع في الغدة الثديية7. اكتشف شامير وآخرون ان النشر يمكن ان يحدث دون ظهاره للانتقال المستوي ، وتوفير نظره ثاقبه علي تتالي المنتشر8. طرق لتوليد وتوصيف العضوية من انسجه الغدد الثديية راسخة6,11,12,13. ومع ذلك ، علي حد علمنا ، لم يتم الإبلاغ عن أساليب لزراعه العضوية المشعة من الغدد الثديية. ومن شان وضع بروتوكول لزراعه وتوصيف الخلايا العضوية المشعة ان يكون خطوه حاسمه في تلخيص المناعة المستحثة بالإشعاع والتجنيد في الخلية السرطانية.
في هذه الورقة ، ونحن الإبلاغ عن طريقه لزراعه وتوصيف المشعة الثديية الظهاريه العضوية في الصفائح الدقيقة التصاق منخفضه المغلفة مع البوليمر ماء التي تدعم تشكيل خزان. وكانت هذه العضوية المستزرعة مع الضامة لفحص حركيه تسلل الخلايا المناعية. ويمكن توسيع هذا العمل لتشمل المشاركة في زراعه العضوية مع الخلايا الدهنية لتلخيص الخصائص الثديية, خلايا سرطان الثدي لتصور تجنيد الخلايا السرطانية, وخلايا CD8 + T لدراسة التفاعلات الخلايا المناعية الورم. ويمكن استخدام البروتوكولات المنشاة سابقا لتقييم العضوية المشعة. وقد سلطت النماذج السابقة المشاركة في التشكيل العضوي الثديي والخلايا المناعية الضوء علي أليات الانبثاث والنشر. وقد وجدت DeNardo وآخرون ان التنظيم الخلية الخلايا التائية + T من الضامة المرتبطة الورم تعزيز النمط الظاهري المنتشر من الأورام اللحمية الثديية14. كما استخدمت نماذج الثقافة المشتركة لتوضيح أليات التنمية البيولوجية. Plaks et al. أوضح دور الخلايا التائية + T كما أسفل المنظمين من العضوي الثديية15. ومع ذلك ، فان مجموعتنا هي أول من يؤسس اجراء لتصور كيف يؤثر تشعيع الانسجه الطبيعية علي سلوك الخلايا المناعية. لأنه قد ثبت تشعيع الانسجه العادية لتعزيز تجنيد الخلايا السرطانية5، يمكن تطوير هذا البروتوكول لتحليل كيفيه تغيير سلوك الخلايا السرطانية عن طريق تشعيع الانسجه الطبيعية والخلايا ، مما يؤدي إلى فهم أكبر تكرار السرطان.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>10% Neutral Buffered Formalin</td>
			<td>VWR</td>
			<td>16004-128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-cytokeratin 14</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab181595</td>
			<td>Lot: GR3200524-3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A1933-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen Type I</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase from Clostridium Histolyticum, Type VIII</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C2139</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase I</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17018029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>11320-033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAse</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10104159001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>14190250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E-Cadherin</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>24E10</td>
			<td>Lot: 13</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F0926</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit secondary</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab150077</td>
			<td>green 
			Lot: GR3203000-1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit secondary</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab150080</td>
			<td>red 
			Lot: GR3192711-1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>62249</td>
			<td>Lot: TG2611041</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin (10 mg/mL)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I9278</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin-Transferrin-Selenium, 100x</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>51500-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel Basement Membrane (basement membrane extracted from Engelbreth-Holm-Swarm mouse sarcoma)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356237</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Goat Serum</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>S-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclon Sphera 96 well plates</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>174927</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10128-856</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen/strep</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phalloidin</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab176757</td>
			<td>Lot: GR3214582-16</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tight Junction Protein 1</td>
			<td>Novus</td>
			<td>NBP1-85047</td>
			<td>Lot: C115428</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100 (4-(1,1,3,3-Tetramethylbutyl)phenyl-polyethylene glycol)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>X100-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>27250-018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20 (Polyethylene glycol sorbitan monolaurate)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1379-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

growth and characterization of irradiated organoids from mammary glands

العضوية المشتقة من الانسجه المهضومة هي بني متعددة الخلايا ثلاثية الابعاد (3D) التي تلخص أفضل في ظروف الجسم الخلوي من أحاديه الخلية. علي الرغم من انها لا يمكن ان نموذج تماما في تعقيد المجرية ، فانها تحتفظ ببعض وظائف الجهاز الأصلي. في نماذج السرطان ، وتستخدم عاده organoids لدراسة الورم الخلية الغزو. يهدف هذا البروتوكول إلى تطوير وتوصيف الخلايا العضوية من انسجه الغدد الثديية العادية والمشعة للماوس لتقييم الاستجابة الاشعاعيه في الانسجه الطبيعية. هذه العضوية يمكن تطبيقها علي دراسات السرطان في المستقبل في المختبر لتقييم تفاعلات الخلايا السرطانية مع العضوي المشع. تم تقسيم الغدد الثديية ، المشع إلى 20 غراي وهضمها في محلول الثامن كولاجيناز. تم فصل العضوية الظهاريه عن طريق التمايز الطرد المركزي ، ووضعت العضوية الثلاثية الابعاد في الصفائح الدقيقة المنخفضة التصاق 96-حسنا. وأعرب organoids علامة ظهاري مميزه سيتوكيراتين 14. لوحظ تفاعل الضامة مع الهيكل العضوي في التجارب المشتركة في الثقافة. قد يكون هذا النموذج مفيدا لدراسة التفاعلات بين الأورام ، وتسلل الخلايا المناعية ، والاستقطاب الضام داخل بيئة مجهريه مشعة.

تم الحصول بنجاح المشعة الظهاريه الثديية الثدي من الغدد الثديية الماوس ، معالجتها ، ومثقف علي لوحات التصاق منخفضه (الشكل 1). تم اختبار الغلة organoid من قبل البذر في بيئات النمو المختلفة (الشكل 2A-G). خلايا البذر مباشره علي ثقافة الانسجه تعامل 10 سم لوحات الخلية أسفرت عن فر?...

Watch this Scientific Journal Video about Growth and Characterization of Irradiated Organoids from Mammary Glands at JoVE.com

Growth and Characterization of Irradiated Organoids from Mammary Glands

تم المشعة التي وضعت من الغدد الثديية الماوس وتتميز لتقييم الصفات الظهاريه والتفاعلات مع الخلايا المناعية. يمكن استخدام العضوية المشعة لتحسين تقييم تفاعلات خلايا الخلايا التي قد تؤدي إلى تجنيد الخلايا السرطانية في الانسجه الطبيعية المشعة.

نمو وتوصيف العضوية المشعة من الغدد الثديية

Organoids derived from the digested tissue are multicellular three-dimensional (3D) constructs that better recapitulate in vivo conditions than cell ...

يمكن استخدام هذا البروتوكول وتطويره لتحليل كيفية تأثير الإشعاع المؤين على تجنيد خلايا الورم ، مما يؤدي إلى فهم أكبر لتكرار الإصابة بالسرطان. الأعضاء الثديية هي نماذج قوية. أنها تحاكي الأساسية في خصائص الجسم الحي، لكنها تسمح لعزل سهل من المتغيرات البيولوجية.إن استخدام لوحات الالتصاق المنخفض ينفي تحديات تدفق العمل المرتبطة بمصفوفات البروتين. يتعرض مرضى سرطان الثدي الثلاثي السلبية لتكرار إقليمي محلي بمعدلات أعلى بعد العلاج. دراسة كيفية تأثير الإشعاع على سلوك الورم والخلايا المناعية سيؤدي إلى رؤى مهمة في آليات التكرار.مما يدل على المجهر confocal من organoids هو خافيير غوميز ، وهو طالب دراسات عليا في مختبر سيلفرا باتيستا. ابدأ هذا الإجراء بإزالة الغدد الثديية البطنية والأربية من الفئران التي تم التضحية بها كما هو مفصل في بروتوكول النص. بعد 45 دقيقة من تشعيع العينات كما هو موضح في بروتوكول النص ، ضع الغدد الثديية في لوحة خلية معقم ة 35 ملليمترًا ودقائق مع مشرط.المفروم مع ما يقرب من 40 السكتات الدماغية حتى يرتاح الأنسجة ويتم الحصول على القطع التي لا تزيد عن ما يقرب من ملليمتر مربع واحد في المنطقة. الآن نقل الأنسجة إلى حل الكولاجيناز في أنبوب جهاز طرد مركزي 50 ملليلتر. استخدام 10 ملليلتر من حل الكولاجيناز لكل ماوس.ضع أنابيب العينة في حمام مائي لمدة 30 إلى 60 دقيقة عند درجة حرارة 37 درجة مئوية، ودوامة لمدة خمس ثوان كل 10 دقائق. عملية الهضم كاملة عندما يكون محلول الكولاجين غائماً. تدور أسفل المحلل المهضم في 450 مرات-G لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.الآن ثلاث طبقات لوحظت. ويتألف من الدهون الفائقة ، وطبقة الأوسط هو محلول مائي ، والجزء السفلي هو بيليه. بيليه يظهر الأحمر, كما هو خليط من الخلايا الظهارية, الخلايا السحيق الفردية, وخلايا الدم الحمراء.قبل معطف جميع الماصات، نصائح الماصات، وأنابيب الطرد المركزي مع حل BSA قبل الاتصال عن طريق إضافة وإزالة حل BSA. يمكن إعادة استخدام حل BSA، على الرغم من أنه يجب أن تكون معقم-تصفية قبل كل تجربة. للحصول على استرداد إضافي، نقل المابير إلى أنبوب جديد مغلفة BSA 15 ملليلتر.الماصات صعودا وهبوطا بقوة لتفريق طبقة الدهون. الطرد المركزي العينة في 450 مرات-G لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. التعرق على المابير، وترك كمية صغيرة من وسائل الإعلام في أنبوب لتجنب التعرق بيليه الخلية.الآن pirate طبقة مائي من الأنبوب مع بيليه الأصلي. إضافة 10 ملليلتر من DMEM/F12 إلى أنبوب مع بيليه الأصلي، ونقلها إلى أنبوب الثاني. Pipette بقوة للجمع بين وإعادة تعليق الكريات اثنين.بعد الطرد المركزي في 450 مرات-G لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة، pirate عظمى وإضافة أربعة ملليلتر من DMEM/F12 إلى الأنبوب. إضافة 40 ميكرولترات من deoxyribonuclease إلى التعليق ويصافح بلطف باليد لمدة دقيقتين إلى خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. إضافة ستة ملليلتر من DMEM/F12 والماصات بدقة.بعد الطرد المركزي للأنبوب في 450 مرات-G لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة، يُشعّر المُنطَع إلى علامة 0.5 ملليلتر. Resuspend بيليه في 10 ملليلتر من DMEM/F12 وماصة تماما. الآن الطرد المركزي الأنبوب عن طريق النبض إلى 450 مرات-G ووقف أربع ثوان بعد الوصول إلى تلك السرعة.كرر خطوات الغسيل ثلاث مرات أخرى لتنقية الأعضاء عن طريق التمايز الطرد المركزي. يجب أن يكون بيليه الآن لون أبيض يتكون من الأعضاء الظهارية فقط. resuspend بيليه في 10 ملليلتر من DMEM/F12.الماصات تماما لخلق حل متجانس. نقل 50 ميكروليتر إلى طبق بيتري 30 ملليمتر وعرض تحت مجهر على النقيض من المرحلة في 20X. عد عدد الأعضاء مع عداد حصيلة.ماصة 50 ميكرولترات من الأعضاء في كل بئر من لوحة التصاق منخفضة. إضافة 150 ميكرولترات من المتوسطة العضوية لتحقيق حجم العمل الكلي إلى 200 ميكرولترات. استبدال بعناية المتوسطة كل يومين.الحفاظ على GFP أو D-الطماطم المسمى الخام 264.7 الضامة في وسائل الإعلام DMEM تكملها 10٪ FPS و 1٪ البنسلين-الستريبتومايسين. بذور الخلايا في وسط organoid في الكثافة المطلوبة. استخدم تباين طور الخلية الحية والتصوير الفلوري لمراقبة تسرب الضامة بمرور الوقت.إزالة المتوسطة العضوية من الآبار عن طريق التعرق بعناية. إصلاح العينات مع 10٪ محايد-bufferin لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. غسل الأعضاء الثابتة ثلاث مرات لمدة خمس دقائق في 1X PBS.إذا رغبت في ذلك، يمكن تخزين عينات ثابتة في أربع درجات مئوية لمدة أسبوع واحد لمزيد من تلطيخ. بعد الغسيل، قم بإضفاء الطابع العضي الثابت لمدة خمس دقائق. كتلة الأعضاء الثابتة مع مصل الماعز العادي 5٪ في 0.1٪ PBST لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة قبل الغسيل ثلاث مرات لمدة خمس دقائق مع برنامج تلفزيوني.احتضان الأعضاء الثابتة مع مضادة للcytokeratin-14، E-cadherin، أو ضيق وصلة البروتين واحد، في 1٪ NGS في PBST لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. ثم يغسل ثلاث مرات لمدة خمس دقائق في PBST. الآن احتضان organoids مع الماعز المضادة للأرانب الثانوية مع 1٪ NGS PBST لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة.تغطية مع احباط لتجنب التعرض للضوء. بعد الغسيل كما كان من قبل، استخدم الصبغة النووية صبغة نوى لمدة نصف ساعة تقريبا. اغسل العضية الملطخة لمدة خمس دقائق في برنامج تلفزيوني ثلاث مرات.إذا كنت تستخدم شريحة غرفة، قم بتحميلها بقسيمة أغطية. تخزين organoids ملفوفة في احباط في أربع درجات مئوية لمدة تصل إلى أسبوعين. يمكن استزراع العضيات المشعة في لوحات منخفضة التصاق، أو داخل غشاء الطابق السفلي، ولكن النمو الأكثر سرعة حدث في لوحات التصاق منخفض.العضوية خلاصة خصائص الغدة الثديية. وقد لوحظت التشييدات التي تشبه شكلياً القنوات والفصوص. وأشارت اتجاهات النمو إلى أنه عندما تم زرع الأعضاء على الفور بعد الهضم والفرز ، نمت الأعضاء غير المشععة أسرع من organoids المشعة ، على الأرجح بسبب توقف نمو الخلايا الناتجة عن آليات إصلاح تلف الحمض النووي.وأعرب الجهاز العضوي عن الخصائص الظهارية، التي تم تقييمها من خلال تلطيخ الفلورسنت المناعية. عبّر أعضاء مشعّ علامات ظهاريّة. Cytokeratin-14، علامة من ميوبيبيليس، وأعرب بقوة على سطح organoids المشعة.بالإضافة إلى ذلك، E-cadherin و ضيقة تقاطع البروتين واحد تم التعبير عنها داخل تقاطعات الخلوية من organoids. هذه البروتينات ضرورية للتصاق الخلايا المناسبة. بعد التشعيع، واصلت organoids للحفاظ على خصائصها الظهارية.يمكن تصور تلطيخ الفلورسنت من organoids داخل لوحات التصاق منخفضة باستخدام المجهر الفلوريس. ومع ذلك، تم الحصول على أوضح تصور عن طريق المجهر confocal. تم حساب كثافة الفلورساح الإجمالية المصححة عن طريق طرح الخلفية، والتطبيع حسب منطقة الجهاز.كما أن زراعة الأعضاء في لوحات الالتصاق المنخفض 96 بئرًا قد ابسطت أيضًا تجارب الثقافة المشتركة. عندما بذرت في تركيزات نموذجية في الغدة الثديية، الضامة التكلس زيادة مع organoids المشعع. عند تنفيذ هذا الإجراء ، فإن أهم الأشياء التي يجب تذكرها هي عدم الإفراط في هضم الأعضاء ، وتنقية التمايز الطرد المركزي بشكل مناسب.بعد هذا الإجراء، يمكن إجراء تجارب إضافية المشتركة الثقافة. يمكن أن تكون organoids شارك في زراعة مع الخلايا السرطانية, الخلايا المناعية الأخرى, والخلايا القوية لإعادة البيئة microendated المشعة المرتبطة تكرار. هذه الطريقة ستكون مهمة لتقييم كيفية تلف الأنسجة الطبيعية يؤثر على وجه التحديد ديناميات الخلايا المناعية, وسوف تستخدم في نهاية المطاف لفهم آليات تجنيد الخلايا السرطانية.وقد أوضح organoids mammary آليات تنمية الغدة الثديية، ولها خلاصة قوية سرطان الثدي في المختبر. نأمل أن نموذجنا يوفر رؤى حول تجنيد الخلايا السرطانية الناجمة عن الإشعاع.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Axon Stretch Growth: The Mechanotransduction of Neuronal Growth

محوار النمو الإمتداد : إن Mechanotransduction من نمو الخلايا العصبية

During pre-synaptic embryonic development, neuronal processes traverse short distances to reach their targets via growth cone. Over time, neuronal somata ...

Generation and Recovery of &beta;-cell Spheroids From Step-growth PEG-peptide Hydrogels

Generation and Recovery of ÃƒÅ½Ã‚Â²-cell Spheroids From Step-growth PEG-peptide Hydrogels

جيل واسترداد خلايا β الأجسام الشبه الكروية من الهلاميات المائية PEG-الببتيد الخطوة النمو

Hydrogels are hydrophilic crosslinked polymers that provide a three-dimensional  microenvironment with tissue-like elasticity and high permeability for  ...

A Hormone-responsive 3D Culture Model of the Human Mammary Gland Epithelium

نموذج الثقافة 3D-الهرمون تستجيب للالغدة الثديية الظهارة الإنسان

The process of mammary epithelial morphogenesis is influenced by hormones. The study of hormone action on the breast epithelium using 2D cultures is ...

Intraductal Delivery to the Rabbit Mammary Gland

تسليم ينترادوكتال إلى الأرنب الغدة الثديية

Localized intraductal treatments for breast cancer offer potential advantages, including efficient delivery to the tumor and reduced systemic toxicity and ...

Preparation and Characterization of Novel HDL-mimicking Nanoparticles for Nerve Growth Factor Encapsulation

إعداد وتوصيف رواية هدل-محاكاة الجسيمات النانوية لتغليف عامل النمو العصبي

The objective of this article is to introduce preparation and characterization methods for nerve growth factor (NGF)-loaded, high-density, lipoprotein ...

Microfluidic Bioprinting for Engineering Vascularized Tissues and Organoids

فاسكولاريزيد بيوبرينتينج موائع جزيئية لهندسة الأنسجة وأورجانويدس

Engineering vascularized tissue constructs and organoids has been historically challenging. Here we describe a novel method based on microfluidic ...

Fabrication and Characterization of Optical Tissue Phantoms Containing Macrostructure

تصنيع وتوصيف أشباح الأنسجة البصرية التي تتضمن حداتها

The rapid development of new optical imaging techniques is dependent on the availability of low-cost, customizable, and easily reproducible standards. By ...

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) Assays

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate LAL Assays

كشف الذيفان في تركيبات النانو باستخدام فحوصات ليستي (ال) أموبوسيتي ليمولوس

When present in pharmaceutical products, a Gram-negative bacterial cell wall component endotoxin (often also called lipopolysaccharide) can cause ...

Focused Ion Beam Lithography to Etch Nano-architectures into Microelectrodes

تخطيط الاشعه الايونيه المركزة لحفر نانو-البنيات في ميكرواقطاب

With advances in electronics and fabrication technology, intracortical microelectrodes have undergone substantial improvements enabling the production of ...

Scalable Generation of Mature Cerebellar Organoids from Human Pluripotent Stem Cells and Characterization by Immunostaining

التوليد القابل للتحجيم من العضيات الدماغية الناضجة من الخلايا الجذعية البشرية المتعددة القدرات والتوصيف عن طريق المناعة

The cerebellum plays a critical role in the maintenance of balance and motor coordination, and a functional defect in different cerebellar neurons can ...